Summary
Questo protocollo è dedicato alla visualizzazione plus-end dei microtubuli mediante trasfezione della proteina EB3 per studiarne le proprietà dinamiche in coltura cellulare primaria. Il protocollo è stato implementato su fibroblasti cutanei primari umani ottenuti da pazienti affetti da Malattia di Huntington.
Abstract
La trasfezione con una proteina marcatore di interesse marcata fluorescente in combinazione con la videomicroscopia time-lapse è un metodo classico di studio delle proprietà dinamiche del citoscheletro. Questo protocollo offre una tecnica per la trasfezione dei fibroblasti primari umani, che può essere difficile a causa delle specifiche delle condizioni di coltivazione delle cellule primarie. Inoltre, il mantenimento della proprietà dinamica del citoscheletro richiede un basso livello di trasfezione per ottenere un buon rapporto segnale-rumore senza causare la stabilizzazione dei microtubuli. È importante adottare misure per proteggere le cellule dallo stress indotto dalla luce e dallo sbiadimento del colorante fluorescente. Nel corso del nostro lavoro, abbiamo testato diversi metodi e protocolli di trasfezione, nonché diversi vettori per selezionare la migliore combinazione di condizioni adatte per gli studi sui fibroblasti primari umani. Abbiamo analizzato i video time-lapse risultanti e calcolato le dinamiche dei microtubuli utilizzando ImageJ. La dinamica delle estremità positive dei microtubuli nelle diverse parti cellulari non è simile, quindi abbiamo diviso l'analisi in sottogruppi: la regione centrosoma, la lamella e la coda dei fibroblasti. In particolare, questo protocollo può essere utilizzato per l'analisi in vitro della dinamica del citoscheletro in campioni di pazienti, consentendo il passo successivo verso la comprensione delle dinamiche del vario sviluppo della malattia.
Introduction
La malattia di Huntington (HD) è una patologia neurodegenerativa incurabile causata da una mutazionina del gene che codifica per la proteina cacciatina (HTT). L'HTT è principalmente associata a vescicole e microtubuli ed è probabilmente coinvolta nei processi di trasporto dipendenti dai microtubuli1,2. Per studiare l'influenza dell'HTT mutante sulla dinamica dei microtubuli, abbiamo utilizzato la visualizzazione in vitro della proteina EB3, che regola le proprietà dinamiche dei microtubuli legando e stabilizzando i plus-end in crescita. Per caricare EB3 etichettato in modo fluorescente nei fibroblasti della pelle umana, è stata applicata la trasfezione del plasmide. Abbiamo utilizzato la coltura primaria di fibroblasti ottenuta dalla biopsia cutanea dei pazienti MH per questo studio.
La mutazione nel gene della proteina HTT porta all'allungamento del tratto poliglutammina3. HTT ha un ruolo in tali processi cellulari come l'endocitosi4, il trasporto cellulare1,2, la degradazione delle proteine5, ecc. Parte sostanziale di questi processi coinvolge vari elementi del citoscheletro cellulare, compresi i microtubuli.
Le cellule primarie umane sono il modello migliore per riprodurre il più fedelmente possibile gli eventi che si verificano nelle cellule dei pazienti. Per creare tali modelli, è necessario isolare le cellule dal materiale bioptico umano (ad esempio, da campioni chirurgici). La linea cellulare primaria risultante è adatta per studiare la patogenesi utilizzando vari metodi genetici, biochimici, molecolari e di biologia cellulare. Inoltre, le colture cellulari primarie umane fungono da precursore per la creazione di varie colture transdifferenziate e transgeniche6.
Tuttavia, a differenza delle colture cellulari immortalizzate, lo svantaggio significativo delle cellule primarie è la loro limitata capacità di passaggio. Pertanto, si consiglia di utilizzare le cellule nella fase dei primi passaggi (fino a 15). Le culture più vecchie degenerano molto rapidamente, perdendo le loro proprietà uniche. Pertanto, le cellule primarie appena ottenute dovrebbero essere mantenute congelate per la conservazione a lungo termine.
Le colture cellulari primarie sono suscettibili alle condizioni di coltivazione. Pertanto, spesso richiedono approcci unici e ottimizzazione delle condizioni di crescita. In particolare, i fibroblasti primari della pelle umana utilizzati nei nostri esperimenti sono esigenti sul substrato. Quindi, abbiamo usato vari rivestimenti aggiuntivi (ad esempio, gelatina o fibronectina) a seconda del tipo di esperimento.
Il citoscheletro cellulare determina la forma, la mobilità e la locomozione cellulare. La dinamica del citoscheletro è cruciale per molti processi intracellulari sia nell'interfase che nella mitosi. In particolare, il citoscheletro polimerizzato dalla tubulina, sono strutture altamente dinamiche e polari, consentendo il trasporto intracellulare diretto mediato da proteine motorie. Le estremità dei microtubuli sono in costante riarrangiamento, le loro fasi di assemblaggio si alternano alle fasi di smontaggio, e questo comportamento è chiamato "instabilità dinamica"7,8,9. Varie proteine associate spostano l'equilibrio della reazione di polimerizzazione, portando alla formazione del polimero o alla formazione del monomero proteico. L'aggiunta di subunità di tubulina avviene principalmente all'estremità superiore dei microtubuli10. La famiglia delle proteine end-binding (EB) è composta da tre membri: EB1, EB2 ed EB3. Servono come proteine plus-end-tracking (+TIP) e regolano le proprietà dinamiche dei microtubuli legando e stabilizzando i loro plus-end increscita 11.
Molti studi utilizzano la microiniezione o la trasfezione di tubulina marcata con molecole fluorescenti con imaging time-lapse e analisi video per visualizzare i microtubuli in vitro. Questi metodi potrebbero essere invasivi e dannosi per le cellule, in particolare le cellule umane primarie. Il passo più impegnativo è trovare le condizioni per la trasfezione cellulare. Abbiamo cercato di raggiungere il più alto livello possibile di trasfezione senza influire sulla vitalità e sulla morfologia delle cellule native. Questo studio applica il metodo classico per studiare le differenze nella dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei di donatori sani e pazienti con malattia di Huntington.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida del Centro federale di ricerca e clinica di medicina fisico-chimica dell'Agenzia federale di biologia medica datate 8 settembre 2015.
NOTA: la Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo.
1. Ottenere una coltura primaria di fibroblasti cutanei umani (Figura 2)
- Consegnare la biopsia a un laboratorio entro poche ore nel mezzo Modified Eagle Media (DMEM) di Dulbecco integrato con 50 μg / mL di penicillina e 50 U / mL di streptomicina.
NOTA: Una biopsia cutanea deve essere eseguita in condizioni sterili da un medico dopo che un paziente ha firmato un consenso informato. - Posizionare il tessuto bioptico in una capsula di Petri di 6 cm insieme a una piccola quantità del mezzo.
- Usando un bisturi sterile, tagliare il campione di biopsia in pezzi di circa 0,5-1 mm di dimensione. Posizionare 1-2 frammenti ottenuti in una capsula di Petri di 3,5 cm e posizionare una copertura sterile sopra i pezzi della biopsia. Aggiungere lentamente 1,5 mL di un mezzo di crescita alla seguente composizione: DMEM, 50 U / mL di penicillina-streptomicina e 10% di siero bovino fetale (FBS).
- Fibroblasti di coltura nel terreno di crescita all'interno di un incubatore a CO2 mantenuti al 5% di CO2,37 °C, 80% di umidità.
NOTA: Dopo 4-7 giorni, prima i cheratinociti, poi i fibroblasti, iniziano a migrare dal tessuto al fondo del piatto.
2. Conservazione, congelamento e scongelamento della cultura primaria
- Rimuovere le cellule dal piatto di coltura (vedere punti 3.2-3.4).
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare per 5 minuti a 200 x g. Quindi scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare in 900 μL di FBS raffreddato.
- Trasferire in un tubo di crioconservazione goccia a goccia e aggiungere 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO).
- Posizionare la criosonda in un congelatore a bassa temperatura a -80 °C. Ventiquattro ore dopo, trasferire il crioviale in azoto liquido (-196 °C) per la conservazione a lungo termine.
- Per scongelare le cellule crioconservate, rimuovere il crioviale dallo stoccaggio dell'azoto e, entro 1 minuto, trasferire 1 mL del contenuto in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL del mezzo di trasporto preriscaldato a 37 °C.
- Risospese con cura e poi centrifugare il tubo per 5 min a 200 x g. Scartare il surnatante, risospesere il pellet cellulare nel volume richiesto del mezzo di crescita e posizionarlo su una capsula di Petri del diametro richiesto.
3. Coltivazione cellulare
- Coprire il fondo del piatto con una soluzione di gelatina autoclavata allo 0,1% preparata in acqua distillata. Incubare per 15 min.
NOTA: per la visualizzazione della trasfezione, devono essere utilizzate piastre con fondo di vetro (piastre confocali con spessore di vetro 170 μm). - Preparare un terreno di coltura con la seguente composizione: DMEM integrato con 10% FBS, 2 mM L-alanil-L-glutammina, 50 U / mL penicillina-streptomicina. Mescolare accuratamente e conservare a 4 °C. Riscaldare il mezzo a 37 °C prima di aggiungerlo alle celle.
- Valutare la coltura al microscopio. Rimuovere il mezzo e lavare i fibroblasti con la soluzione di fosfato-sale di Dulbecco (DPBS).
- Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,25% preriscaldata alle cellule. Controllare le cellule al microscopio se si staccano completamente dal substrato. Disattivare la tripsina con 1 mL del terreno di coltura.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare il tubo a 200 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 1 mL del terreno di coltura.
- Contare il numero di celle. Calcolare il numero richiesto di cellule per seminarle con una densità di 8-15 x10 3/ cm2 e risospese in 2 mL del terreno di coltura.
- Rimuovere la soluzione di gelatina dalla capsula di coltura e aggiungere immediatamente 2 ml di sospensione cellulare. Coltivare i fibroblasti a 37 °C in un incubatore a CO2.
- Aggiorna il mezzo ogni 2-4 giorni.
NOTA: Per gli esperimenti, utilizzare le celle di 4-11 passaggi.
4. Trasfezione
- Sostituire il terreno di coltura con un terreno di coltura fresco 24 ore prima della trasfezione.
NOTA: la confluenza cellulare deve essere del 70-80%. - Preparare un complesso DNA-lipidico basato sull'area e la densità della semina cellulare. Utilizzare agente di trasfezione a base di liposomi.
NOTA: utilizzare la densità di semina delle celle come 1 x 104 celle/cm2. - Aggiungere 3 μL di reagente di trasfezione commerciale a 125 μL di mezzo essenziale minimo ottimale (Opti-MEM) non contenente antibiotici, senza toccare le pareti del tubo. Risospendare delicatamente.
- Diluire il DNA plasmidico (GFP-EB3) aggiungendo 1 μg del DNA plasmidico a 125 μL di Opti-MEM. Risospendare delicatamente.
NOTA: La codifica vettoriale di espressione GFP-EB311 è stata ricevuta come regalo gentile dal Dr. I. Kaverina (Vanderbilt University, Nashville) con il permesso del Dr. A. Akhmanova (Erasmus University, Rotterdam)11. - Aggiungere DNA plasmidico diluito a ciascun tubo di reagente di trasfezione diluito (1:1). Incubare per 30 min.
- Aggiungere il complesso DNA-lipidi alla capsula di Petri da 6 cm contenente cellule e mescolare con un'altalena cruciforme per 30 s. Incubare le cellule con un agente di trasfezione per 24 ore e poi passare a mezzo fresco. Analizzare l'efficienza della trasfezione dopo 24 ore e 48 ore.
NOTA: 24 ore dopo la trasfezione, l'efficienza era del 10-15% e dopo 48 ore fino al 40%.
5. Preparazione per l'imaging
- Prima dell'imaging dal vivo delle cellule, cambiare il terreno di coltura in un mezzo senza colorante indicatore di pH per ridurre l'autofluorescenza.
- Applicare con attenzione l'olio minerale sulla superficie del mezzo per coprire completamente il mezzo, isolandolo dall'ambiente esterno per ridurre la penetrazione di O2 e l'evaporazione del mezzo.
- Utilizzare una lampada al mercurio e un obiettivo a immersione in olio 60x o 100x con un'apertura numerica elevata per scattare le immagini.
NOTA: Per le osservazioni in vivo, il microscopio deve essere dotato di un incubatore per mantenere le condizioni necessarie per le cellule, compreso il riscaldamento della tabella degli oggetti e della lente a +37 °C, una camera chiusa con alimentazione di CO2 e supporto del livello di umidità. Utilizzare acqua doppia distillata per creare umidità. Controllare il livello di acqua doppia distillata prima di filmare. - Posizionare il piatto confocale con le cellule nel supporto del microscopio prima dell'imaging. Assicurarsi che la parabola e la fotocamera siano saldamente attaccate al supporto per evitare la deriva durante lo scatto di immagini.
6. Impostazione dei parametri di imaging
- Scegli i bassi valori di esposizione poiché la luce induce specie reattive dell'ossigeno (ROS) dannose per le cellule.
NOTA: Per studiare la dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei umani, è stata selezionata un'esposizione di 300 ms. - Concentrati sull'oggetto di interesse.
NOTA: per l'imaging time-lapse a lungo termine, utilizzare il sistema di stabilizzazione automatica della messa a fuoco per compensare un possibile spostamento lungo l'asse z. - Scegli le condizioni di imaging ottimali in base alla fotosensibilità delle cellule e al tasso di sbiadimento del fluorocromo.
NOTA: poiché i microtubuli sono strutture altamente dinamiche, è possibile selezionare un intervallo di tempo ragionevolmente breve e la frequenza dei fotogrammi deve essere sufficientemente elevata. Per studiare la dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei, abbiamo usato ad una frequenza di 1 fotogramma/i per 3-5 min. - Quando selezionate l'oggetto successivo per ottenere l'immagine, allontanatevi dall'area già fotografata. Poiché quest'area era sotto l'influenza della luce, ci sarà un notevole foto-sbiancamento.
NOTA: poiché è stata utilizzata una frequenza di imaging relativamente elevata, l'otturatore non si è chiuso tra le immagini e la lampada è stata accesa per l'intero periodo di imaging, motivo per cui lo sbiadimento è aumentato. - Scegli il video ottimale per studiare visivamente la dinamica dei microtubuli, tenendo conto della qualità della trasfezione, della qualità delle immagini dei microtubuli (rapporto segnale-rumore ottimale) e dell'assenza di deriva in caso di cellula analizzata (Figura 3).
- Utilizzare i video selezionati per studiare le dinamiche plus-end dei microtubuli tracciandoli nel programma ImageJ o Fiji (Figura 4).
NOTA: per le istruzioni per l'analisi quantitativa, vedere la Figura supplementare 2 e il Fascicolo supplementare 1.
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Representative Results
I filmati GFP-EB3 risultanti prodotti utilizzando il protocollo (Figura 1) illustrano le proprietà dinamiche dei microtubuli. I microtubuli sono coinvolti in diversi processi cellulari e le loro proprietà dinamiche influenzano varie caratteristiche vitali della coltura cellulare umana primaria dal materiale bioptico dei pazienti (Figura 2).
I seguenti parametri determinano l'instabilità dinamica dei microtubuli: i tassi di crescita (polimerizzazione) e restringimento (depolimerizzazione); la frequenza delle catastrofi (transizione dalla polimerizzazione alla depolimerizzazione); la frequenza dei salvataggi (transizione dalla depolimerizzazione alla polimerizzazione); così come le pause - afferma quando il microtubulo non polimerizza e non depolimerizza 12. Tutti i parametri sono strettamente regolati e i tassi di polimerizzazione e depolimerizzazione dei singoli microtubuli possono variare significativamente sia nello stesso che in diversi tipi di cellule13,14,15,16,17.
È necessario considerare per l'analisi che i microtubuli possono avere dinamiche diverse a seconda della loro posizione nella cellula. I microtubuli situati nella regione del nucleo e del centrosoma si comportano in modo diverso rispetto a quelli della periferia cellulare19. Pertanto, per ottenere un risultato affidabile, abbiamo effettuato le misurazioni dinamiche dei microtubuli in tre regioni separate della cellula: la parte centrale, il bordo d'attacco e la parte della coda (Figura 3). Per controllare la corretta distribuzione dell'etichetta GFP-EB3 in varie parti cellulari, abbiamo utilizzato cellule endoteliali dell'arteria polmonare umana (HPAEC) (vedi Figura supplementare 1).
Programmi specializzati, come ImageJ o Fiji (ImageJ 2 v1. 53i), consentono l'analisi dei video con i seguenti parametri: (1) il tasso di crescita dei microtubuli; (2) la frequenza delle catastrofi; 3) la frequenza dei soccorsi; 4) la frequenza delle pause; e (5) durata delle pause. Inoltre, le opzioni di programma e i plugin unici consentono di tracciare automaticamente18 o manualmente19 (Figura 4). Il metodo di tracciamento manuale ha funzionato meglio nei nostri esperimenti poiché le misurazioni automatiche sono soggette a errori più grandi e richiedono più ripetizioni per un risultato più accurato. Istruzioni dettagliate sull'analisi dei dati dinamici dei microtubuli sono disponibili nella Figura supplementare 2 e nel File supplementare 1.
I parametri di imaging possono richiedere regolazioni durante il processo di imaging. Ad esempio, è possibile modificare la durata dell'imaging di una cella e i valori di esposizione. Tali impostazioni sono utili se c'è un rapido burnout del segnale o se la cella si restringe (Figura 5).
Figura 1: Lo schema generale del protocollo di trasfezione GFP-EB3 per la coltura di fibroblasti primari della pelle umana. Il protocollo include i seguenti passaggi: distacco delle cellule dalla soluzione di tripsina; inattivazione della tripsina dall'aggiunta media; centrifugazione del composto risultante; calcolo della concentrazione cellulare; semina cellulare al piatto di fondo di vetro (piatto confocale) rivestito di gelatina; trasfezione in coltura cellulare da DNA plasmidico (con GFP-EB3) con il reagente di trasfezione liposomiale; incubazione 24-48 h; e analisi al microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema di preparazione primaria della coltura dei fibroblasti cutanei umani. Una biopsia cutanea deve essere eseguita in condizioni sterili da un medico dopo che un paziente firma un consenso informato. Quindi un pezzo di tessuto viene trasportato in una piccola quantità del mezzo senza FBS al laboratorio in una capsula di Petri. Un grande frammento di tessuto viene tagliato in pezzi di 0,5-1 mm di dimensione e sono coperti con un vetro di copertura con l'aggiunta del mezzo con FBS. Quindi la capsula di Petri viene posta in un incubatore a CO2, dove dopo 4-7 giorni i fibroblasti migrano dal frammento di tessuto al fondo di vetro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Marcatore GFP-EB3 (verde) in diverse aree di fibroblasti umani trasfettati, ottenuto dalla biopsia cutanea di pazienti MH: bordo d'attacco (pannello superiore); coda (pannello centrale); parte centrale dei fibroblasti (zona intorno al centrosoma) (pannello inferiore). Barra della scala = 10 μm. La frequenza di imaging è di 1 fotogramma/s. Microscopia fluorescente ad ampio campo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Tracciamento manuale GFP-EB3 tramite il plugin ImageJ MTrackJ. Le tracce che riflettono la crescita dei microtubuli sono state ottenute come risultato della marcatura manuale fotogramma per fotogramma delle punte delle etichette GFP-EB3 alle estremità più durante 20 s di imaging. Fibroblasti in coltura trasfettati, ottenuti dalla biopsia cutanea di pazienti MH. La frequenza di imaging è di 1 fotogramma/s. Microscopia fluorescente ad ampio campo. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risoluzione dei problemi durante l'imaging delle estremità più dei microtubuli marcati GFP-EB3. (A) I microtubuli marcati fluorescenti sono fuori fuoco a causa dell'assenza di un sistema di messa a fuoco. (B) I microtubuli sono stabilizzati e perdono le loro proprietà dinamiche a causa della sovraespressione di GFP-EB3 nella cellula a causa della lunga incubazione con la miscela trasfettante. (C) Restringimento della lamella cellulare a causa della fototossicità dovuta al rilascio di ROS. (D) L'intensità del segnale diminuisce durante l'imaging - fotosbiancamento rapido. Fibroblasti in coltura trasfettati, ottenuti dalla biopsia cutanea di pazienti MH. La frequenza di imaging è di 1 fotogramma al secondo. Microscopia fluorescente ad ampio campo. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Visualizzazione selettiva dei plus-end dei microtubuli in crescita. Marcatore GFP-EB3 (verde) in diverse aree della cellula endoteliale umana trasfetta (coltura di HPAEC: cellule endoteliali dell'arteria polmonare umana) nel bordo d'attacco, nella coda e nell'area centrale (zona intorno al centrosoma). Barre di scala 10 μm. La frequenza di imaging è di 1 frame/s Microscopia fluorescente ad ampio campo. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura 2 supplementare: Analisi dinamica dei microtubuli mediante etichetta GFP-EB3 dopo il tracciamento manuale utilizzando il plug-in ImageJ MTrackJ. (A,B) Le tracce EB3 ottenute dai cerotti EB3-GFP si spostano su serie time-lapse di fibroblasti in coltura trasfettati, ottenuti dalla biopsia cutanea di pazienti MH (sono colorati individualmente). (A) Traccia EB3 (viola, No46) ottenuta dalle patch EB3-GFP si sposta durante 18 secondi. (B) Traccia EB3 (rosso, No37) ottenuto dalle patch EB3-GFP si sposta durante 9 secondi. (C) Quantificazione dello spostamento delle estremità più alte dei microtubuli dei fibroblasti cutanei dei pazienti umani mh mostrato nella (A). (D) Quantificazione dello spostamento delle estremità più dei microtubuli mostrato nella (B). Il grafico mostra che tra 6-8 secondi c'è una pausa nella crescita del microtubulo (non c'è movimento del plus-end). Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: Analisi quantitativa della dinamica dei plus-end dei microtubuli marcati EB3-GFP. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Risultati di migliore qualità per l'analisi dinamica dei microtubuli possono essere ottenuti da immagini microscopiche di alta qualità. È importante osservare tutte le condizioni necessarie per l'imaging time-lapse delle cellule viventi e regolare correttamente i parametri di imaging. L'uso di speciali piatti di coltura cellulare con un fondo di vetro (piatti confocali) è importante, poiché il vetro ha un diverso indice di rifrazione della luce rispetto alla plastica. Anche lo spessore del vetro e la sua uniformità su tutta la sua area sono estremamente importanti, poiché questi parametri sono cruciali per la normale messa a fuoco del campione. La violazione di questi parametri porta inevitabilmente a un fallimento del sistema di messa a fuoco perfetta con conseguente cattiva messa a fuoco, rendendo così impossibile l'uso di tali video sfocati per l'analisi (Figura 5A). Un'altra condizione importante per l'imaging di cellule vive è la loro protezione dai ROS. Vari reagenti possono essere utilizzati per tali scopi20. Nel nostro lavoro, utilizziamo olio minerale, che isola completamente il terreno di coltura dall'atmosfera e impedisce lo scambio di gas. Allo stesso modo, l'ossirasi ros-riducente può essere utilizzata, ma questo enzima non è adatto a tutti i tipi di cellule ed è più spesso applicabile all'imaging con un tempo maggiore.
Quando si sceglie il tempo di incubazione ottimale delle cellule dopo la trasfezione (24 o 48 ore), si dovrebbe prestare attenzione al numero di cellule trasfettate. Un numero inferiore al numero massimo di cellule che esprimono la proteina marcata è già sufficiente per l'analisi. La sovraespressione non dovrebbe essere consentita perché i microtubuli, in questi casi, sono stabilizzati e le loro proprietà dinamiche non possono essere analizzate (Figura 5B).
In alcuni casi, potrebbe essere necessario regolare i parametri di imaging in base alla reazione delle cellule dopo l'inizio della registrazione video. Ad esempio, è possibile osservare il restringimento della lamella cellulare a causa dell'elevata sensibilità alla luce (fototossicità) (Figura 5C). Quando eccitate, le molecole fluorescenti reagiscono tipicamente con l'ossigeno molecolare per formare radicali liberi che possono danneggiare i componenti cellulari21. Quando si progettano esperimenti, i fluorofori con la massima lunghezza d'onda di eccitazione possibile devono essere selezionati per ridurre al minimo il danno cellulare sotto l'illuminazione a onde corte. Inoltre, ci sono rapporti che alcuni componenti dei terreni di coltura standard, tra cui la vitamina riboflavina e l'amminoacido triptofano, possono anche contribuire agli effetti negativi della luce sulle cellule coltivate22. Tra le altre cose, questo può essere causato da una quantità eccessiva di etichette fluorescenti in una cella. In questi casi, diventa necessario ridurre la durata della registrazione e l'intensità dell'illuminazione. Un altro possibile problema può anche essere il fotosbiancamento rapido - diminuzione dell'intensità del segnale durante la registrazione (Figura 5D). Questo effetto dovrebbe essere preso in considerazione quando si seleziona l'oggetto successivo sullo stesso piatto sperimentale, poiché anche le cellule vicine intorno all'area ripresa vengono bruciate.
Va detto che ci sono altri metodi per la visualizzazione di microtubuli nelle cellule viventi come la microiniezione di tubulina marcata fluorescente nella cellula o la trasduzione cellulare usando virus. Come con qualsiasi altro metodo, ci sono vantaggi e svantaggi del metodo di trasfezione. Tuttavia, dal nostro punto di vista, rispetto al metodo di iniezione, la trasfezione è più efficace e consente di ottenere l'inclusione di massa di vettori di espressione nelle cellule, risultando in un gran numero di cellule fluorescenti per l'analisi. Inoltre, il metodo di trasfezione non richiede attrezzature e abilità speciali da parte del ricercatore. Il metodo di trasduzione virale mostra buoni risultati e può essere applicato. Tuttavia, non è adatto a tutte le colture cellulari (in particolare, è meno adatto per i fibroblasti umani, ottenuti dalla biopsia cutanea di pazienti MH).
Il passaggio più critico in questo protocollo è la trasfezione eseguita per garantire un'espressione proteica sufficiente. Un buon rapporto segnale-rumore, nessuna fotosbiancamento dei microtubuli e l'assenza di deriva cellulare durante la registrazione video time-lapse sono assolutamente fondamentali per un'efficace imaging dei microtubuli. Nel nostroesperimento, la visualizzazione dei microtubuli e l'analisi dinamica forniscono informazioni vitali sulle proprietà e sul comportamento dei microtubuli nelle cellule con HTT mutante. Il nostro protocollo è applicabile per studi di altre malattie per le quali la patologia implica proprietà dinamiche dei microtubuli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa, sovvenzione n. 075-15-2019-1669 (trasfezione dei fibroblasti), dalla Russian Science Foundation, sovvenzione n. 19-15-00425 (tutti gli altri lavori sulla coltivazione di fibroblasti in vitro). È stato parzialmente supportato dal programma di sviluppo dell'Università statale di Mosca Lomonosov PNR5.13 (imaging e analisi). Gli autori riconoscono il supporto del Nikon Center of Excellence presso l'A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vogliamo offrire i nostri ringraziamenti speciali a Ekaterina Taran per la sua assistenza nella recitazione vocale. Gli autori ringraziano anche Pavel Belikov per il suo aiuto con l'editing video. Le figure nel manoscritto sono state create con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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