Plaquing es un método de rutina utilizado para cuantificar virus vivos en una población. Aunque el plaquing se enseña con frecuencia en varios currículos de microbiología con bacterias y bacteriófagos, el plaquing de virus de mamíferos es más complejo y requiere más tiempo. Este protocolo describe los procedimientos que funcionan de manera confiable para el trabajo regular con virus del herpes simple.
Existen numerosos protocolos publicados para detectar virus, incluidas referencias dentro de la literatura primaria para la metodología. Sin embargo, la detección de virus puede ser difícil de realizar, lo que requiere centrarse en sus especificaciones y refinamiento. Es un método increíblemente desafiante para que los nuevos estudiantes lo dominen, principalmente porque requiere una atención meticulosa a los detalles más minuciosos. Esta demostración de plagar los virus del herpes simple debería ayudar a aquellos que han luchado con la visualización del método, especialmente sus matices, a lo largo de los años. Si bien este manuscrito se basa en los mismos principios de la metodología estándar de plaquing, difiere en que contiene una descripción detallada de (1) la mejor manera de manejar las células huésped para evitar interrupciones durante el proceso, (2) un medio viscoso más útil que la agarosa para limitar la difusión de viriones, y (3) un procedimiento simple de fijación y tinción que produce resultados reproducibles de manera confiable. Además, el video que lo acompaña ayuda a demostrar las distinciones más finas en el proceso, que con frecuencia se pasan por alto cuando se instruye a otros sobre la realización de ensayos de placa.
Los inicios de los ensayos de placa viral se remontan a los primeros descubrimientos de virus en la década de 18901. El virus del mosaico del tabaco se aisló por primera vez y se transmitió a las hojas de tabaco, donde las manchas individuales de infección pudieron reconocerse y cuantificarse como originarias de una sola entidad de virus viva2, más tarde identificada como un virión2. Estudios seminales posteriores con bacterias y bacteriófagos perfeccionaron las técnicas utilizadas para placar estos virus, incluidas las bacterias en la fase media del crecimiento, la dilución en serie de muestras de bacteriófagos y el agar superior con la posterior visualización de agujeros literales (llamadas placas) en el césped bacteriano3.
La detección de virus animales retrasó la emocionante investigación que se estaba llevando a cabo con bacteriófagos, principalmente porque los métodos requeridos para cultivar células de mamíferos en cultivo no se desarrollaron hasta la década de 19404. Sin embargo, el advenimiento del crecimiento de células murinas en ausencia de todo el organismo huésped4 generó una nueva era en la capacidad de cultivar y contar virus. Dicho trabajo se amplió para la propagación y cuantificación del virus de la encefalomielitis equina occidental en células de pollo y poliovirus en células humanas5,6. A medida que el reino de las células de mamíferos cultivables se expandió, el grupo de diferentes células huésped para diversas infecciones virales le dio al mundo una cornucopia de posibilidades para estudiar todo tipo de virus7. Esto incluyó la propagación y cuantificación de herpesvirus humanos, particularmente virus del herpes simple-1 (HSV-1) y -2 (HSV-2), que causan lesiones mucocutáneas8. Es importante destacar que todos los ensayos de placa dependen de la existencia de viriones vivos, que pueden ingresar a las células huésped de manera mediada por receptores en una muestra9. Independientemente de la ubicuidad y la multitud de publicaciones sobre la ejecución de ensayos de placa5,10,11,12,13,14,15,16, estos métodos para HSV-1/-2 son una mezcla de arte y ciencia; no se puede llevar a cabo el ensayo sin la debida atención a cada detalle en el protocolo, ni se puede ejecutar un ensayo exitoso sin un ojo crticial para la sutileza en el proceso. Este manuscrito describe uno de los métodos reproducibles más consistentemente para los ensayos de placa HSV-1/-2, con detalles precisos hacia el arte del ensayo que rara vez se discuten.
Este protocolo actual obtiene recuentos de unidades formadoras de placa viva (PFU) para HSV-1 y -2 de manera confiable. Los mejores resultados se obtienen utilizando células Vero (células epiteliales de riñón de mono verde africano transformadas) a paso bajo (por debajo del número de paso 155) y cultivadas rutinariamente en alfa-MEM17 suplementadas con 10% de suero fetal de ternero (FCS), L-alanil-L-glutamina y una mezcla antibiótica/antimicótica18. Las células Vero se propagan estándarmente en este medio dos o tres veces por semana a una dilución de 1/5 cada vez.
Si bien los ensayos de placa son casi tan antiguos como el propio cultivo celular de mamíferos, parece que cada laboratorio tiene su propio conjunto de protocolos para ejecutar este ensayo básico5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 </s…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a innumerables estudiantes en nuestros laboratorios (PJD y BJM) que han trabajado con nosotros a lo largo de los años refinando estos métodos. Un agradecimiento especial a Stan Person, bajo cuya tutela se desarrolló por primera vez esta metodología. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el fondo de apoyo a la investigación de pregrado fisher College of Science and Math de la Universidad de Towson y la subvención NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud.
12-well plates | Corning | 3512 | |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
DMEM | Gibco | 11965092 | |
Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
Vero cells | ATCC | CCL-81 |