Summary

הדמיה של מיקרוטובול פלוס-אנד דיינמיקס במודל מחלת הנטינגטון המבוססת על פיברובלסטים של העור העיקרי האנושי

Published: January 08, 2022
doi:

Summary

פרוטוקול זה מוקדש להדמיה של מיקרוטובול פלוס-קצה על ידי טרנספקטציה של חלבון EB3 כדי לחקור את התכונות הדינמיות שלהם בתרבית התאים העיקרית. הפרוטוקול יושם על פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהתקבלו מחולים במחלת הנטינגטון.

Abstract

טרנספקטיון עם חלבון סמן שכותרתו פלואורסצנטית של עניין בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן היא שיטה קלאסית של לימוד המאפיינים הדינמיים של ציטוסקלטון. פרוטוקול זה מציע טכניקה עבור טרנספקט פיברובלסט ראשוני אנושי, אשר יכול להיות קשה בגלל הפרטים של תנאי טיפוח התא העיקריים. בנוסף, תחזוקת הנכס הדינמי של ציטוסקלטון דורשת רמה נמוכה של טרנספקטציה כדי להשיג יחס אות לרעש טוב מבלי לגרום לייצוב מיקרוטובול. חשוב לנקוט באמצעים כדי להגן על התאים מפני מתח המושרה באור ודחיכת צבע פלואורסצנטי. במהלך עבודתנו, בדקנו שיטות ופרוטוקולים שונים של טרנספקטיישן, כמו גם וקטורים שונים כדי לבחור את השילוב הטוב ביותר של תנאים המתאימים למחקרי פיברובלסט ראשוניים אנושיים. ניתחנו את הסרטונים שהתקבלו בזמן וחישוב דינמיקת המיקרו-קוטביות באמצעות ImageJ. הדינמיקה של המיקרוטובולים בחלקי התא השונים אינה דומה, ולכן חילקנו את הניתוח לתת-קבוצות – אזור המרכז, הלאמלה וזנב הפיברובלסטים. ראוי לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח במבחנה של דינמיקת cytoskeleton בדגימות המטופל, המאפשר את הצעד הבא לקראת הבנת הדינמיקה של התפתחות המחלה השונה.

Introduction

מחלת הנטינגטון (HD) היא פתולוגיה נוירודגנרטיבית חשוכת מרפא הנגרמת על ידי חלבון קידוד גן מוטציה (HTT). HTT קשורה בעיקר עם שלל ומיקרוטובולות והוא מעורב כנראה בתהליכי הובלה תלויי מיקרוטובול1,2. כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה HTT על דינמיקת microtubule, השתמשנו בהדמיה חוץ גופית של חלבון EB3, המווסת את המאפיינים הדינמיים של microtubules על ידי כריכה וייצוב הפלוס-קצוות הגדלים. כדי לטעון פלואורסצנטית שכותרתו EB3 לתוך פיברובלסטים בעור אנושי, transfection plasmid הוחל. השתמשנו בתרבות הפיברובלסט העיקרית שהתקבלה מהביופסיה של העור של חולי HD למחקר זה.

המוטציה בגן חלבון HTT מובילה להארכה של דרכי פוליגלוטמין3. HTT יש תפקיד בתהליכים תאיים כגון אנדוציטוזיס4, הובלת תאים1,2, השפלת חלבון5,וכו ‘. חלק ניכר מהתהליכים הללו כרוך באלמנטים שונים של ציטוסקלטון התא, כולל המיקרוטובולות.

תאים ראשוניים אנושיים הם המודל הטוב ביותר לשחזור אירועים המתרחשים בתאי המטופל קרוב ככל האפשר. כדי ליצור מודלים כאלה, יש לבודד תאים מחומר ביופסיה אנושי (למשל, מדגימות כירורגיות). קו התאים העיקרי המתקבל מתאים לחקר פתוגנזה בשיטות ביולוגיות גנטיות, ביוכימיות, מולקולריות ותאיות שונות. כמו כן, תרביות תאים ראשוניות אנושיות משמשות מבשר ליצירת תרבויות שונות transdifferentiated ומהונדס6.

עם זאת, בניגוד תרביות תאים מונצחות, החיסרון המשמעותי של תאים ראשוניים הוא יכולת המעבר המוגבלת שלהם. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתאים בשלב המעברים המוקדמים (עד 15). תרבויות ישנות יותר מתנוונות מהר מאוד, מאבדות את תכונותיהן הייחודיות. לכן, התאים העיקריים שהושגו לאחרונה צריכים להישמר קפואים לאחסון לטווח ארוך.

תרביות התאים העיקריות רגישות לתנאי הטיפוח. לכן, לעתים קרובות הם דורשים גישות ייחודיות ואופטימיזציה של תנאי הגידול. בפרט, הפיברובלסטים העיקריים של העור האנושי המשמשים בניסויים שלנו תובעניים על המצע. לפיכך, השתמשנו בציפויים נוספים שונים (למשל, ג’לטין או פיברונקטין) בהתאם לסוג הניסוי.

ציטוסקלטון התא קובע את צורת התא, הניידות והקטר. הדינמיקה של הציטוסקלטון חיונית לתהליכים תאיים רבים הן באינטרפאזה והן במיטוזה. בפרט, הציטוסקלטון פולימר מ טובולין, הם מבנים דינמיים מאוד קוטביים, המאפשרים תחבורה תאית מכוונת בתיווך חלבון מוטורי. קצות המיקרוטובולות נמצאים בסידור מחדש מתמיד, שלבי ההרכבה שלהם מתחלפים עם שלבי הפירוק, והתנהגות זו נקראת “חוסר יציבות דינמית”7,8,9. חלבונים שונים הקשורים לשנות את שיווי המשקל של תגובת פילמור, המוביל או היווצרות פולימר או היווצרות מונומר חלבון. התוספת של subunits טובולין מתרחשת בעיקר בקצה פלוס של microtubules10. משפחת החלבונים המחייבים את הקצה (EB) מורכבת משלושה חברים: EB1, EB2 ו-EB3. הם משמשים חלבונים במעקב אחר קצה פלוס (+TIPs) ומווסתים את המאפיינים הדינמיים של מיקרוטובולות על ידי כריכה וייצוב הגדילה שלהם פלוס-קצוות11.

מחקרים רבים משתמשים במיקרו-אינטרינג’קציה או טרנס-מולקולה של טובולין עם הדמיה בזמן וניתוח וידאו כדי לדמיין מיקרוטובולות במבחנה. שיטות אלה עלולות להיות פולשניות ומזיקות לתאים, במיוחד לתאים אנושיים ראשוניים. הצעד המאתגר ביותר הוא למצוא תנאים להדבקה בתאים. ניסינו להגיע לרמה הגבוהה ביותר האפשרית של טרנס-זיהום מבלי להשפיע על הכדאיות ועל מורפולוגיה של תאים מקומיים. מחקר זה מיישם את השיטה הקלאסית כדי לחקור את ההבדלים בדינמיקה microtubule בפיברובלסטים בעור של תורמים בריאים וחולים עם מחלת הנטינגטון.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של המרכז הפדרלי למחקר ולרפואה קלינית של רפואה פיזית-כימית של הסוכנות הביולוגית הרפואית הפדרלית מיום 08 בספטמבר 2015. הערה: איור 1 מספק מבט כולל על הפרוטוקול. 1. השגת תרבות עיקרית של פיברובלסטים בעור האדם (<strong cl…

Representative Results

סרטי GFP-EB3 שנוצרו באמצעות הפרוטוקול (איור 1) ממחישים את המאפיינים הדינמיים של המיקרוטובולות. מיקרוטובולות מעורבות בתהליכים שונים של תאים, ומאפייניהם הדינמיים משפיעים על מאפייני חיים שונים של תרבית התאים האנושיים העיקרית מחומר הביופסיה של המטופלים (איור 2).</…

Discussion

ניתן להשיג תוצאות באיכות טובה יותר לניתוח הדינמיקה של microtubules מתמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה. חשוב לבחון את כל התנאים הדרושים להדמיה של תאים חיים בזמן ולהתאים נכונה את פרמטרי ההדמיה. שימוש במנות מיוחדות לתרבות תאים עם תחתית זכוכית (מנות קונפוקליות) חשוב, שכן זכוכית יש אינדקס שבירה שונה …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מס ‘075-15-2019-1669 (טרנספקטים של פיברובלסטים), על ידי הקרן הרוסית למדע, מענק מס ’19-15-00425 (כל שאר העבודות על טיפוח פיברובלסטים במבחנה). זה נתמך חלקית על ידי Lomonosov מוסקבה המדינה האוניברסיטה פיתוח תוכנית PNR5.13 (הדמיה וניתוח). המחברים מכירים בתמיכת מרכז ניקון למצוינות במכון א.נ. בלוצרסקי לביולוגיה פיזיקו-כימית. אנחנו רוצים להודות במיוחד ליקטרינה טארן על עזרתה במשחק קול. המחברים מודים גם לפאבל בליצ’קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.

Materials

Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte Logos Biosystems L40002
Microscope incubator for lifetime filming Okolab Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) Open source image processing software
NIS Elements Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil) MP 151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish SPL Lifesciences 20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm) SPL Lifesciences 211350 Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube SPL Lifesciences 50015
Cryogenic Vials Corning-Costar 430659
Microcentrifuge Tube Nest 615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001
Dimethyl sulfoxide PanEko Equation 1135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) PanEko C420Equation 2
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) PanEko P060Equation 2
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin) PanEko Equation 1070
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax Gibco 519850026
Penicillin-streptomycin PanEko A063Equation 2
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova
[Erasmus University, Rotterdam]
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003

References

  1. Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
  2. Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
  3. MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington’s disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
  4. Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).
  5. Steffan, J. S., et al. The Huntington’s disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
  6. Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington’s disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  9. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
  10. Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
  11. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  12. Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
  13. O’Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
  14. Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
  15. Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
  16. Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
  17. van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  19. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
  20. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
  21. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
  22. Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).

Play Video

Cite This Article
Taran, A., Belikova (Shuvalova), L., Lavrushkina, S., Bogomazova, A., Lagarkova, M., Alieva, I. Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington’s Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (179), e62963, doi:10.3791/62963 (2022).

View Video