Summary
このプロトコルは、16S rRNAおよび18S rRNA遺伝子を標的とするメタバーコーディング分析のステップを導入し、海水サンプル中の有害な藻類の花および関連するマイクロバイオームをモニタリングする。これは強力な分子ベースのツールですが、ここで説明する手順をいくつか必要とします。
Abstract
有害藻類の花(HAB)モニタリングは世界中で実施されており、漁業と養殖で有名なチリは、この目的のために何十年もの間、顕微鏡と毒素の分析を集中的に使用してきました。ハイスループットDNAシーケンシングや細菌集合ベースのアプローチなどの分子生物学的方法は、チリのHABモニタリングで導入され始めたばかりで、その手順はまだ標準化されていません。ここでは、チリのHABsを監視するための16S rRNAおよび18S rRNAメタバーコーディング分析を段階的に導入する。最近の仮説によると、藻類と細菌の相互関係は、花の開始、維持、および回帰を考慮した重要な相乗的または敵対的な関係を果たしています。したがって、藻類細菌の観点からHABをモニタリングすることは、HABメカニズムのより広い理解と早期警告の基礎を提供するかもしれない。メタバーコーディング解析は、サンプル中の巨大な藻類細菌分類情報を検出できるため、この目的に最も適した分子ベースのツールの 1 つです。ここでのメタバーコーディング分析へのサンプリングの視覚的な手順は、エラーを減らし、信頼性の高いデータの収集を目指して、特定の指示を提供します。
Introduction
多くの海洋植物プランクトン種は内因性毒素を産生することが知られており、これらの種が十分な数に蓄積すると、海洋環境に有害である。このような有害な藻類の花(HAB)は、世界の大部分の大陸の海岸で今日観察されています1.有毒植物プランクトンは最初に二枚貝組織に蓄積し、消化時にヒトを含む生物のより高い栄養レベルで病気や死を引き起こします。その後、これらの出来事は、地域経済、社会経済学、公衆衛生に深刻な影響をもたらす2.HABによる世界経済へのダメージは、毎年数百万ドルから数十億ドルと推定されています 3.チリは頻繁にHABに苦しんでいる多くの国の一つです。
チリは長い土地の国で、南北4,300km以上に及ぶ。細長い西部の土地は太平洋に面しており、チリがHABsを経験する可能性が自然に高まります。特にチリ南部には、世界的に有名なサケ養殖が多く、この地域でHABが発生するたびに、藻類毒素は大規模な養殖サケが病気になり、4、5、6を死なせます。チリでは、HABが経済に最も大きな打撃を与えた年は2016年で、年間損失は8億米ドル7,8でした。原因となる有毒藻類種は、年と場所によって異なります。2016年のケースでは、アレクサンドリウム・カタネラとシュードチャットネラ・ヴェルクロサの複合体が、チリ南部の海岸7、8の大部分で広範囲にわたるHABを引き起こした。チリで最も最近のHABは、2021年3月にチリ南部に位置するカマンチャカで、大きなサケ農場があるヘテロシグマ明石ウォの原因藻類種で発生しました。
チリは、2つの主要な方法を使用して、長年にわたって沿岸モニタリングを行ってきました。定期的に有毒藻類種を同定するために、定期的に海水を観察し、生化学的アッセイ9によって貝の毒素レベルを測定する。貝類の有毒藻類および毒素レベルの早期発見は、HABを予防しません。しかし、これらの分析は、直ちに対策を行い、地域社会への損害を減らすことができる。この戦略の有効性をさらに強化するために、最近、従来のチリのHABモニタリングプログラムに、海水サンプル中の藻類および関連細菌群集を検出するための分子ベースの分析方法が追加されました。具体的には、16S rRNAおよび18S rRNA遺伝子を標的とするメタバーコーディングを用いた大規模並列シーケンシング法を選択した。この技術は複雑な手順と高価な機械や試薬を必要としますが、海水サンプル中に存在する何千もの藻類や細菌属/種を一度に検出できる高度な技術です。
HABの原因は、温度や季節など様々であると推測されていますが、それらを一般化することは不可能です。これは、HABの種および周波数は、地理的な独自性、栄養混合、およびエローション2、10、11、12による陸上からの要素流出などの自然現象を含む領域および時空間的条件に依存するためである。さらに、富栄養化などの人工的な要因は、局所的なHABs12、13に影響を与える。複雑な多要素が原因で、正確なHAB予測を行うことは容易ではありません。近年、特定の細菌集団が因子の一つとしてHABsの発達に関連している可能性があるとの見方があり、この仮説を支持する研究が14、15、16、17、18にますます明らかになってきた。分子生物学の技術は、一般的に細菌の集合体を研究するために使用されます。しかし、チリのHABモニタリング9では、このような標準化された方法はまだ確立されていない。HABsとの藻類との関連を研究するには、現在のチリ沿岸モニタリングプログラムのメタバーコーディング分析を同時に行うことが不可欠です。このように、このプロトコルは、メタバーコーディング分析を用いて海水サンプル中の藻類および細菌種の検出を分析するための段階的な手順に焦点を当てて、チリのHABモニタリングプログラムを視覚的に導入しています。
チリのHABモニタリングプログラムを説明する完全なプロトコルは、ヤリミズら9.で入手できます。海水の採取、微細藻類の検出、藻類の遺伝子検出、顔料分析、気象データ収集、物理および化学水特性アッセイの手順が含まれます。藻類および細菌種検出のための16S rRNAおよび18S rRNAメタバーコーディング分析の段階的プロトコルは、プレプリント19として利用可能である。このプロトコルは、HAB モニタリング プログラムの最も複雑な部分とハイライトであるため、特にメタバーコーディングの分析手順を示しています。このプロトコルには、藻類のプログラムおよび顕微鏡検出の導入も含まれる。藻類をメタバーコーディングで分析する場合、2つの方法から結果を検証するために、同時に顕微鏡検査を行うことが重要です。このプロトコルには、分類の割り当てにソフトウェアを使用する方法は含まれていませんが、データベースの推奨事項は、次のセクションの最後に簡単に説明します。
Protocol
1. サンプル収集と前処理
- ターゲットスポットから約3Lの水サンプルを採取します。
- タンデム濾過(1 μmおよび0.2 μmの細孔サイズ膜)を通して16S rRNA分析のための水サンプルのフィルター1 Lは、自由に生きている細菌と付着した細菌を分離する。
- 18S-rRNA分析(植物プランクトン検出)用に、0.2 μm膜を用いた単一の濾過を通して、別の1Lの水サンプルをフィルター処理します。
注:水サンプルのろ過は、サンプリングの12時間以内に完了する必要があります。 - 滅菌手術用はさみで濾過した膜を半分に切り、アルミホイルで包みます。-20°Cで1ヶ月まで保管するか、次のステップに進みます。
- 9. 記載されているとおりに、チェレックス法でDNAを抽出する。-20°Cで1ヶ月まで保管してください。
2. 顕微鏡分析
- 1 mL グリッドスライドに、水サンプル1 mLをピペットで移します。
- 顕微鏡で試料を観察します。
- 植物プランクトン種の名前と量を記録します。
3. 16S rRNAおよび18S rRNAメタバーコーディング分析
注:このプロセスは、調製、最初のPCRアンプリコン生成、第1アンプリコンのクリーンアップ、第2PCRによるインデックス化、第2PCRアンプリコン検証とクリーンアップ、DNA濃度調整、およびDNA変性およびシーケンシングの7つのセクションで構成されています。全体のプロセスは、経験豊富なラボ担当者が 5 日 (40 時間) 以上かかります。製品番号と製造については、 材料表 を参照してください。
- 準備
- 70%エタノールを用いたクリーンピペットとラミナーフードキャビネット、その後30分間のUV暴露を頻繁に行います。使用する材料を殺菌する。
- DNAサンプルを室温で解凍し、遠心分離機を100 x g で2分間解凍し、各サンプル上清の100 μLを8管ストリップに移します。
- 初のPCRアンプリコン生成
注: ラミナー フード キャビネットで次の手順を実行します。プライマー汚染を避けるために、PCR等水で1μMストックからターゲット濃度までプライマーを常に希釈してください。- 反応のために滅菌1.5mLチューブに最初のPCRマスターミックスを準備する(表1、表2)。
- 8チューブストリップにマスターミックスのアリコート22.5 μLを、DNAサンプルの2.5 μLを加えます。負のコントロールにはPCR等水2.5μLを使用してください。
- 最初の PCR サイクルを実行します (表 3)。
- 10 μLの1x核酸ゲル染色を含む2%アガロース-TBEゲル100mLを調製します。
- 1.5 μLの1x DNAローディング色素と4 μLのPCR産物をアガロースゲルにセットします。また、ゲルに100bpのDNAラダーをロードする。
- 100Vで30分間電気泳動を行います。
- UV光画像キャプチャの下に500-600 bpの範囲のバンドがあることを確認してください。プライマーダイマーバンドはラウンド80bpである。
注: 海洋水サンプルには PCR 阻害剤が含まれています。不足しているアンプリコンは、PCR等の水でサンプル1:100または1:1000を希釈することによって解決されることがあります。 - 次のステップまで-20°Cで最初のPCR製品を保管してください。
注意: 1週間を超えるストレージを使用しないでください。
- 最初の PCR アンプリコンのクリーンアップ
注: このセクションは、ラミナーフードキャビネットの外側で実行できます。- 磁気ビーズDNAクリーンアップシステムを使用して、プライマーダイマー製品を含むPCR反応残基を除去します。
- 洗浄した最初のPCR製品の20 μLを新しい96ウェルプレートに移します。マイクロシールフィルムでプレートを密封します。次のステップが進むまで-20°Cで保管してください。
注意: 1 週間を超えるストレージは使用しないでください。
- 2 番目の PCR によるインデックス付け
注: このセクションでは、精製された最初の PCR 製品は、さまざまなインデックスプライマーの組み合わせで増幅されます。- すべてのインデックス1とインデックス2プライマー(表4)を、ラミナーフードキャビネットに入れた8チューブPCRストリップにPCRグレードの水で1μMに希釈します。
注: インデックスプライマーは最初の PCR 反応オーバーハング アダプタに固有であるため、このセクションの手順は、ラミナー フード キャビネットの外側で実行できます。 - 水平行のインデックス1プライマーを縦の行に位置付けインデックス2プライマー(表5)。。
- 新しい96ウェルプレートで、ホットスタート対応製剤を12.5 μLずつ各ウェルに追加します。
- 各インデックスプライマー(1 μM)の2.5 μLを、マルチチャンネルピペットを使用して 表4 に加えます。
- 精製した最初のPCR製品を7.5 μL加えます。
- 上下に10回ピペットを入れ、やさしく混ぜます。マイクロシールフィルムでプレートを覆います。
- 2 回目の PCR サイクルを実行します (表 3)。
- プレートを-20°Cに保ちます。
注意: 1週間を超えるストレージを使用しないでください。
- すべてのインデックス1とインデックス2プライマー(表4)を、ラミナーフードキャビネットに入れた8チューブPCRストリップにPCRグレードの水で1μMに希釈します。
- 2回目のPCRアンプリコン検証とクリーンアップ
- フラグメントアナライザと関連する試薬を使用します。ボルテックスおよびスピンダウン試薬を使用前に。
- サンプルバッファーと DNA スクリーン テープを室温で 30 分間平衡させます。次に、DNAスクリーンテープをフラグメント分析装置に入れます。
- 新しい8つのチューブストリップにサンプルバッファーの2 μLと2番目のPCRアンプリコンの3 μLを混ぜます。8本のチューブストリップをフラグメントアナライザに挿入します。 [実行] を押して開始します。
注意:気泡の形成は避けなければなりません。 - 2番目のPCRアンプリコンは、16Sおよび18S rRNA遺伝子の両方で約613 bp(600-630 bp)であることを確認してください。
- 磁気ビーズDNAクリーンアップシステムを使用して、2番目のPCR製品を精製します。
- DNA濃度調整
- 核酸定量分光光度計を用いて精製された第2PCR産物中のDNA濃度を測定します。
- nMの標的遺伝子濃度を計算し、16Sおよび18S rRNA遺伝子の両方に対して613 bpとして平均最終ライブラリサイズを考慮する:
- 新しい0.2 mL 96ウェルプレートで滅菌PCR水で精製した2番目のPCR製品を希釈します。
メモ: プレートは-20°Cで保存できます。それ以外の場合は、残りの手順を停止せずに実行する必要があります。 - アリコート3 μLの各4 nM秒PCR製品を、プールされたライブラリとして新しい無菌1.5 mLチューブにすべて混合します。チューブは4°Cまたは氷浴で常に保管してください。
- 核酸定量分光光度計を用いて確認するために、プールされたライブラリーの濃度を測定します。4 nMより高い場合は、濃度を4 nMに調整します。
注:濃縮されたDNAは、推定値の読み取り数を生成し、分析を妨げます。
- DNAの変性とシーケンシング
注:このセクションでは、特定の試薬とイルミナMiSeqシステムを使用しています。 「部品表」の製品番号を参照してください。
注意:厳密に時間に従ってください。シーケンスの日にカートリッジを除くすべての試薬を解凍します。- シーケンシングの前日に、事前に充填された既製の試薬カートリッジを-20°Cから取り出し、解凍のために4°Cで保管します。
- 1.5 mL 遠心管に適したヒートブロックを96°Cに設定します。
- ハイブリダイゼーションバッファーを氷の上に置きます。
- PCRグレードの水を用いた新しいチューブで、分子グレードのNaOHを1 Nから0.2 Nに希釈します。
- TE バッファ(pH 8.0)を備えたすぐに使用できるコントロールライブラリを新しいチューブ(2 μLの制御ライブラリ + TE バッファの 3 μL)に 10 nM から 4 nM まで希釈します。
- 「1」とラベル付けされた新しいチューブに4 nMの制御ライブラリの4 μLと4 nMプールされたサンプルライブラリの16 μLを混ぜます。
- 「2」とラベル付けされた新しいチューブに、10 μLの0.2 N NaOHをチューブ"1"に10 μL混ぜます。
- チューブ2を5sにボルテックスし、短時間スピンダウンし、室温で5分間インキュベートする。
- チューブ2に980μLのハイブリダイゼーションバッファを加えます。
- 「3」とラベル付けされた新しいチューブで、チューブ2からのサンプルを390 μLのハイブリダイゼーションバッファと混ぜます。チューブを反転して混ぜます。
- チューブ3を96°Cで2分間インキュベートし、すぐに氷の上に最大2分間置きます。
- 4 °Cの冷蔵庫からカートリッジを取り外します。
- 表 6のように、対応する各インデックス 1 アダプタとインデックス 2 アダプタを使用して、シーケンス用のサンプル シートを設定します。
- MiSeq v3キットからフローセルを取り外します。滅菌分子グレードのPCR水でフローセルを静かに洗浄します。
注:フローセルの毛細管の点に水を注がないでください。繊維質でない紙でフローセルから水を静かに拭き取ります。 - チューブ3(650 μL)の全容をカートリッジに積み込みます。
- 計測器操作ソフトウェアで、シーケンスを選択し、指示に従います。フローセル、取込みバッファ、カートリッジを挿入します。サンプルシートをロードします。 実行 を押して、反応を開始します。
注: このシーケンスの実行には 3 ~ 5 日かかります。データは自動的に Basespace プラットフォームにアップロードされます。生データは、コンピュータの2つのフォルダに保存されます: fastqファイルを含む分析フォルダとbclファイルとjpeg画像を含む出力。
4.優先順位データへの分類の割り当て
- ファストQ ファイル処理
注: R24の DADA2 パッケージ23 FASTQ ファイルを処理する推奨データベースの 1 つです。ガイドラインは[https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]で入手できます。このガイドラインは、最近のバージョンのDADA2パイプラインチュートリアル[https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html]を採用して作成されました。- 加工プログクォンクのペアエンドシーケンスを加工して、トリミング、品質フィルタリング、非レプリケーション、ユニークシーケンスの逆行とカウント、サンプル推論、コンティグへのマージ、およびキメラシーケンスの除去を行います。
- 16S rRNA および 18S rRNA 遺伝子フラグメントの両方に対して、以下の DADA2 指定されたパラメーターを使用します。トリムレフト=0、0、truncLens=[シーケンスの品質を確認し、適切な長さに設定]。
注: 他のパラメーターのデフォルト値は、maxN=0、maxEE=2、trancQ=2 です。
- 分類の割り当て
注: DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gzの分類の割り当てには、デフォルトとして設定されている SILVA rRNA データベースが推奨されます。- 16S rRNA遺伝子断片解析のために葉ロプラストとミトコンドリアOTUsを除去します。16S rRNAおよび18S rRNA分析からシングルトンを除去します。
- 最も低いシーケンス深度を持つサンプルに基づいて、すべてのサンプルをシーケンシング深さに均等にします。
- 読み取り数、OTUs、およびどのレベルで、フィルター処理された読み取り、および除外されたシングルトンの数を記録します。
- 統計分析
- フィロース25 とビーガン26のRパッケージを使用して微生物データに対する統計解析を行う。
Representative Results
このプロトコルは、18S rRNA遺伝子メタバーコーディング分析を使用して、海水サンプル中の藻類種を同定します。 図1に示す結果は、2019年2月19日にチリのプエルトモント州メトリから集められた海水(−41.597;−72.7056)をこのプロトコルで分析した。その結果、海水サンプル中に30種以上の藻類を含む合計13,750回の読み取り値が示された。このサンプルの支配的な藻類は ナビキュラ・スプでした。70.77%の相対的な豊富さ。また、 マイクロモナス (6.40%)、 チャエトセロス属 (4.44%)、 スクリプシエラ属 (2.44%)、 プロロセントラム属に対して十分な量が観察された。(1.28%).シュー ドチャットネラsppは、チリのHABの最も高い有毒藻類の原因の一つであり、この海水サンプルから0.52%で検出された。
データ信頼性を検証するために、18S rRNA遺伝子解析によって同定された藻類種を、同じ海水サンプル中の顕微鏡検査で得られたものと比較した(図2)。18S rRNA遺伝子解析と一致して、顕微鏡検査は、支配的な種が ナビキュラ属である。相対的な存在量は74.1%、 プロロセントラムは マイナー種として(0.60%)。逆に、顕微鏡観察から記録された ヘテロカッサ属 (9.04%)は、このサンプルでは18S rRNA遺伝子解析によって同定されなかった。顕微鏡で記録された、識別できない植物プランクトン細胞の周りに小さいの12.6%があった。これは、18S rRNAの結果によると、 マイクロモナスである可能性があります。
このプロトコルは、16S rRNA遺伝子メタバーコーディング分析を使用して、海水サンプル中の細菌種を同定します。 図3に、18S rRNA遺伝子解析に使用した同じ海水を16S rRNA遺伝子解析で分析した代表的な結果を示す。その結果、海水サンプル中に30種以上の細菌種を含む合計31,758回の読み取りが見られた。この海水サンプルは、結合細菌から自由に生きている細菌を分離するためにタンデムフィルター膜(1 μmおよび0.2 μmの細孔サイズ)を通して通過したことを概説する必要があります。次いで、各フィルター膜によって捕捉された細胞をDNA抽出のために処理し、続いて16S rRNA遺伝子解析を行った。 図3 の代表的な結果は、自由に生きている細菌として定義された0.2μmの孔サイズ膜から同定された細菌種を示す。支配的な自由生物細菌は、20.02%の相対的な豊富さで アミリバクターspp. であり、 クレード・イア (13.53%)と アリギフィラス属が続いた。(7.06%).この海水サンプルから検出された細菌種の残りの部分は比較的均等に分布していた。同じ分析は、1 μmの細孔サイズの膜で捕捉された細胞を、付加細菌種検出として行うことができます。
これらのメタバーコーディングアッセイが一定の研究期間にわたってスケジュールされた時点で実行される場合、結果は時系列分析として要約することができる。それを行う1つの方法は、ユニークな成長パターンを見つけるために時間の関数として特定の藻類および細菌種の相対的な豊富さをプロットすることです。 図4 は、チリのメトリにある アレクサンドリウム と シュードチャットネラ の代表的な時系列プロットを示しています。時系列メタバーコーディング分析を要約するもう1つの方法は、同定されたすべての藻類および細菌を時間の関数としてプロットし、特定の群の生物の集団変化を表す。 図5 および 図6 は、5ヶ月間にメトリの海水から検出された全細菌属および順序の相対的な存在量を要約する。
表1:最初のPCRマスターミックスコンテンツ: 表は16S rRNAおよび18S rRNAの分析のための反応ごとのマスターミックスの内容を示す。プライマー配列を表 3 に示します。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2: プライマーシーケンス: 最初の PCR 用のプライマーは、16S rRNA および 18S rRNA 分析用にリストされています。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 3: PCR サイクル: 最初の PCR および 2 番目の PCR の熱サイクルを示します。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 4: インデックスシーケンス: 第2PCRに使用するインデックス1(i7)およびインデックス2(i5)プライマーがリストされている。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 5: 索引 1 および索引 2 の位置の例: 誤差を減らすためには、インデックスプライマーを最初の位置に配置し、各アリコートをマルチチャンネルピペットを使用して96ウェルプレートに移す必要があります。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表6:サンプルシートの例: シーケンス処理の前に、サンプル・シートを作成する必要があります。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図1:18S rRNAメタバーコーディング解析の代表的な結果 :2019年2月19日にチリのロスラゴスのメトリから採取した海水サンプル中に存在する藻類種を、18S rRNAメタバーコーディングアッセイで同定した。「不明」が割り当てられた配列から排除され、同定された各種の相対的な存在量がプロットされた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:顕微鏡分析の代表的な結果:2019 年2月19日にチリのロスラゴスのメトリからの水サンプルから、藻類の種を顕微鏡で同定した。各種の量を手動で数え、プロットした。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:16S rRNAメタバーコーディング解析の代表的な結果 :2019年2月19日にチリのロスラゴスのメトリから水サンプルに存在する細菌種を、16S rRNAメタバーコーディングアッセイで同定した。各同定された種の相対的な存在量をプロットした。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:チリ・メトリの18S rRNAメタバーコーディングから得られた Alexandrium spp.およびシュードチャットネラspp. の代表的な時系列プロット:Yarimizu ら9から転載された図。 アレクサンドリウム と シュードチャットネラ の2つの有毒藻類種は、時間の経過とともに18S rRNA分析によって選択的に監視され、相対的な存在量は時間ポイントの関数としてプロットされた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:16S rRNAおよび18S rRNAメタバーコーディングから得られた代表的な属時系列プロット: チリのメトリの水中で同定されたすべての細菌および真核生物属は、5ヶ月にわたって監視された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:16S rRNAおよび18S rRNAメタバーコーディングから得られた代表的な時系列プロット: チリのメトリの水中で同定されたすべての細菌および真核生物の注文は、5ヶ月にわたって監視された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 S1 および 表 S2:
表 S1: 図 5 および 図 6の生データ。表S2: 図5 と 図6の生データに対するQCチェックの結果。 これらのテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、チリのHABsを監視するための海水サンプル中の藻類および細菌種を同定するために、18S rRNAおよび16S rRNA遺伝子メタバーコーディング分析を成功させた。このプロトコルによって検出された優勢な藻類およびいくつかのマイナー藻類は、顕微鏡検査によって得られたものと一致し、プロトコルの信頼性を確認した。プロトコルのハイライトは、分析がアレクサンドリウムspp.と疑似チャットネラspp.、チリ南部で種を引き起こす2つの最も問題のあるHABを検出したことです。特に、シュードチャットネラspp。細胞は小さく、光の下で容易に破裂するか、または固定剤27、28の使用であるので、顕微鏡下で識別する挑戦的な種です。メタバーコーディングは、顕微鏡では識別できない海水サンプルにはほとんど存在しない藻類種情報を提供することができます。プロトコルはまた、30以上の細菌種を検出しました。これらの細菌が藻類の増殖にどのように関連しているかは現時点では不明であるが、時系列分析における藻類細菌種の大量データ収集は、おそらくそのような重要な発見を提供するだろう。従って、従来のチリのHABモニタリングプログラムにメタバーコーディング分析を加えることは、間違いなく現在のHABモニタリング効率を強化するだろう。実際、メタバーコーディング解析のためのこの視覚的なプロトコルは、チリの水の藻類細菌モニタリングだけでなく、世界中の他のHABの影響を受けた地域の海岸監視プログラムにも有益です。
このプロトコルは上記の利点を提供しましたが、メソッドの欠点を説明する必要があります。視覚的なプロトコルに見られるように、メタバーコーディング方法は時間と複雑であり、高価な機械および試薬を必要とする。研究室の職員は特別な訓練を受ける必要があり、材料、労力、時間を無駄にします。また、メタバーコーディングによる藻類検出は、2つの直交方法29から同じ支配的種が同定されることを検証するために顕微鏡法と対にする必要がある。顕微鏡は非侵襲的なツールであり、ほとんどの場合、藻類種を同定するため、藻類種がユニークで見かけの形状を有する場合に間違いを犯すのは難しい。もちろん、種が互いに非常によく似た形状を持っている場合、人為的ミスが発生する可能性があります。一方、メタバーコーディング解析は複数のステップを必要とするため、自然にエラーが増加します。サンプルが混ざり合ったり、試薬が添加されなくなったり、いくつかの手順が欠落している可能性があります。したがって、メタバーコーディング結果と顕微鏡で得られた結果を比較することが重要です。最後に、プロトコルは定性的にのみ適用され、結果は相対的な豊富さのために計算されなければなりません。2019年に述べたように、現在のメタバーコーディングは量的性能としては依然として限られており、メタバーコーディングを定量的なアプリケーション30に確実に利用するには追加の研究が必要である。
このプロトコルは、Illumina Inc.が発行した16Sメタゲノムシーケンシングライブラリ準備マニュアルから、1回あたり140〜170サンプルに最適化されました。最適化されたプロトコルは何度もテストされ、この最終バージョンを発行するようにさらに変更されました。したがって、各ステップを正確に行うことを強くお勧めします。プロトコルの最も重要な部分は、サンプル汚染を避けるために特別な注意が必要です。ピペットとラミナーフローフードは、常に70%のアルコールとUV暴露で洗浄する必要があり、滅菌可能な材料はオートクレーブする必要があります。プライマーと試薬は、新しい実行ごとにストックから直接希釈する必要があります、 または試薬の再利用といくつかの希釈への暴露は、サンプル汚染の原因となり得ます。プロトコルは、操作が層流フードの外側で行うことができる場合を指定します。特にそうでない限り、サンプルは洗浄された層流フードで処理する必要があります。同時に複数の8管ストリップを扱うとき、それは次の8管ストリップに移動する前に最初の8管ストリップとキャップでそれを動作することを推奨します。16Sおよび18S rRNA遺伝子は周囲で非常にユビキタスであるとして、蓋を長い間開いたままにしてサンプル汚染を引き起こす可能性があります。各ステップの最良の持続時間は、複数のテスト実行に基づいて選択されたため、記載された時間(混合時間およびインキュベーション時間など)は正確に記述されるべきである。過剰または不十分な時間は、例えば、サンプル収量を減少させることができる。プロセスは、プロトコルが停止できると言う部分でのみ停止する必要があります。肯定的な結果が人工的な偽陽性ではないことを確認するので、否定的なコントロールを持つことは重要です。最後に、すべての手順を処理するのに少なくとも 5 日を要し、次の停止標識まで一部のパーツを停止できないため、日を計画することを強くお勧めします。
順序付きデータに対する分類的割り当ての制限については、ここで簡単に説明します。細菌および藻類種に対して新たに発見されたヌクレオチド配列は、毎日データバンクで更新される。よく研究された藻類や細菌種が確実に登録されている一方で、データバンクで更新された未知の種のための多くの配列もあります。登録されたヌクレオチド配列の分解能は、種同定のためではなく、属の同定に対してのみ十分であることを示している。したがって、微視的な種の同定は、直交的に行われなければならない。この作業にオープン アクセス パイプラインを確立すると、大量のシーケンスデータを一度に処理し、エラーが発生した場合に効率的に調査を行う場合に大きな利点があります。さらに、DADA2 の出力はテキストまたは csv ファイルに含まれるため、より簡単に統計分析を行うことができます。一方、特にデータセットが大きい場合は、分類の割り当てを実行するために大規模なサーバーが必要です。パイプラインを設定するには、エンジニアがパイプラインを設定する必要があり、専門家はパラメータ、操作、Linux、バイオインフォマティクスを理解する必要があります。
HAB 監視ツールとしての範囲を除いて,このプロトコルの使用は調査研究目的のために拡張することができる。例えば、チリ政府と地元の漁師と環境平和協会との間で、地元のHAB31,32の増加に関する議論が続いている。政府は、地球温暖化やエルニーニョなどの自然現象によるものだと主張し、後の当事者はサケ養殖が原因であると主張している。サケはチリの先住民族ではなく、半世紀前にチリの水にはありませんでした。当時のチリ政府は、サケ事業33を発展させることで、経済を成長させ、貧困地域の雇用を創出することを目指した。海外からの資本利益の介入により、チリはペンスタイルの養殖開発で大きな成功を収め、ここ数十年でサケの数は31、32、33で著しく増加しました。その後、サケ用の大量の食品が海に投げ込まれ、地元の人々はサケ養殖が頻繁に地元のHAB31,32の理由であると疑う。真実は今では不明ですが、最終的には、地元の海洋環境、経済、人間の健康をHABから保護するための戦略を考案できるように理解する必要があります。局所的な藻類と細菌の関係に関する分子ベースの分析は、そのような対象に対する一歩前進的な明確化に寄与し得る。例えば、この技術は、標的海洋地域に存在しなかったが、近年劇的に増加している藻類および細菌種を探索することができ、これは、GISおよびeDNA分析34によるヤマトサンショウダー(ヒノビウス・ヴァンデンブルギ)の未記録集団の発見に関する堺らの研究とやや類似している。したがって、HAB 監視ツールを超えて、このメタバーコーディング プロトコルは、他の見込み客の潜在的な使用法を持っています。
Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。資金提供者は、研究の設計、データの収集、分析、または解釈において何の役割も持っていませんでした。原稿の執筆、または結果を公表する決定に含まれる。
Acknowledgments
この研究は、チリの持続可能な開発モニタリング藻類のための科学技術研究パートナーシップ(SATREPS-MACH)に関する研究のための助成金(JPMJSA1705)によって支持されました。サンドラ・リオス博士(ロス・ラゴス大学)が映画クリップを使ってくれたことに感謝します。私たちは、ニール・アンドリュー・ホランドが原稿の勤勉な校正に感謝します。チリのプエルトモントにあるCREAN-IFOPの研究室グループメンバーに心から感謝申し上げます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
| 1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
| 8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
| 96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
| AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
| Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
| Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
| DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
| Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
| Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
| Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
| Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
| Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Heat block | |||
| High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
| HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
| Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
| Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
| Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
| Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
| Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
| Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
| Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
| Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
| Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
| Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
| Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
| Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
| PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
| Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
| Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
| SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
| TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
| TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
| Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
| ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
| TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
| Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |
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