Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En standardiseret procedure til overvågning af skadelige algeopblomstringer i Chile ved metabarcodinganalyse

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62967
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3, 4, 5, 6, 6, 4, 4, 7, 5, 3, 1
1Office of Research and Academia-Government-Community Collaboration, Hiroshima University, 2Graduate School of Human and Environmental Studies, Kyoto University, 3Scientific and Biotechnological Bioresource Nucleus, Universidad de La Frontera, 4Centro de Estudios de Algas Nocivas, Instituto de Fomento Pesquero, 5Ciencias del Mar y Recursos Biologicos, Universidad de Antofagasta, 6Departamento de Ciencias Biológicas y Biodiversidad, Universidad de Los Lagos, 7Japan Fisheries Research and Education Agency, Fisheries Resources Institute

Summary

Denne protokol introducerer trin til metabarcoding analyse, rettet mod 16S rRNA og 18S rRNA gener, til overvågning af skadelige algeopblomstringer og deres tilhørende mikrobiom i havvand prøver. Det er et kraftfuldt molekylært baseret værktøj, men kræver flere procedurer, som visuelt forklares her trin for trin.

Abstract

Der er gennemført overvågning af skadelige algeopblomstringer (HABs) på verdensplan, og Chile, et land, der er berømt for sit fiskeri og akvakultur, har intensivt anvendt mikroskopiske og toksinanalyser i årtier til dette formål. Molekylære biologiske metoder, såsom dna-sekventering med høj kapacitet og bakterielle assemblagebaserede tilgange, er lige begyndt at blive indført i chilensk HAB-overvågning, og procedurerne er endnu ikke blevet standardiseret. Her introduceres 16S rRNA og 18S rRNA metabarcoding analyser til overvågning af chilenske HABs trinvist. Ifølge en nylig hypotese, algebakterielle mutualistic forening spiller en kritisk synergetisk eller antagonistisk forhold tegner sig for blomstre indledning, vedligeholdelse, og regression. Således kan overvågning af HAB fra algebakterielle perspektiver give en bredere forståelse af HAB-mekanismer og grundlaget for tidlig varsling. Metabarcoding analyse er en af de bedst egnede molekylær-baserede værktøjer til dette formål, fordi det kan opdage massive algebakterielle taksonomiske oplysninger i en prøve. De visuelle procedurer for prøveudtagning til metabarcoding analyse heri give specifikke instruktioner, der sigter mod at reducere fejl og indsamling af pålidelige data.

Introduction

Mange marine fytoplanktonarter er kendt for at producere endogene toksiner, og når disse arter akkumuleres i tilstrækkeligt antal, er de skadelige for havmiljøet. Sådanne skadelige Algeopblomstringer (HABs) observeres i dag på kysterne på de fleste kontinenter i verden1. Giftigt fytoplankton ophobes først i toskallet væv, hvilket fører til sygdom og død i højere trofiske niveauer af organismer, herunder mennesker, ved fordøjelsen. Efterfølgende medfører disse begivenheder alvorlige konsekvenser for den lokale økonomi, socioøkonomiske og folkesundhed2. Skaderne på den globale økonomi forårsaget af HABs anslås at være millioner til milliarder af dollars hvert år3. Chile er et af mange lande, der lider af hyppige HABs.

Chile er et land med langt land, der strækker sig over 4.300 km nord og syd. Det aflange vestlige land vender ud mod Stillehavet, hvilket naturligvis øger chancerne for, at Chile oplever HABs. Især i det sydlige Chile er der mange verdensberømte lakseopdræt, og hver gang en HAB forekommer i regionen, resulterer algegiftene i massive opdrættede laks, der bliver syge og dør4,5,6. I Chile, det år, hvor HAB ramte økonomien hårdest var 2016, med en anslået årligt tab på US $ 800 millioner7,8. De forårsagende giftige algearter varierer efter år og sted. For 2016-sagen forårsagede et kompleks af Alexandrium catanella og Pseudochattonella verruclosa en udbredt HAB i det meste af den sydlige chilenske kyst7,8. Den seneste HAB i Chile opstod med de forårsagende algearter af Heterosigma Akashiwo i marts 2021 ved Camanchaca, der ligger i det sydlige Chile, hvor området har en stor laksefarm.

Chile har i mange år gennemført kystovervågning ved hjælp af to hovedmetoder. observere havvand med mikroskoper til regelmæssigt identifikation af giftige algearter og måling af toksinniveauer i skaldyr ved biokemiske analyser9. Tidlig påvisning af giftige alger og toksinniveauer i skaldyr forhindrer ikke HABs. Disse analyser kan dog udløse øjeblikkelige modforanstaltninger og reducere skaderne på lokalsamfundene. For yderligere at styrke effektiviteten af denne strategi blev der for nylig tilføjet en molekylærbaseret analysemetode til vores konventionelle chilenske HAB-overvågningsprogram til at opdage alger og relaterede bakteriesamfund i havvandsprøver. Specifikt blev der valgt en Massiv Parallel Sekventeringsmetode ved hjælp af metabarcoding, der er rettet mod 16S rRNA og 18S rRNA-gener. Selv om denne teknik kræver komplicerede procedurer og dyre maskiner og reagenser, er det en avanceret teknologi, der kan opdage tusindvis af alger og bakterier slægter / arter til stede i en havvandsprøve på én gang.

Årsagerne til HAB spekuleres i at være forskellige, såsom temperatur og sæson, men det er umuligt at generalisere dem. Dette skyldes, at HAB arter og frekvenser afhænger af regionen og spatiotemporal betingelser, der involverer naturfænomener såsom geografisk unikhed, upwelling næringsstof blanding, og element afstrømning fra land på grund af errosion2,10,11,12. Derudover påvirker kunstige faktorer som eutrofiering lokale HABs12,13. På grund af den komplekse multifaktor er det ikke let at lave en nøjagtig HAB-forudsigelse. I de senere år er der en opfattelse af, at specifikke bakteriepopulationer kan være relateret til udviklingen af HABs som en af faktorerne, og forskning til støtte for denne hypotese er blevet mere og mere tydelig14,15,16,17,18. Molekylærbiologiske teknikker bruges generelt til at studere bakteriel assemblage; en sådan standardiseret metode er dog endnu ikke fastlagt i chilensk HAB-overvågning9. For at studere algebakteriel tilknytning til HABs er det bydende nødvendigt samtidig at udføre metabarcodinganalyse for de nuværende chilenske kystovervågningsprogrammer. Således introducerer denne protokol visuelt vores chilenske HAB-overvågningsprogram med fokus på en trinvis procedure til analyse af alger og bakterier arter påvisning i havvandsprøver ved hjælp af metabarcoding analyse.

Den fulde protokol, der beskriver vores chilenske HAB overvågningsprogram er tilgængelig i Yarimizu et al.9. Det omfatter procedurer for havvand prøveudtagning, mikroskopiske alge arter afsløring, algebakterielle gendetektering, pigment analyse, meteorologiske dataindsamling, og fysiske og kemiske vand ejendom assays. Den trinvise protokol med 16S rRNA og 18S rRNA metabarcoding analyse for alge- og bakteriearter detektion er tilgængelig som et fortryk19. Denne protokol demonstrerer især metabarcoding analyse trin, da det er den mest komplicerede del og højdepunktet i vores HAB overvågningsprogram. Denne protokol omfatter også en introduktion af programmet og mikroskopi påvisning af algearter. Når du analyserer algearter ved metabarcoding, er det afgørende samtidig at udføre mikroskopi for at kontrollere resultaterne fra de to metoder. Denne protokol omfatter ikke, hvordan du bruger software til taksonomitildeling, men databaseanbefaling er kort angivet i slutningen af det følgende afsnit.

Protocol

1. Indsamling og forbehandling af prøver

  1. Saml ca. 3 L vandprøve fra målstedet.
  2. Filter 1 L vandprøve til 16S rRNA-analyse gennem tandemfiltrering (1 μm og 0,2 μm pore-størrelse membran) for at adskille fritlevende og tilknyttede bakterier.
  3. Filtrer en anden 1 L vandprøve til 18S-rRNA-analyse (fytoplanktondetektering) gennem en enkelt filtrering med en 0,2 μm membran.
    BEMÆRK: Filtreringen af vandprøven skal være afsluttet inden for 12 timer efter prøveudtagningen.
  4. Skær filtreret membran i halve med steril kirurgisk saks og pak den med aluminiumsfolie. Opbevar ved -20 °C i op til 1 måned, eller fortsæt til næste trin.
  5. Uddrag DNA med Chelex-metoden som beskrevet9. Opbevares ved -20 °C i op til 1 måned.

2. Mikroskop analyse

  1. 1 mL af vandprøven med en pipette overføres til en 1 mL gitterrutschebane.
  2. Overhold prøven under et mikroskop.
  3. Registrer navne og mængden af fytoplanktonarter.

3. 16S rRNA og 18S rRNA metabarcoding analyse

BEMÆRK: Denne proces består af syv sektioner: forberedelse, første PCR amplicon generation, første amplicon oprydning, indeksering af anden PCR, anden PCR amplicon verifikation og oprydning, DNA-koncentration justering, og DNA denaturering og sekventering. Hele processen tager mindst 5 dage (40 timer) af et erfarent laboratoriepersonale. Se materialetabellen for produktnumre og -producenter.

  1. Præparation
    1. Rengør pipetter og laminar hætteskab med 70% ethanol efterfulgt af UV-eksponering i 30 min hyppigt. Sterilisere materialer, der skal anvendes.
    2. Optø DNA-prøver ved stuetemperatur, centrifuge ved 100 x g i 2 min, og overfør 100 μL af hver prøve supernatant til 8-rør strimler.
  2. Første PCR amplicon generation
    BEMÆRK: Udfør følgende procedurer i et laminar hætteskab. Fortynd altid primere fra 1 μM lager til målkoncentrationen med PCR-kvalitet vand for at undgå primerforurening.
    1. Første PCR-masterblanding i et sterilt 1,5 mL-rør til reaktioner (tabel 1, tabel 2).
    2. Aliquot 22,5 μL af masterblandingen i en 8-rørs strimmel og tilsættes 2,5 μL DNA-prøve. Brug 2,5 μL pcr-vand til negativ kontrol.
    3. Kør den første PCR-cyklus (Tabel 3).
    4. Der fremstilles 100 mL 2% Agarose-TBE gel indeholdende 10 μL 1x nukleinsyregelplet.
    5. Der skal fyldes en blanding af 1,5 μL 1x DNA-belastningsfarvestof og 4 μL PCR-produkt på agarosegelen. Læg også 100 bp DNA-stigen på gelen.
    6. Udfør elektroforese ved 100 V i 30 min.
    7. Sørg for, at der er et bånd ved 500-600 bp rækkevidde under en UV-lysbilledoptagelse. Primer-dimer band er runde 80 bp.
      BEMÆRK: Havvandsprøver indeholder PCR-hæmmere. Manglende ampliconer kan undertiden løses ved at fortynde prøver 1:100 eller 1:1000 med PCR kvalitet vand.
    8. Opbevar de første PCR-produkter ved -20 °C indtil næste trin.
      FORSIGTIG: Der må ikke opbevares mere end en uges opbevaring.
  3. Første PCR amplicon oprydning
    BEMÆRK: Dette afsnit kan udføres uden for et laminar hætteskab.
    1. Brug magnetiske perler DNA oprydning system til at fjerne PCR reaktion rester, herunder primer-dimer produkter.
    2. Overfør 20 μL af hvert renset første PCR-produkt til en ny 96 brøndplade. Forsegl pladen med en mikrotætningsfilm. Opbevares ved -20 °C, indtil næste trin fortsætter.
      FORSIGTIG: Der må ikke opbevares mere end en uges opbevaring.
  4. Indeksering efter anden PCR
    BEMÆRK: I dette afsnit forstærkes de første PCR-produkter med forskellige indeksgrundsgrunderkombinationer.
    1. Fortynd alle indeks 1- og indeks 2-primere (tabel 4) til 1 μM med PCR-kvalitet vand i 8 tube PCR-strimler placeret i et laminar hætteskab.
      BEMÆRK: De skridt fremover i dette afsnit kan udføres uden for en laminar hætte kabinet, som indeks primere er specifikke for de første PCR reaktioner udhæng adapter.
    2. Placeringsindeks 1-primer i en vandret række Index 2-primere i en lodret række (Tabel 5).
    3. I en ny 96-brønd plade, tilsæt 12,5 μL af hot-start-ready formulering til hver brønd.
    4. Der tilsættes 2,5 μL af hver indeksprimer (1 μM) til hver samt i tabel 4 ved hjælp af en multikanalpipette.
    5. Der tilsættes 7,5 μL renset første PCR-produkt.
    6. Bland forsigtigt ved pipetter op og ned 10 gange. Dæk pladen med en mikrotætningsfilm.
    7. Kør den anden PCR-cyklus (tabel 3).
    8. Hold pladen ved -20 °C.
      FORSIGTIG: Der må ikke opbevares mere end en uges opbevaring.
  5. Anden PCR-ampliconbekræftelse og oprydning
    1. Brug en fragmentanalysator og tilhørende reagens. Vortex og spin ned reagens før brug.
    2. Lad prøvebufferen og DNA-skærmbåndet ekvilibrere ved rumtemperatur i 30 min. Placer derefter DNA-skærmbåndet i en fragmentanalysator.
    3. Bland 2 μL prøvebuffer og 3 μL anden PCR-amplicon i nye 8 rørstrimler. Sæt de 8 rørstrimler i fragmentanalysator. Tryk på Kør for at starte.
      FORSIGTIG: Dannelse af luftbobler skal undgås.
    4. Sørg for, at anden PCR amplicons er ca 613 bp (600 - 630 bp) for både 16S og 18S rRNA gener.
    5. Rense anden PCR produkter ved hjælp af en magnetisk perler DNA oprydning system.
  6. Justering af DNA-koncentration
    1. Mål DNA-koncentrationen i de rensede andet PCR-produkter ved hjælp af et nukleinsyrekvantificeringsspektrofotometer.
    2. Beregn målgenkoncentration i nM, der tegner sig for den gennemsnitlige endelige biblioteksstørrelse som 613 bp for både 16S og 18S rRNA gener:
      Equation 1
    3. Fortynd hvert renset andet PCR-produkt med sterilt PCR-vand til 4 nM i en ny 0,2 mL 96 brøndplade.
      BEMÆRK: Pladen kan opbevares ved -20 °C her. Ellers skal resten af procedurerne udføres uden at standse.
    4. Aliquot 3 μL af hvert 4 nM andet PCR-produkt og bland alt i et nyt sterilt 1,5 mL rør som et samlet bibliotek. Opbevar røret ved 4 °C eller på isbad hele tiden.
    5. Mål koncentrationen af det poolede bibliotek til bekræftelse ved hjælp af et nukleinsyrekvantificeringsspektrofotometer. Juster koncentrationen til 4 nM, hvis den er højere end 4 nM.
      BEMÆRK: Overkoncentreret DNA producerer overvurderede læsetal, hvilket hæmmer analysen.
  7. DNA-denaturering og sekventering
    BEMÆRK: Dette afsnit bruger Illumina MiSeq-systemet med specifikke reagenser. Se produktnumre i Materialetabel.
    BEMÆRK: Følg nøje tiden. Optø alle reagenser undtagen patroner på dagen for sekventering.
    1. En dag før sekventering skal du fjerne en fyldt reagenspatron, der er klar til brug, fra -20 °C og opbevares ved 4 °C til optøning.
    2. Sæt en varmeblok, der er egnet til 1,5 mL centrifugerør, til 96 °C.
    3. Placer hybridiseringsbufferen på is.
    4. Fortynd molekylær kvalitet NaOH fra 1 N til 0,2 N i et nyt rør med PCR kvalitet vand.
    5. Fortynd et brugervenligt kontrolbibliotek med TE-buffer (pH 8.0) fra 10 nM lager til 4 nM i et nyt rør (dvs. 2 μL kontrolbibliotek + 3 μL TE-buffer).
    6. Bland 16 μL af 4 nM poolet prøvebibliotek med 4 μL af 4 nM kontrolbibliotek i et nyt rør mærket "1".
    7. 10 μL prøve i rør "1" med 10 μL på 0,2 N NaOH i et nyt rør mærket "2".
    8. Vortex røret 2 for 5 s, spin ned kort, og inkubere ved stuetemperatur i 5 min.
    9. Der tilsættes 980 μL hybridiseringsbuffer til rør 2.
    10. I et nyt rør med navnet "3" blandes prøven fra rør 2 med 390 μL hybridiseringsbuffer. Bland ved at vende røret.
    11. Inkuber rør 3 ved 96 °C i 2 min og læg det straks på is i højst 2 min.
    12. Tag patronen ud af 4 °C køleskab.
    13. Konfigurer eksempelarket til rækkefølge med hvert tilsvarende indeks 1- og indeks 2-kort som i tabel 6.
    14. Fjern flowcellen fra MiSeq v3-sættet. Rengør forsigtigt flowcellen med sterilt pcr-vand af molekylær kvalitet.
      BEMÆRK: Hæld ikke vand på flowcellens kapillær prikker. Tør forsigtigt vand af flowcellen med ikke-fibrøst papir.
    15. Læg det fulde rørvolumen 3 (650 μL) i patronen.
    16. I instrumentdriftssoftware skal du vælge sekventering og følge vejledningen. Indsæt flowcell, inkorporeringsbuffer og patron. Indlæs prøveark. Tryk på Kør for at starte reaktionen.
      BEMÆRK: Denne sekvenskørsel tager 3-5 dage. Dataene overføres automatisk til Basespace-platformen. Rå data gemmes i to mapper på computeren: Analysemappe, der indeholder fastq-filer og output, der indeholder bcl-filer og jpeg-billeder.

4.Taksonomisk tildeling til sekventering af data

  1. Behandling af FASTQ-filer
    BEMÆRK: DADA2 pakke23 af R24 er en af anbefalede databaser til behandling af FASTQ-filer. Retningslinjen er tilgængelig på [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. Denne retningslinje blev udarbejdet ved at vedtage den seneste version af DADA2 pipeline tutorial [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html].
    1. Behandl rå FASTQ-parrede sekvenser til trimning, kvalitetsfiltrering, dereplication og optælling af unikke sekvenser, prøveudslettelse, fletning i contigs og fjernelse af kimærsekvenser.
    2. Brug følgende DADA2-angivne parametre for både 16S rRNA og 18S rRNA-genfragmenter. trimLefts=0, 0, afkortNing=[Kontroller sekvenskvaliteten, og indstil den til en passende længde].
      BEMÆRK: Standardværdierne for de andre parametre er maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2.
  2. Taksonomitildeling
    BEMÆRK: SILVA rRNA-databasen anbefales til taksonomitildeling for DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz er angivet som standard].
    1. Fjern chloroplast og mitokondrie OTUs til 16S rRNA genfragmentanalyse. Fjern singletons fra 16S rRNA og 18S rRNA analyse.
    2. Rarify alle prøver til selv sekventering dybde baseret på prøven har den laveste sekventering dybde.
    3. Registrer antallet af læste, OTA'er, der er tildelt, og på hvilket niveau filtrerede læser, og antallet af singletons udelukket.
  3. Statistisk analyse
    1. Udfør statistisk analyse af mikrobielle data ved hjælp af R-pakker af phyloseq25 og veganer26.

Representative Results

Denne protokol bruger 18S rRNA genmet metabarcoding analyse til at identificere algearter i havvand prøver. Et repræsentativt resultat er vist i figur 1, hvor havvand indsamlet fra Metri, Puerto Montt, Chile (−41.597; −72.7056) den 19. februar 2019 blev analyseret med denne protokol. Resultatet viste i alt 13.750 aflæsninger med over 30 algearter i havvandsprøven. Den dominerende alge i denne prøve var Navicula spp. med en relativ overflod på 70,77%. Der blev også observeret tilstrækkelig overflod for Micromonas (6,40%), Chaetoceros spp. (4,44%), Scripsiella spp. (2,44%) og Prorocentrum spp. (1.28%). Pseudochattonella spp., en af de højeste giftige algefremkaldende midler af chilenske HAB, blev opdaget med 0,52% fra denne havvandsprøve.

For at kontrollere datasikkerheden blev de algearter, der er identificeret ved 18S rRNA-genanalyse, sammenlignet med dem, der blev opnået ved mikroskopi i samme havvandsprøve (figur 2). I overensstemmelse med 18S rRNA genanalyse, mikroskopien viste, at den dominerende art var Navicula spp. med en relativ overflod på 74,1% og Prorocentrum spp. (0,60%) som en mindre art. Omvendt blev Heterocapsa spp. (9,04%) dokumenteret fra mikroskopisk observation ikke identificeret ved 18S rRNA-genanalyse i denne prøve. Der var 12,6% af små omkring uidentificerbare fytoplanktonceller registreret ved mikroskopi. Dette kunne være Micromonas, ifølge 18S rRNA resultater.

Protokollen bruger 16S rRNA gen metabarcoding analyse til at identificere bakterielle arter i havvand prøver. Et repræsentativt resultat er vist i figur 3, hvor det samme havvand, der anvendes til 18S rRNA genanalyse, blev analyseret med 16S rRNA-genanalyse. Resultatet viste i alt 31.758 aflæsninger med over 30 bakteriearter i havvandsprøven. Det skal skitseres, at denne havvandsprøve blev passeret gennem tandemfiltermembraner (1 μm og 0,2 μm porestørrelser) for at adskille fritlevende bakterier fra tilknyttede bakterier. Derefter blev celler fanget af hver filtermembran behandlet for DNA-ekstraktion efterfulgt af 16S rRNA-genanalysen. Det repræsentative resultat i figur 3 viser bakteriearter identificeret fra 0,2 μm pore størrelse membran, som er defineret som fritlevende bakterier. Den dominerende fritlevende bakterier var Amylibacter spp. med en relativ overflod på 20,02%, efterfulgt af Clade Ia (13,53%) og Aligiphilus spp. (7.06%). Resten af de bakteriearter, der blev påvist fra denne havvandsprøve, var relativt ligeligt fordelt. Den samme analyse kan gøres for celler fanget af 1 μm pore-størrelse membran som attach-bakterier arter afsløring.

Når disse metabarkodning assays udføres på planlagte tidspunkter over en bestemt undersøgelsesperiode, resultaterne kan opsummeres som tidsserie analyse. En måde at gøre det på er at plotte den relative overflod af bestemte alge- og bakteriearter som en funktion af tiden for at finde et unikt vækstmønster. Figur 4 viser en repræsentativ tidsserie plot af Alexandrium og Pseudochattonella i Metri, Chile. En anden måde at opsummere en tidsserie metabarcoding analyse er at plotte alle identificerede alge og bakterielle som en funktion af tid, der repræsenterer befolkningsændringen af visse grupper af organismer. Figur 5 og figur 6 opsummerer den relative overflod af alle de bakterielle slægter og orden, henholdsvis, som detekteres fra havvandet i Metri over fem måneder.

Tabel 1: Første PCR-mastermixindhold: Tabellen viser master mix indhold pr reaktion for 16S rRNA og 18S rRNA analyser. Primersekvenserne er angivet i tabel 3. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Primersekvenser: Primerne til første PCR er noteret for 16S rRNA- og 18S rRNA-analyser. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: PCR-cyklusser: De termiske cyklusser til første PCR og anden PCR er angivet. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Indekssekvenser: Indeks 1 (i7) og indeks 2 (i5) primere, der skal anvendes til anden PCR, er opført. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Eksempel på placering af indeks 1 og indeks 2: For at reducere fejl skal indeks primere placeres i positionen først, og aliquot af hver overføres til en 96-brønd plade ved hjælp af multikanal pipette. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: Eksempel på eksempelark: Før rækkefølge skal der oprettes et eksempelark, der svarer til indeks 1- og indeks 2-kort. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 1
Figur 1: Repræsentativt resultat af 18S rRNA-metabarkodningsanalyse: Algearter, der er til stede i en havvandsprøve indsamlet fra Metri, Los Lagos, Chile den 19. februar 2019, blev identificeret ved 18S rRNA metabarcoding assay. De tildelte sekvenser "ukendt" blev elimineret fra, og den relative overflod af hver identificeret art blev plottet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentativt resultat af mikroskopisk analyse: Algearten blev identificeret fra en vandprøve fra Metri, Los Lagos, Chile den 19. februar 2019 ved mikroskopi. Mængden af hver art blev talt manuelt og afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativt resultat af 16S rRNA-metabarkodningsanalyse: Bakteriearter, der var til stede i en vandprøve fra Metri, Los Lagos, Chile den 19. februar 2019, blev identificeret ved 16S rRNA-metabarkodningsanalyse. Den relative overflod af hver identificeret art blev plottet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentativt tidsserieplot af Alexandrium spp. og Pseudochattonella spp. fremstillet af 18S rRNA metabarcodingin Metri, Chile: Figur genoptrykt fra Yarimizu et al9. De to giftige algearter, Alexandrium og Pseudochattonella, blev selektivt overvåget af 18S rRNA-analyse over tid, og den relative overflod blev afbildet som en funktion af time-point. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentativ slægtstidsserieplot fremstillet af 16S rRNA og 18S rRNA metabarkodning: Al bakteriel og eukaryote slægt, der er identificeret i vandet i Metri, Chile, overvåges over fem måneder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Repræsentativt rækkefølgestidspunktsdel, der er fremstillet af 16S rRNA og 18S rRNA-metabarkodning: Alle bakterie- og eukaryoteordrer, der er identificeret i vandet i Metri i Chile, overvåges over fem måneder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel S1 og tabel S2:
Tabel S1: Rådata for figur 5 og figur 6. Tabel S2: Resultat af QC-kontrol af rådata for figur 5 og figur 6. Klik her for at downloade disse tabeller.

Discussion

Denne protokol udførte med succes 18S rRNA og 16S rRNA genmet metabarkodinganalyse for at identificere alge- og bakteriearter i havvandsprøver til overvågning af chilenske HABs. De dominerende alger og nogle mindre alger, der blev opdaget ved denne protokol, var i overensstemmelse med dem, der blev opnået ved mikroskopi, hvilket bekræftede protokollens pålidelighed. Højdepunktet i protokollen er, at analysen opdaget Alexandrium spp. og Pseudochattonella spp., de to mest problematiske HAB forårsager arter i det sydlige Chile, fra havvandet i Metri selv ved en lav overflod. Især Pseudochattonella spp. udfordrer arter til at identificere sig under et mikroskop , fordi cellerne er små og let bristet under lys eller brug af fiksativer27,28. Metabarkodning kan give algearter oplysninger, der næppe er til stede i havvand prøver, at mikroskopi ikke kan identificere. Protokollen opdagede også over 30 bakteriearter. Selv om hvordan disse bakterier er relateret til algevækst er ukendt på dette tidspunkt, massiv dataindsamling af algebakterielle arter i tidsserien analyse vil muligvis give sådanne vigtige opdagelser. Således vil tilføjelse af metabarcoding analyse til de konventionelle chilenske HAB overvågningsprogrammer utvivlsomt styrke den nuværende HAB overvågning effektivitet. Faktisk kan denne visuelle protokol til metabarcoding analyse være gavnligt ikke kun for chilenske vand algebakterielle overvågning, men også for kysten overvågningsprogrammer i andre HAB-ramte områder over hele verden.

Selv om denne protokol gav de ovennævnte fordele, bør ulemperne ved metoden diskuteres. Som det ses i den visuelle protokol, er metabarkodningsmetoden tidskrævende og kompleks, hvilket kræver dyre maskiner og reagenser. Laboratoriepersonalet skal være specielt uddannet, eller det vil spilde materiale, arbejdskraft og tid. Desuden skal algedetektering ved metabarkodning parres med mikroskopi for at kontrollere, at de samme dominerende arter er identificeret ud fra de to ortogonale metoder29. Mikroskopi er for det meste et ikke-invasivt værktøj til at identificere algearter, hvilket betyder, at det er sværere at begå fejl, når algearterne har unikke og tilsyneladende former. Selvfølgelig kan menneskelige fejl opstå, hvis arten har meget lignende former til hinanden. På den anden side, da metabarcoding analyse kræver flere trin, det naturligt øger fejl. Det kunne være en prøve blandet op, forkert reagens tilføjelse, eller mangler nogle procedurer. Derfor er det afgørende at sammenligne metabarcoding-resultaterne med dem, der opnås ved mikroskopi. Endelig gælder protokollen kun kvalitativt, og resultaterne skal beregnes for relativ overflod. Som Lamb et al. sagde i 2019, er den nuværende metabarcoding som den kvantitative ydeevne stadig begrænset, og yderligere forskning er nødvendig, før metabarcoding trygt kan udnyttes til kvantitative applikationer30.

Denne protokol blev optimeret til 140 - 170 prøver pr. løb fra 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation manual udstedt af Illumina Inc. Den optimerede protokol blev testet mange gange og yderligere ændret for at udstede denne endelige version. Derfor anbefales det stærkt at følge hvert trin præcist. Den mest kritiske del af protokollen er, at der kræves ekstra omhu for at undgå prøveforurening. Pipetterne og laminarstrømshætten skal rengøres med 70 % alkohol- og UV-eksponering til enhver tid, og steriliserbare materialer skal autoklaveres. Primere og reagenser skal fortyndes direkte fra bestanden ved hver ny kørsel, eller genbrug af reagenser og eksponering for flere fortyndinger kan være en prøveforureningsårsag. Protokollen angiver, hvornår handlingen kan udføres uden for laminar flow hætten. Medmindre andet er, skal prøverne behandles i en renset laminar flow hætte. Når der beskæftiger sig med flere 8-rør strimler samtidigt, anbefales det at arbejde på den første 8-rørs strimmel og hætte det, før du flytter til den næste 8-rørs strimmel. Hvis låget er åbent i lang tid, kan det forårsage prøveforurening, da 16S- og 18S rRNA-gener er meget allestedsnærværende i omgivelserne. Den angivne tid, såsom blandingstid og inkubationstid, skal følges som nøjagtigt beskrevet, fordi den bedste varighed for hvert trin blev valgt baseret på de mange testkørsler. Overskydende eller utilstrækkelig tid kan f.eks. reducere prøveudbyttet. Processen bør kun standses på den del, at protokollen siger, at det kan stoppe. Det er afgørende at have en negativ kontrol, da det bekræfter, at de positive resultater ikke er kunstige falske positiver. Endelig anbefales det stærkt at planlægge dagene, fordi det kræver mindst fem dage at behandle alle trinene, og nogle dele kan ikke stoppes før det næste stopskilt.

Begrænsningen af taksonomisk tildeling for sekventeret data er kort noteret her. Nyopdagede nukleotidsekvenser for bakterielle og algearter opdateres dagligt i databanken. Mens velopdelte alge- og bakteriearter registreres pålideligt, er der også mange sekvenser for ukendte arter opdateret i databanken. Det indikerer, at opløsningen af registrerede nukleotidsekvenser ikke altid er nok til artsidentifikation, men kun til slægtsidentifikation. Identifikationen af mikroskopiske arter skal således udføres ortogonisk. Oprettelse af en open access-pipeline til dette arbejde har en betydelig fordel i at håndtere et stort sæt sekvenserede data på én gang og effektivt undersøge, hvornår der opstår en fejl. Derudover er outputtet af DADA2 i en tekst- eller csv-fil, hvilket gør det nemt at yderligere statistisk analyse. På den anden side kræves en stor server til at udføre taksonomiske opgaver, især når et datasæt er stort. For at oprette rørledningen er der brug for ingeniører til at oprette rørledningen, og fagfolkene skal forstå parametre, drift, Linux og bioinformatik.

Bortset fra anvendelsesområdet som et HAB-overvågningsværktøj kan brugen af denne protokol udvides til efterforskningsforskningsformål. Der er f.eks. løbende drøftelser mellem den chilenske regering og lokale fiskere samt miljøfredsforeninger om det øgede antal lokale HAB31,32. Regeringen hævder, at det skyldes et naturfænomen som global opvarmning og El Niño, mens de senere parter hævder, at lakseopdræt er årsagen. Laks er ikke en indfødt art i Chile og var ikke i chilensk vand for et halvt århundrede siden. Den chilenske regering havde dengang til formål at skabe vækst i økonomien og skabe arbejdspladser til fattige områder ved at udvikle en laksevirksomhed33. Med intervention fra udlandet for kapital profit, Chile gjort stor succes i pen-stil akvakultur udvikling, og antallet af laks er steget bemærkelsesværdigt i de sidste mange årtier31,32,33. Efterfølgende er en stor mængde laks blevet kastet i havet, hvilket har fået lokalbefolkningen til at mistænke lakseopdræt for at være årsagen til de hyppige lokale HABs31,32. Sandheden er ukendt nu, men det skal forstås i sidste ende, således at strategier til at beskytte det lokale havmiljø, økonomi og menneskers sundhed fra HABs kan udtænkes. Den molekylærbaserede analyse af det lokale algebakterielle forhold kan bidrage til et skridt fremad afklaring for et sådant emne. For eksempel kan teknikken søge alge- og bakteriearter, der ikke var til stede i mål oceaniske område før, men er steget dramatisk i de seneste år, hvilket er noget lig den undersøgelse, som Sakai et al. for opdagelsen af en uregistreret population af Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) af GIS og eDNA analyse34. Derfor har denne metabarkodningsprotokol ud over HAB-overvågningsværktøj den potentielle brug for andre kundeemner.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansieringskilderne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen, i indsamling, analyser eller fortolkning af data; i manuskriptets skrivning eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af bevillingen (JPMJSA1705) til en undersøgelse af Science and Technology Research Partnership for Sustainable Development-Monitoring Algae in Chile (SATREPS-MACH). Vi takker Dr. Sandra Rios (Universidad de Los Lagos) for at give os mulighed for at bruge et filmklip. Vi takker Neal Andrew Holland for hans flittige korrekturlæsning af manuskriptet. Vi udtrykker vores oprigtige påskønnelse til laboratoriegruppens medlemmer på CREAN-IFOP i Puerto Montt, Chile, for at rådgive os om fytoplankton identifikation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL single tube ThermoFisher Q32856 sterile
1.5 mL tubes ThermoFisher 2150N sterile
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap ThermoFisher AB0451 & 4323032 sterile
96-well 0.2 mL PCR plate ThermoFisher N8010560
AccuRuler 100 bp DNA Ladder MaestroGen 02001-500
Chelex 100 Chelating Resin Bio-Rad 1432832
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump MilliporeSigma WP6122050
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583
D1000 sample buffer Agilent Technologies 5067-5602
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) Promega G1881
Ethanol Molecular Biology Grade E7023 Merck KGaA
Filtration device ThermoFisher 09-740-36H, 09-740-23E
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) Thermo Fisher Scientific Q32851
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) ThermoFisher Q33238
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) Agilent Technologies 5067-5582
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) Agilent G2992AA
GelRed Nucleic Acid Gel Stain Biotium 41002
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) Scientific Industries SI-0236
Heat block
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X Roche KK2602
HT1 Hybridization buffer Illumina 20015892
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D Illumina FC-131-2001, -2002, -2003, -2004
Laminar hood cabinet Biobase Co. Biobase PCR-800 PCR Cabinet
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) Agilent Technologies 5067-5598
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) Promega NG2002
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) ThermoFisher AM10027
Micro-seal film for 96-well plate ThermoFisher 4311971 sterile
MiSeq Reagent Kit v3 Illumina MS-102-3003 includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges.
MiSeq system Illumina SY-410-1003 includes pre-installed software
Molecular grade nuclease-free water Integrated DNA Technologies 11-05-01-04
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M Merck KGaA 1091371000
Multichannel pipettes Not specified Not specified
Multi-Purpose Agarose Cleaver Scientific CSL-AG500
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System ThermoFisher D2
Ow EC-105 Compact Power Supply ThermoFisher 105ECA-115
Pellet Pestle— Cordless Motor ThermoFisher K749540-0000
PhiX control Kit v3 Illumina FC-110-300 ready-to-use control library for Illumina sequencing
Pipette tips Not specified Not specified sterile
Pipettes Not specified Not specified 2, 10, 20, 100, 1000 μL
SterivexTM GP 0.22  μm filter unit MilliporeSigma SVGP01050
Tabletop centrifuge Eppendorf 5427R Centrifuge Eppendorf AG
TBE buffer ThermoFisher B52
TE buffer (pH 8.0) ThermoFisher AM9849
Terr PCR Direct FFPE Kit Takara Bio USA 639284 includes 2X Terra PCR Direct Buffer
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL Takara Bio USA 639271 High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) ThermoFisher A37835
TransIlluminator and image capture system Analytik Jena, AG GelDoc-ItTS2 Imager
Whatman 1.0  m pore-sized membrane MilliporeSigma WHA111110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. Global harmful algal bloom status reporting. Harmful Algae. 102, 101992 (2021).
  2. Anderson, D. M. Red Tides. Scientific American. 271 (2), 52-58 (1994).
  3. Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. Algal Bloom and its Economic Impact. , Publications Office of the European Union. (2016).
  4. Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea. Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).
  5. Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean. Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).
  6. Alvarez, G., et al. Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality. Toxins (Basel). 11 (4), (2019).
  7. Clément, A., et al. Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms. Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).
  8. Trainer, V. L., et al. Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes. Harmful Algae. 91, 101591 (2020).
  9. Yarimizu, K., et al. Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).
  10. Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington. Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).
  11. Tweddle, J. F., et al. Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish. Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).
  12. Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. The global complex phenomena of harmful algae blooms. Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).
  13. Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment. Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).
  14. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  15. Amin, S. A., et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria. Nature. 522, 98-101 (2015).
  16. Berdalet, E., et al. Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century. Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).
  17. Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications. Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).
  18. Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nature Reviews Microbiology. 2, 17065 (2017).
  19. Maruyama, F., et al. 16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms. protocol.io. , (2020).
  20. Tanabe, A. S., et al. Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).
  21. Nishitani, G., et al. Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy. Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).
  22. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1 (2013).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2007).
  25. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
  26. Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).
  27. Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta). Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).
  28. Mardones, J. I., et al. Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa. Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).
  29. Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes. Diversity. 13 (5), 180 (2021).
  30. Lamb, P. D., et al. How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach. Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).
  31. Mascareño, A., et al. Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile. Ecology and Society. 23, (2018).
  32. Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons. Marine Pollution Bulletin. 150, 110603 (2020).
  33. Swanson, H. A. Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).
  34. Sakai, Y., et al. Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis. Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).

Tags

Miljøvidenskab Udgave 174 skadelige algeopblomstringer Chile HAB overvågning metabarkodning analyse algebakteriel mutualisme fytoplankton laks akvakultur
En standardiseret procedure til overvågning af skadelige algeopblomstringer i Chile ved metabarcodinganalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yarimizu, K., Fujiyoshi, S., Kawai,… More

Yarimizu, K., Fujiyoshi, S., Kawai, M., Acuña, J. J., Rilling, J. I., Campos, M., Vilugrón, J., Cameron, H., Vergara, K., Gajardo, G., Espinoza-González, O., Guzmán, L., Nagai, S., Riquelme, C., Jorquera, M. A., Maruyama, F. A Standardized Procedure for Monitoring Harmful Algal Blooms in Chile by Metabarcoding Analysis. J. Vis. Exp. (174), e62967, doi:10.3791/62967 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter