פרוטוקול זה מוקדש להדמיה של מיקרוטובול פלוס-קצה על ידי טרנספקטציה של חלבון EB3 כדי לחקור את התכונות הדינמיות שלהם בתרבית התאים העיקרית. הפרוטוקול יושם על פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהתקבלו מחולים במחלת הנטינגטון.
טרנספקטיון עם חלבון סמן שכותרתו פלואורסצנטית של עניין בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן היא שיטה קלאסית של לימוד המאפיינים הדינמיים של ציטוסקלטון. פרוטוקול זה מציע טכניקה עבור טרנספקט פיברובלסט ראשוני אנושי, אשר יכול להיות קשה בגלל הפרטים של תנאי טיפוח התא העיקריים. בנוסף, תחזוקת הנכס הדינמי של ציטוסקלטון דורשת רמה נמוכה של טרנספקטציה כדי להשיג יחס אות לרעש טוב מבלי לגרום לייצוב מיקרוטובול. חשוב לנקוט באמצעים כדי להגן על התאים מפני מתח המושרה באור ודחיכת צבע פלואורסצנטי. במהלך עבודתנו, בדקנו שיטות ופרוטוקולים שונים של טרנספקטיישן, כמו גם וקטורים שונים כדי לבחור את השילוב הטוב ביותר של תנאים המתאימים למחקרי פיברובלסט ראשוניים אנושיים. ניתחנו את הסרטונים שהתקבלו בזמן וחישוב דינמיקת המיקרו-קוטביות באמצעות ImageJ. הדינמיקה של המיקרוטובולים בחלקי התא השונים אינה דומה, ולכן חילקנו את הניתוח לתת-קבוצות – אזור המרכז, הלאמלה וזנב הפיברובלסטים. ראוי לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח במבחנה של דינמיקת cytoskeleton בדגימות המטופל, המאפשר את הצעד הבא לקראת הבנת הדינמיקה של התפתחות המחלה השונה.
מחלת הנטינגטון (HD) היא פתולוגיה נוירודגנרטיבית חשוכת מרפא הנגרמת על ידי חלבון קידוד גן מוטציה (HTT). HTT קשורה בעיקר עם שלל ומיקרוטובולות והוא מעורב כנראה בתהליכי הובלה תלויי מיקרוטובול1,2. כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה HTT על דינמיקת microtubule, השתמשנו בהדמיה חוץ גופית של חלבון EB3, המווסת את המאפיינים הדינמיים של microtubules על ידי כריכה וייצוב הפלוס-קצוות הגדלים. כדי לטעון פלואורסצנטית שכותרתו EB3 לתוך פיברובלסטים בעור אנושי, transfection plasmid הוחל. השתמשנו בתרבות הפיברובלסט העיקרית שהתקבלה מהביופסיה של העור של חולי HD למחקר זה.
המוטציה בגן חלבון HTT מובילה להארכה של דרכי פוליגלוטמין3. HTT יש תפקיד בתהליכים תאיים כגון אנדוציטוזיס4, הובלת תאים1,2, השפלת חלבון5,וכו ‘. חלק ניכר מהתהליכים הללו כרוך באלמנטים שונים של ציטוסקלטון התא, כולל המיקרוטובולות.
תאים ראשוניים אנושיים הם המודל הטוב ביותר לשחזור אירועים המתרחשים בתאי המטופל קרוב ככל האפשר. כדי ליצור מודלים כאלה, יש לבודד תאים מחומר ביופסיה אנושי (למשל, מדגימות כירורגיות). קו התאים העיקרי המתקבל מתאים לחקר פתוגנזה בשיטות ביולוגיות גנטיות, ביוכימיות, מולקולריות ותאיות שונות. כמו כן, תרביות תאים ראשוניות אנושיות משמשות מבשר ליצירת תרבויות שונות transdifferentiated ומהונדס6.
עם זאת, בניגוד תרביות תאים מונצחות, החיסרון המשמעותי של תאים ראשוניים הוא יכולת המעבר המוגבלת שלהם. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתאים בשלב המעברים המוקדמים (עד 15). תרבויות ישנות יותר מתנוונות מהר מאוד, מאבדות את תכונותיהן הייחודיות. לכן, התאים העיקריים שהושגו לאחרונה צריכים להישמר קפואים לאחסון לטווח ארוך.
תרביות התאים העיקריות רגישות לתנאי הטיפוח. לכן, לעתים קרובות הם דורשים גישות ייחודיות ואופטימיזציה של תנאי הגידול. בפרט, הפיברובלסטים העיקריים של העור האנושי המשמשים בניסויים שלנו תובעניים על המצע. לפיכך, השתמשנו בציפויים נוספים שונים (למשל, ג’לטין או פיברונקטין) בהתאם לסוג הניסוי.
ציטוסקלטון התא קובע את צורת התא, הניידות והקטר. הדינמיקה של הציטוסקלטון חיונית לתהליכים תאיים רבים הן באינטרפאזה והן במיטוזה. בפרט, הציטוסקלטון פולימר מ טובולין, הם מבנים דינמיים מאוד קוטביים, המאפשרים תחבורה תאית מכוונת בתיווך חלבון מוטורי. קצות המיקרוטובולות נמצאים בסידור מחדש מתמיד, שלבי ההרכבה שלהם מתחלפים עם שלבי הפירוק, והתנהגות זו נקראת “חוסר יציבות דינמית”7,8,9. חלבונים שונים הקשורים לשנות את שיווי המשקל של תגובת פילמור, המוביל או היווצרות פולימר או היווצרות מונומר חלבון. התוספת של subunits טובולין מתרחשת בעיקר בקצה פלוס של microtubules10. משפחת החלבונים המחייבים את הקצה (EB) מורכבת משלושה חברים: EB1, EB2 ו-EB3. הם משמשים חלבונים במעקב אחר קצה פלוס (+TIPs) ומווסתים את המאפיינים הדינמיים של מיקרוטובולות על ידי כריכה וייצוב הגדילה שלהם פלוס-קצוות11.
מחקרים רבים משתמשים במיקרו-אינטרינג’קציה או טרנס-מולקולה של טובולין עם הדמיה בזמן וניתוח וידאו כדי לדמיין מיקרוטובולות במבחנה. שיטות אלה עלולות להיות פולשניות ומזיקות לתאים, במיוחד לתאים אנושיים ראשוניים. הצעד המאתגר ביותר הוא למצוא תנאים להדבקה בתאים. ניסינו להגיע לרמה הגבוהה ביותר האפשרית של טרנס-זיהום מבלי להשפיע על הכדאיות ועל מורפולוגיה של תאים מקומיים. מחקר זה מיישם את השיטה הקלאסית כדי לחקור את ההבדלים בדינמיקה microtubule בפיברובלסטים בעור של תורמים בריאים וחולים עם מחלת הנטינגטון.
ניתן להשיג תוצאות באיכות טובה יותר לניתוח הדינמיקה של microtubules מתמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה. חשוב לבחון את כל התנאים הדרושים להדמיה של תאים חיים בזמן ולהתאים נכונה את פרמטרי ההדמיה. שימוש במנות מיוחדות לתרבות תאים עם תחתית זכוכית (מנות קונפוקליות) חשוב, שכן זכוכית יש אינדקס שבירה שונה …
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מס ‘075-15-2019-1669 (טרנספקטים של פיברובלסטים), על ידי הקרן הרוסית למדע, מענק מס ’19-15-00425 (כל שאר העבודות על טיפוח פיברובלסטים במבחנה). זה נתמך חלקית על ידי Lomonosov מוסקבה המדינה האוניברסיטה פיתוח תוכנית PNR5.13 (הדמיה וניתוח). המחברים מכירים בתמיכת מרכז ניקון למצוינות במכון א.נ. בלוצרסקי לביולוגיה פיזיקו-כימית. אנחנו רוצים להודות במיוחד ליקטרינה טארן על עזרתה במשחק קול. המחברים מודים גם לפאבל בליצ’קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.
Instrumentation | |||
Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
Software | |||
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
Additional reagents | |||
Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
Cell culture dish | |||
Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
Cultivation | |||
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
Dimethyl sulfoxide | PanEko | 135 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 | |
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
Transfection | |||
Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |