Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En standardisert prosedyre for overvåking av skadelige algeoppblomstringer i Chile ved metabarkodingsanalyse

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62967
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3, 4, 5, 6, 6, 4, 4, 7, 5, 3, 1
1Office of Research and Academia-Government-Community Collaboration, Hiroshima University, 2Graduate School of Human and Environmental Studies, Kyoto University, 3Scientific and Biotechnological Bioresource Nucleus, Universidad de La Frontera, 4Centro de Estudios de Algas Nocivas, Instituto de Fomento Pesquero, 5Ciencias del Mar y Recursos Biologicos, Universidad de Antofagasta, 6Departamento de Ciencias Biológicas y Biodiversidad, Universidad de Los Lagos, 7Japan Fisheries Research and Education Agency, Fisheries Resources Institute

Summary

Denne protokollen introduserer trinn for metabarkodingsanalyse, rettet mot 16S rRNA- og 18S rRNA-gener, for overvåking av skadelige algeoppblomstringer og deres tilhørende mikrobiom i sjøvannsprøver. Det er et kraftig molekylært basert verktøy, men krever flere prosedyrer, som forklares visuelt her trinn for trinn.

Abstract

Overvåking av skadelige alger (HAB) har blitt implementert over hele verden, og Chile, et land kjent for sine fiskerier og akvakultur, har intensivt brukt mikroskopiske og toksinanalyser i flere tiår for dette formålet. Molekylære biologiske metoder, som DNA-sekvensering med høy gjennomstrømning og bakterielle sammenstillingsbaserte tilnærminger, begynner bare å bli introdusert i chilensk HAB-overvåking, og prosedyrene er ennå ikke standardisert. Her innføres 16S rRNA og 18S rRNA metabarkodingsanalyser for overvåking av chilenske HAB-er trinnvis. Ifølge en nylig hypotese spiller algebakteriell gjensidig forening et kritisk synergetisk eller antagonistisk forhold som står for gjenoppblomstring, vedlikehold og regresjon. Overvåking av HAB fra algebakterielle perspektiver kan dermed gi en bredere forståelse av HAB-mekanismer og grunnlaget for tidlig varsling. Metabarkodingsanalyse er et av de best egnede molekylærbaserte verktøyene for dette formålet fordi det kan oppdage massiv algebakteriell taksonomisk informasjon i en prøve. De visuelle prosedyrene for prøvetaking til metabarkodingsanalyse heri gir spesifikke instruksjoner, med sikte på å redusere feil og innsamling av pålitelige data.

Introduction

Mange marine planteplanktonarter er kjent for å produsere endogene giftstoffer, og når disse artene akkumuleres i tilstrekkelig antall, er de skadelige for det marine miljøet. Slike skadelige algeoppblomstringer (HAB) observeres i dag på kysten av de fleste kontinenter i verden1. Giftig planteplankton akkumuleres først i bivalvevev, noe som fører til sykdom og død i høyere trofiske nivåer av organismer, inkludert mennesker, ved fordøyelsen. Deretter gir disse hendelsene alvorlige konsekvenser for den lokale økonomien, sosioøkonomi og folkehelse2. Skadene på den globale økonomien forårsaket av HAB-er anslås å være millioner til milliarder av dollar hvert år3. Chile er et av mange land som lider av hyppige HAB-er.

Chile er et land med langt land som strekker seg over 4300 km nord og sør. Det langstrakte vestlige landet vender mot Stillehavet, noe som naturlig øker sjansene for at Chile opplever HAB-er. Spesielt i Sør-Chile er det mange verdensberømte lakseoppdrett, og hver gang en HAB oppstår i regionen, resulterer algetoksinene i massiv oppdrettslaks som blir syk og dør4,5,6. I Chile, året da HAB rammet økonomien hardest var 2016, med et estimert årlig tap på US $ 800 millioner7,8. De forårsakende giftige algeartene varierer etter år og sted. For 2016-saken forårsaket et kompleks av Alexandrium catanella og Pseudochattonella verruclosa en utbredt HAB i det meste av den sørlige chilenske kysten7,8. Den siste HAB i Chile skjedde med de forårsakende algeartene til Heterosigma Akashiwo i mars 2021 ved Camanchaca, som ligger sør i Chile, hvor området har en stor lakseoppdrett.

Chile har gjennomført kystovervåking i mange år ved hjelp av to hovedmetoder; observere sjøvann med mikroskoper for å identifisere giftige alger arter regelmessig og måle toksinnivåer i skalldyr ved biokjemiske analyser9. Tidlig påvisning av giftige alger og toksinnivåer i skalldyr forhindrer ikke HAB; Disse analysene kan imidlertid utløse umiddelbare mottiltak og redusere skader på lokalsamfunnene. For ytterligere å styrke effektiviteten av denne strategien ble en molekylærbasert analytisk metode nylig lagt til vårt konvensjonelle chilenske HAB-overvåkingsprogram for å oppdage alger og relaterte bakteriesamfunn i sjøvannsprøver. Nærmere bestemt ble det valgt en massiv parallell sekvenseringsmetode ved hjelp av metabarkoding som er rettet mot 16S rRNA- og 18S rRNA-gener. Selv om denne teknikken krever kompliserte prosedyrer og dyre maskiner og reagenser, er det en avansert teknologi som kan oppdage tusenvis av alger og bakterier slekter / arter som er tilstede i en sjøvannsprøve samtidig.

Årsakene til HAB spekuleres i å være forskjellige, for eksempel temperatur og sesong, men det er umulig å generalisere dem. Dette skyldes at HAB-arter og frekvenser avhenger av regionen og romlige forhold, som involverer naturfenomener som geografisk unikhet, oppstrømning av næringsblanding og elementavrenning fra land på grunn av errosion2,10,11,12. I tillegg påvirker kunstige faktorer som eutrofiering lokaleHAB-er 12,13. På grunn av den komplekse multifaktoren er det ikke lett å lage en nøyaktig HAB-prediksjon. De siste årene er det en oppfatning at spesifikke bakteriepopulasjoner kan være relatert til utviklingen av HAB som en av faktorene, og forskning for å støtte denne hypotesen har blitt stadig tydeligere14,15,16,17,18. Molekylærbiologiske teknikker brukes vanligvis til å studere bakteriell montering; En slik standardisert metode er imidlertid ennå ikke etablert i chilensk HAB-overvåking9. For å studere algebakteriell tilknytning til HAB er det viktig å samtidig utføre metabarkodingsanalyse for de nåværende chilenske kystovervåkingsprogrammene. Dermed introduserer denne protokollen visuelt vårt chilenske HAB-overvåkingsprogram, med fokus på en trinnvis prosedyre for å analysere deteksjon av alger og bakterier i sjøvannsprøver ved hjelp av metabarkodingsanalyse.

Den fullstendige protokollen som beskriver vårt chilenske HAB-overvåkingsprogram er tilgjengelig i Yarimizu et al.9. Det inkluderer prosedyrene for sjøvannsprøvetaking, mikroskopisk algeartdeteksjon, algebakteriell gendeteksjon, pigmentanalyse, meteorologisk datainnsamling og fysiske og kjemiske vannegenskapsanalyser. Den trinnvise protokollen for 16S rRNA og 18S rRNA metabarkodingsanalyse for alge- og bakteriearter er tilgjengelig som preprint19. Denne protokollen demonstrerer spesielt metabarkodingsanalysetrinn siden det er den mest kompliserte delen og høydepunktet i vårt HAB-overvåkingsprogram. Denne protokollen inkluderer også en introduksjon av programmet og mikroskopideteksjon av algearter. Ved analyse av algearter ved metabarkoding er det avgjørende å samtidig utføre mikroskopi for å verifisere resultatene fra de to metodene. Denne protokollen inkluderer ikke hvordan du bruker programvare til taksonomitilordning, men databaseanbefaling er kort angitt på slutten av delen nedenfor.

Protocol

1. Prøveinnsamling og forbehandling

  1. Samle ca 3 L vannprøve fra målstedet.
  2. Filter 1 L vannprøve for 16S rRNA-analyse gjennom en tandemfiltrering (1 μm og 0,2 μm pore-størrelse membran) for å skille frittlevende og vedlagte bakterier.
  3. Filtrer ytterligere 1 L vannprøve for 18S-rRNA-analyse (planteplanktondeteksjon) gjennom en enkelt filtrering med en 0,2 μm membran.
    MERK: Filtrering av vannprøven må fullføres innen 12 timer etter prøvetaking.
  4. Klipp filtrert membran i halvparten med steril kirurgisk saks og pakk den med aluminiumsfolie. Oppbevars ved -20 °C i opptil 1 måned eller går videre til neste trinn.
  5. Trekk ut DNA med Chelex-metoden som beskrevet9. Oppbevars ved -20 °C i opptil 1 måned.

2. Mikroskopanalyse

  1. Overfør 1 ml av vannprøven med en pipette på en 1 ml gittersklie.
  2. Vær oppmerksom på prøven under et mikroskop.
  3. Registrer navn og mengde planteplanktonarter.

3. 16S rRNA og 18S rRNA metabarkodingsanalyse

MERK: Denne prosessen består av syv seksjoner: forberedelse, første PCR-amplikongenerering, første amplikonopprydding, indeksering etter andre PCR, andre PCR-amplikonverifisering og opprydding, DNA-konsentrasjonsjustering og DNA-denaturering og sekvensering. Hele prosessen tar minst 5 dager (40 timer) av et erfarent laboratoriepersonell. Se Materialtabellen for produktnumre og produksjoner.

  1. Forberedelse
    1. Rengjør pipetter og laminært hetteskap med 70% etanol etterfulgt av UV-eksponering i 30 minutter ofte. Steriliser materialer som skal brukes.
    2. Tine DNA-prøver ved romtemperatur, sentrifuge ved 100 x g i 2 min, og overfør 100 μL av hver prøve supernatant til 8-rørs strimler.
  2. Første PCR-amlikongenerasjon
    MERK: Utfør følgende prosedyrer i et laminært hetteskap. Fortynn alltid primere fra 1 μM lager til målkonsentrasjonen med PCR-klasse vann for å unngå primerforurensning.
    1. Forbered første PCR master mix i et sterilt 1,5 ml rør for reaksjoner (Tabell 1, Tabell 2).
    2. Aliquot 22,5 μL av masterblandingen i en 8-rørs stripe og tilsett 2,5 μL DNA-prøve. Bruk 2,5 μL PCR-vann for negativ kontroll.
    3. Kjør den første PCR-syklusen (Tabell 3).
    4. Forbered 100 ml 2% Agarose-TBE gel som inneholder 10 μL 1x nukleinsyregelflekk.
    5. Last en blanding av 1,5 μL 1x DNA-lastfargestoff og 4 μL PCR-produkt på agarosegelen. Last også 100 bp DNA-stige på gelen.
    6. Utfør elektroforese ved 100 V i 30 min.
    7. Kontroller at det er et bånd med en rekkevidde på 500-600 bp under et UV-lysbildeopptak. Primer-dimer bånd er runde 80 bp.
      MERK: Marine vannprøver inneholder PCR-hemmere. Manglende amlikoner kan noen ganger løses ved å fortynne prøver 1:100 eller 1:1000 med PCR-klasse vann.
    8. Oppbevar de første PCR-produktene ved -20 °C til neste trinn.
      FORSIKTIG: Ikke overskrid én ukes lagringsplass.
  3. Første PCR-amplikonopprydding
    MERK: Denne delen kan utføres utenfor et laminært hetteskap.
    1. Bruk magnetiske perler DNA opprydding system for å fjerne PCR reaksjon rester, inkludert primer-dimer produkter.
    2. Overfør 20 μL av hvert renset første PCR-produkt til en ny 96 brønnplate. Forsegle platen med en mikroforseglingsfilm. Oppbevars ved -20 °C til neste trinn fortsetter.
      FORSIKTIG: Ikke overskrid mer enn én ukes lagringsplass.
  4. Indeksering etter andre PCR
    MERK: I denne delen vil rensede første PCR-produkter bli forsterket med ulike indeksprimerkombinasjoner.
    1. Fortynn alle Index 1 og Index 2 primere (Tabell 4) til 1 μM med PCR-klasse vann i 8 rør PCR-strimler plassert i et laminært hetteskap.
      MERK: Trinnene heretter i denne delen kan utføres utenfor et laminært hetteskap, da indeksprimere er spesifikke for de første PCR-reaksjonene overhengsadapter.
    2. Plasser Index 1 primer i en vannrett rad Index 2 primere i en loddrett rad (Tabell 5).
    3. I en ny 96-brønns plate, tilsett 12,5 μL varmstartklar formulering til hver brønn.
    4. Tilsett 2,5 μL av hver indeksprimer (1 μM) i hver brønn og i tabell 4 ved hjelp av en flerkanals pipette.
    5. Tilsett 7,5 μL renset første PCR-produkt.
    6. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned 10 ganger. Dekk platen med en mikroforseglingsfilm.
    7. Kjør den andre PCR-syklusen (Tabell 3).
    8. Hold platen ved -20 °C.
      FORSIKTIG: Ikke overskrid én ukes lagringsplass.
  5. Andre PCR-amplikonverifisering og -opprydding
    1. Bruk en fragmentanalysator og tilhørende reagens. Virvel og spin ned reagens før bruk.
    2. La prøvebufferen og DNA-skjermbåndet likevekte ved romtemperatur i 30 minutter. Plasser deretter DNA-skjermbåndet i en fragmentanalysator.
    3. Bland 2 μL prøvebuffer og 3 μL andre PCR-amplikon i nye 8 rørstrimler. Sett de 8 rørstrimlene inn i fragmentanalysatoren. Trykk Kjør for å starte.
      FORSIKTIG: Dannelsen av luftbobler må unngås.
    4. Kontroller at andre PCR-amfilon er ca. 613 bp (600 - 630 bp) for både 16S- og 18S rRNA-gener.
    5. Rens andre PCR-produkter ved hjelp av et magnetisk perler DNA-oppryddingssystem.
  6. JUSTERING AV DNA-konsentrasjon
    1. Mål DNA-konsentrasjonen i de rensede andre PCR-produktene ved hjelp av et nukleinsyrekvartifiseringsspektrofotometer.
    2. Beregn målgenkonsentrasjon i nM, som utgjør den gjennomsnittlige endelige bibliotekstørrelsen som 613 bp for både 16S- og 18S rRNA-gener:
      Equation 1
    3. Fortynn hvert rensede andre PCR-produkt med sterilt PCR-vann til 4 nM i en ny 0,2 ml 96 brønnplate.
      MERK: Platen kan oppbevares ved -20 °C her. Ellers må resten av prosedyrene utføres uten å stoppe.
    4. Aliquot 3 μL av hvert 4 nM andre PCR-produkt og bland alt i et nytt sterilt 1,5 ml rør som et samlet bibliotek. Hold røret ved 4 °C eller på isbad til enhver tid.
    5. Mål konsentrasjonen av det samlede biblioteket for bekreftelse ved hjelp av et spektrofotometer for nukleinsyre. Juster konsentrasjonen til 4 nM hvis den er høyere enn 4 nM.
      MERK: Overkonsentrert DNA produserer overvurderte lesetall, noe som hemmer analysen.
  7. DNA-denaturering og sekvensering
    MERK: Denne delen bruker Illumina MiSeq-systemet med spesifikke reagenser. Se produktnumre i Materialliste.
    MERK: Følg tiden nøye. Tine alle reagenser unntatt patroner på sekvenseringsdagen.
    1. En dag før sekvensering, fjern en ferdigfylt reagenspatron klar til bruk fra -20 °C og oppbevar den ved 4 °C for opptining.
    2. Sett en varmeblokk egnet for 1,5 ml sentrifugerør til 96 °C.
    3. Plasser hybridiseringsbufferen på is.
    4. Fortynn molekylær klasse NaOH fra 1 N til 0,2 N i et nytt rør med PCR-klasse vann.
    5. Fortynn et kontrollbibliotek som er klart til bruk, med TE-buffer (pH 8,0) fra 10 nM-lager til 4 nM i et nytt rør (dvs. 2 μL kontrollbibliotek + 3 μL TE-buffer).
    6. Bland 16 μL av 4 nM samlet prøvebibliotek med 4 μL 4 nM kontrollbibliotek i et nytt rør merket "1".
    7. Bland 10 μL prøve i rør "1" med 10 μL 0,2 N NaOH i et nytt rør merket "2".
    8. Virvel røret 2 i 5 s, spinn kort ned og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
    9. Tilsett 980 μL hybridiseringsbuffer i rør 2.
    10. I et nytt rør merket "3", bland 260 μL prøven fra rør 2 med 390 μL hybridiseringsbuffer. Bland ved å invertere røret.
    11. Inkuber rør 3 ved 96 °C i 2 minutter og plasser det umiddelbart på is i maksimalt 2 minutter.
    12. Fjern patronen fra 4 °C kjøleskap.
    13. Definer eksempelarket for sekvensering med hver tilsvarende indeks 1 og indeks 2-kort som i tabell 6.
    14. Fjern flytcellen fra MiSeq v3-settet. Rengjør strømningscellen forsiktig med sterilt PCR-vann av molekylær klasse.
      MERK: Ikke hell vann på de kapillære prikkene på strømningscellen. Tørk forsiktig av vann fra strømningscellen med ikke-fibrøst papir.
    15. Legg hele volumet på rør 3 (650 μL) i patronen.
    16. I instrumentets driftsprogramvare velger du sekvensering og følger instruksjonene. Sett inn flowcell, inkorporeringsbuffer og patron. Last inn eksempelark. Trykk på Kjør for å starte reaksjonen.
      MERK: Denne sekvenskjøringen tar 3-5 dager. Dataene lastes automatisk opp til Basespace-plattformen. Rådata lagres i to mapper på datamaskinen: Analysemappe som inneholder fastq-filer og Utdata som inneholder bcl-filer og jpeg-bilder.

4.Taksonomisk tildeling av sekvenseringsdata

  1. FASTQ-filbehandling
    MERK: DADA2 pakke23 av R24 er en av anbefalte databaser for å behandle FASTQ filer. Retningslinjen er tilgjengelig på [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. Denne retningslinjen ble utarbeidet ved å ta i bruk den nyeste versjonen av DADA2 pipeline tutorial [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html].
    1. Behandle rå FASTQ-parede sekvenser for trimming, kvalitetsfiltrering, dereplisering og telling av unike sekvenser, prøveslutning, sammenslåing i sammenhengende og fjerning av chimeriske sekvenser.
    2. Bruk følgende DADA2-angitte parametere for både 16S rRNA- og 18S rRNA-genfragmenter. trimLefts=0, 0, avkortLens=[Kontroller sekvenskvaliteten og sett den til riktig lengde].
      MERK: Standardverdier for de andre parameterne er maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2.
  2. Taksonomitilordning
    MERK: SILVA rRNA-database anbefales for taksonomitilordning for DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz er angitt som standard].
    1. Fjern kloroplast og mitokondrie-OTUer for 16S rRNA genfragmentanalyse. Fjern singletons fra 16S rRNA og 18S rRNA analyse.
    2. Rarifisere alle prøver til jevn sekvenseringsdybde basert på prøven som har den laveste sekvenseringsdybden.
    3. Registrer antall leste avlesninger, OTUer tildelt og på hvilket nivå, filtrerte lesinger og antall singletoner som er utelatt.
  3. Statistisk analyse
    1. Utføre statistisk analyse på mikrobielle data ved hjelp av R-pakker med phyloseq25 og vegansk26.

Representative Results

Denne protokollen bruker 18S rRNA genmetabarkodingsanalyse for å identifisere algearter i sjøvannsprøver. Et representativt resultat er vist i figur 1, der sjøvannet samlet inn fra Metri, Puerto Montt, Chile (−41.597; −72.7056) 19. Resultatet viste totalt 13 750 lesninger med over 30 algearter i sjøvannsprøven. Den dominerende algen i denne prøven var Navicula spp. med en relativ overflod på 70,77%. Også tilstrekkelig overflod ble observert for Micromonas (6,40%), Chaetoceros spp. (4,44%), Scripsiella spp. (2,44%), og Prorocentrum spp. (1.28%). Pseudochattonella spp., en av de høyeste giftige alge årsakssammenhengene til chilenske HAB, ble påvist med 0,52% fra denne sjøvannsprøven.

For å verifisere datapåliteligheten ble algeartene identifisert av 18S rRNA genanalyse sammenlignet med de som ble oppnådd ved mikroskopi i samme sjøvannsprøve (figur 2). I samsvar med 18S rRNA genanalyse viste mikroskopien at den dominerende arten var Navicula spp. med en relativ overflod på 74,1% og Prorocentrum spp. (0,60%) som en mindre art. På den annen side ble ikke Heterocapsa spp. (9,04 %) dokumentert fra mikroskopisk observasjon identifisert ved 18S rRNA-genanalyse i denne prøven. Det var 12,6% av små rundt uidentifiserbare planteplanktonceller registrert ved mikroskopi. Dette kan være Micromonas, ifølge 18S rRNA-resultatene.

Protokollen bruker 16S rRNA genmetabarkodingsanalyse for å identifisere bakteriearter i sjøvannsprøver. Et representativt resultat er vist i figur 3, der det samme sjøvannet som ble brukt til 18S rRNA genanalyse ble analysert med 16S rRNA genanalyse. Resultatet viste totalt 31 758 leser med over 30 bakteriearter i sjøvannsprøven. Det bør skisseres at denne sjøvannsprøven ble passert gjennom tandemfiltermembraner (1 μm og 0,2 μm porestørrelser) for å skille frittlevende bakterier fra vedlagte bakterier. Deretter ble celler fanget av hver filtermembran behandlet for DNA-ekstraksjon, etterfulgt av 16S rRNA-genanalysen. Det representative resultatet i figur 3 viser bakteriearter identifisert fra 0,2 μm porestørrelsesmembran, som er definert som frittlevende bakterier. De dominerende frittlevende bakteriene var Amylibacter spp. med en relativ overflod på 20,02%, etterfulgt av Clade Ia (13,53%) og Aligiphilus spp. (7.06%). Resten av bakterieartene som ble påvist fra denne sjøvannsprøven var relativt like fordelt. Den samme analysen kan gjøres for celler fanget av 1 μm pore-størrelse membran som festebakterier artsdeteksjon.

Når disse metabarkodingsanalysene utføres på planlagte tidspunkter over en bestemt studieperiode, kan resultatene oppsummeres som tidsserieanalyse. En måte å gjøre det på er å plotte den relative overfloden av bestemte alge- og bakteriearter som en funksjon av tid for å finne et unikt vekstmønster. Figur 4 viser et representativt tidsserieplott av Alexandrium og Pseudochattonella i Metri, Chile. En annen måte å oppsummere en tidsserie metabarkodingsanalyse på er å plotte alle identifiserte alge- og bakterielle som en funksjon av tid, som representerer befolkningsendringen av visse grupper av organismer. Figur 5 og figur 6 oppsummerer den relative overfloden av henholdsvis bakteriell slekt og orden, som oppdages fra sjøvannet i Metri over fem måneder.

Tabell 1: Første PCR-hovedmiksinnhold: Tabellen viser master mix innhold per reaksjon for 16S rRNA og 18S rRNA analyser. Primersekvensene er oppført i tabell 3. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Primersekvenser: Primerne for første PCR er oppført for 16S rRNA- og 18S rRNA-analyser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: PCR-sykluser: De termiske syklusene for første PCR og andre PCR er oppført. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Indekssekvenser: Indeks 1 (i7) og Indeks 2 (i5) primere som skal brukes for andre PCR, vises. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: Eksempel på plassering av indeks 1 og indeks 2: For å redusere feil må indeksprimere plasseres i stillingen først, og aliquot av hver overføres til en 96-brønns plate ved hjelp av flerkanals pipette. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: Eksempel på eksempelark: Før sekvensering må det opprettes et eksempelark som tilsvarer index 1- og index 2-kort. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 1
Figur 1: Representativt resultat av 18S rRNA metabarkodingsanalyse: Algearter til stede i en sjøvannsprøve samlet inn fra Metri, Los Lagos, Chile 19. Sekvensene tildelt "ukjent" ble eliminert fra, og den relative overfloden av hver identifiserte art ble plottet inn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativt resultat av mikroskopisk analyse: Algeartene ble identifisert fra en vannprøve fra Metri, Los Lagos, Chile 19. Antallet av hver art ble telt manuelt og plottet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativt resultat av 16S rRNA metabarkodingsanalyse: Bakteriearter til stede i en vannprøve fra Metri, Los Lagos, Chile 19. Den relative overfloden av hver identifiserte art ble plottet inn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ tidsserieplott av Alexandrium spp. og Pseudochattonella spp. hentet fra 18S rRNA metabarcodingin Metri, Chile: Figur gjengitt fra Yarimizu et al9. De to giftige algeartene Alexandrium og Pseudochattonella ble selektivt overvåket av 18S rRNA-analyse over tid, og den relative overfloden ble plottet inn som en funksjon av tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativ slekts tidsserie plott hentet fra 16S rRNA og 18S rRNA metabarkoding: Alle bakterielle og eukaryote slekter identifisert i vannet i Metri, Chile, overvåket over fem måneder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representativ ordretidsserie plott hentet fra 16S rRNA og 18S rRNA metabarkoding: Alle bakterielle og eukaryote ordrer identifisert i vannet i Metri, Chile, overvåket over fem måneder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell S1 og tabell S2:
Tabell S1: Rådata for figur 5 og figur 6. Tabell S2: Resultatet av QC-kontroll av rådata for figur 5 og figur 6. Klikk her for å laste ned disse tabellene.

Discussion

Denne protokollen utførte vellykket 18S rRNA og 16S rRNA gen metabarkodingsanalyse for å identifisere alge- og bakteriearter i sjøvannsprøver for overvåking av chilenske HAB-er. De dominerende alger og noen mindre alger oppdaget av denne protokollen var i samsvar med de som ble oppnådd ved mikroskopi, og bekreftet protokollens pålitelighet. Høydepunktet i protokollen er at analysen oppdaget Alexandrium spp. og Pseudochattonella spp., de to mest problematiske HAB forårsaker arter i Sør-Chile, fra sjøvannet i Metri selv ved lav overflod. Spesielt Pseudochattonella spp. er utfordrende arter å identifisere under et mikroskop fordi cellene er små og lett ruptured under lys eller bruk av fikseringer27,28. Metabarkoding kan gi algearter informasjon som knapt finnes i sjøvannsprøver som mikroskopi ikke kan identifisere. Protokollen oppdaget også over 30 bakteriearter. Selv om hvordan disse bakteriene er relatert til algevekst er ukjent på dette tidspunktet, vil massiv datainnsamling av algebakterielle arter i tidsserieanalysen muligens gi så viktige funn. Dermed vil det å legge til metabarkodingsanalyse til de konvensjonelle chilenske HAB-overvåkingsprogrammene utvilsomt styrke den nåværende HAB-overvåkingseffektiviteten. Faktisk kan denne visuelle protokollen for metabarkodingsanalyse være gunstig, ikke bare for chilensk vanns algebakterielle overvåking, men også for kystovervåkingsprogrammer i andre HAB-berørte områder over hele verden.

Selv om denne protokollen ga de ovennevnte fordelene, bør ulempene ved metoden diskuteres. Som det fremgår av den visuelle protokollen, er metabarkodingsmetoden tidkrevende og kompleks, og krever dyre maskiner og reagenser. Laboratoriepersonalet må være spesialutdannet, ellers vil det kaste bort materiale, arbeidskraft og tid. I tillegg må algedeteksjon ved metabarkoding kombineres med mikroskopi for å verifisere at de samme dominerende artene er identifisert fra de to ortogonale metodene29. Mikroskopi er et ikke-invasivt verktøy, for det meste å identifisere algearter, noe som betyr at det er vanskeligere å gjøre feil når algeartene har unike og tilsynelatende former. Selvfølgelig kan menneskelig feil oppstå hvis arten har svært like former som hverandre. På den annen side, siden metabarkodingsanalyse krever flere trinn, øker det naturlig feil. Det kan være en prøve blandet opp, feil reagens tillegg, eller mangler noen prosedyrer. Derfor er det viktig å sammenligne metabarkodingsresultatene med de som oppnås ved mikroskopi. Til slutt gjelder protokollen bare kvalitativt, og resultatene må beregnes for relativ overflod. Som Lamb et al. uttalte i 2019, er den nåværende metabarkodingen som kvantitativ ytelse fortsatt begrenset, og ytterligere forskning er nødvendig før metabarkoding trygt kan brukes til kvantitative applikasjoner30.

Denne protokollen ble optimalisert for 140 - 170 prøver per kjøring fra 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation manual utgitt av Illumina Inc. Den optimaliserte protokollen ble testet mange ganger og ytterligere endret for å utstede denne endelige versjonen. Derfor anbefales det sterkt å følge hvert trinn nøyaktig. Den mest kritiske delen av protokollen er at det er nødvendig med ekstra forsiktighet for å unngå prøvekontaminering. Pipettene og laminær strømningshetten må rengjøres med 70% alkohol- og UV-eksponering til enhver tid, og steriliserbare materialer skal autoklaveres. Primerne og reagensene skal fortynnes direkte fra lageret ved hver nye kjøring, eller gjenbruk av reagenser og eksponering for flere fortynninger kan være en prøveforurensningsårsak. Protokollen angir når operasjonen kan utføres utenfor laminær strømningshette. Med mindre annet er mulig, bør prøvene behandles i en rengjort laminær strømningshette. Når du arbeider med flere 8-rørs strimler samtidig, anbefales det å jobbe på den første 8-rørs stripen og hette den før du går til neste 8-rørs stripe. Å la lokket stå åpent i lang tid kan forårsake prøveforurensning, da 16S- og 18S rRNA-gener er svært allestedsnærværende i omgivelsene. Den angitte tiden, for eksempel blandingstid og inkubasjonstid, bør følges som nøyaktig beskrevet fordi den beste varigheten for hvert trinn ble valgt basert på flere testkjøringer. Overflødig eller utilstrekkelig tid kan for eksempel redusere prøveutbyttet. Prosessen bør bare stoppes på den delen protokollen sier at den kan stoppe. Det er avgjørende å ha en negativ kontroll da det bekrefter at de positive resultatene ikke er kunstige falske positiver. Til slutt anbefales det på det sterkeste å planlegge dagene fordi det krever minst fem dager å behandle alle trinnene, og noen deler kan ikke stoppes før neste stoppskilt.

Begrensningen av taksonomisk tilordning for sekvenserte data er kort notert her. Nyoppdagede nukleotidsekvenser for bakterielle og algearter oppdateres daglig i databanken. Mens godt studerte alge- og bakteriearter er registrert pålitelig, er det også mange sekvenser for ukjente arter oppdatert i databanken. Det indikerer at oppløsningen av registrerte nukleotidsekvenser ikke alltid er nok for artsidentifikasjon, men bare for slektsidentifikasjon. Dermed må mikroskopisk artidentifikasjon utføres ortogonalt. Etablering av en rørledning med åpen tilgang for dette arbeidet har en betydelig fordel i å håndtere et stort sett med sekvenserte data samtidig og effektivt undersøke når det oppstår en feil. I tillegg er utgangen av DADA2 i en tekst- eller csv-fil, noe som gjør det enkelt å videreutvikle statistisk analyse. På den annen side kreves en stor server for å utføre taksonomiske oppdrag, spesielt når et datasett er stort. For å sette opp datasamlebåndet er det nødvendig med ingeniører for å sette opp rørledningen, og fagpersonene må forstå parametere, drift, Linux og bioinformatikk.

Bortsett fra omfanget som et HAB-overvåkingsverktøy, kan bruken av denne protokollen utvides til undersøkende forskningsformål. For eksempel er det pågående debatter mellom den chilenske regjeringen og lokale fiskere sammen med miljøfredsforeninger om det økte antallet lokale HAB31,32. Regjeringen hevder at det skyldes et naturfenomen som global oppvarming og El Niño, mens de senere partiene hevder at lakseoppdrett er årsaken. Laks er ikke en urfolksart i Chile og var ikke i chilensk vann for et halvt århundre siden. Den chilenske regjeringen på den tiden hadde som mål å øke økonomien og skape arbeidsplasser for fattige områder ved å utvikle en laksevirksomhet33. Med intervensjonen fra utlandet for kapitalfortjeneste gjorde Chile stor suksess i havbruksutvikling i pennestil, og antall laks har økt bemerkelsesverdig de siste tiårene31,32,33. Deretter er en stor mengde mat til laks kastet i sjøen, noe som fører til at lokalbefolkningen mistenker at lakseoppdrett er årsaken til de hyppige lokale HAB-ene31,32. Sannheten er ukjent nå, men den må etter hvert forstås slik at strategier for å beskytte det lokale marine miljøet, økonomien og menneskers helse mot HAB-er kan utarbeides. Den molekylærbaserte analysen av det lokale algebakterielle forholdet kan bidra til en trinnvis avklaring for et slikt emne. For eksempel kan teknikken søke i alge- og bakteriearter som ikke var til stede i målområdet før, men har økt dramatisk de siste årene, noe som er noe lik studien gjort av Sakai et al. for oppdagelsen av en uinnspilt befolkning av Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) av GIS og eDNA analyse34. Derfor, utover HAB-overvåkingsverktøyet, har denne metabarkodingsprotokollen potensiell bruk for andre prospekter.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansiører hadde ingen rolle i utformingen av studien, i innsamling, analyser eller tolkning av data; i manuskriptets skriving, eller i beslutningen om å publisere resultatene.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av stipendet (JPMJSA1705) for en studie om science and technology research partnership for Sustainable Development-Monitoring Algae in Chile (SATREPS-MACH). Vi takker Dr. Sandra Rios (Universidad de Los Lagos) for at vi kunne bruke et filmklipp. Vi takker Neal Andrew Holland for hans flittige korrekturlesing av manuskriptet. Vi uttrykker vår oppriktige takknemlighet til laboratoriegruppemedlemmene ved CREAN-IFOP i Puerto Montt, Chile, for å gi oss råd om planteplanktonidentifikasjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL single tube ThermoFisher Q32856 sterile
1.5 mL tubes ThermoFisher 2150N sterile
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap ThermoFisher AB0451 & 4323032 sterile
96-well 0.2 mL PCR plate ThermoFisher N8010560
AccuRuler 100 bp DNA Ladder MaestroGen 02001-500
Chelex 100 Chelating Resin Bio-Rad 1432832
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump MilliporeSigma WP6122050
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583
D1000 sample buffer Agilent Technologies 5067-5602
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) Promega G1881
Ethanol Molecular Biology Grade E7023 Merck KGaA
Filtration device ThermoFisher 09-740-36H, 09-740-23E
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) Thermo Fisher Scientific Q32851
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) ThermoFisher Q33238
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) Agilent Technologies 5067-5582
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) Agilent G2992AA
GelRed Nucleic Acid Gel Stain Biotium 41002
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) Scientific Industries SI-0236
Heat block
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X Roche KK2602
HT1 Hybridization buffer Illumina 20015892
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D Illumina FC-131-2001, -2002, -2003, -2004
Laminar hood cabinet Biobase Co. Biobase PCR-800 PCR Cabinet
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) Agilent Technologies 5067-5598
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) Promega NG2002
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) ThermoFisher AM10027
Micro-seal film for 96-well plate ThermoFisher 4311971 sterile
MiSeq Reagent Kit v3 Illumina MS-102-3003 includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges.
MiSeq system Illumina SY-410-1003 includes pre-installed software
Molecular grade nuclease-free water Integrated DNA Technologies 11-05-01-04
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M Merck KGaA 1091371000
Multichannel pipettes Not specified Not specified
Multi-Purpose Agarose Cleaver Scientific CSL-AG500
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System ThermoFisher D2
Ow EC-105 Compact Power Supply ThermoFisher 105ECA-115
Pellet Pestle— Cordless Motor ThermoFisher K749540-0000
PhiX control Kit v3 Illumina FC-110-300 ready-to-use control library for Illumina sequencing
Pipette tips Not specified Not specified sterile
Pipettes Not specified Not specified 2, 10, 20, 100, 1000 μL
SterivexTM GP 0.22  μm filter unit MilliporeSigma SVGP01050
Tabletop centrifuge Eppendorf 5427R Centrifuge Eppendorf AG
TBE buffer ThermoFisher B52
TE buffer (pH 8.0) ThermoFisher AM9849
Terr PCR Direct FFPE Kit Takara Bio USA 639284 includes 2X Terra PCR Direct Buffer
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL Takara Bio USA 639271 High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) ThermoFisher A37835
TransIlluminator and image capture system Analytik Jena, AG GelDoc-ItTS2 Imager
Whatman 1.0  m pore-sized membrane MilliporeSigma WHA111110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. Global harmful algal bloom status reporting. Harmful Algae. 102, 101992 (2021).
  2. Anderson, D. M. Red Tides. Scientific American. 271 (2), 52-58 (1994).
  3. Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. Algal Bloom and its Economic Impact. , Publications Office of the European Union. (2016).
  4. Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea. Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).
  5. Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean. Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).
  6. Alvarez, G., et al. Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality. Toxins (Basel). 11 (4), (2019).
  7. Clément, A., et al. Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms. Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).
  8. Trainer, V. L., et al. Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes. Harmful Algae. 91, 101591 (2020).
  9. Yarimizu, K., et al. Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).
  10. Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington. Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).
  11. Tweddle, J. F., et al. Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish. Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).
  12. Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. The global complex phenomena of harmful algae blooms. Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).
  13. Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment. Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).
  14. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  15. Amin, S. A., et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria. Nature. 522, 98-101 (2015).
  16. Berdalet, E., et al. Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century. Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).
  17. Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications. Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).
  18. Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nature Reviews Microbiology. 2, 17065 (2017).
  19. Maruyama, F., et al. 16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms. protocol.io. , (2020).
  20. Tanabe, A. S., et al. Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).
  21. Nishitani, G., et al. Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy. Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).
  22. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1 (2013).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2007).
  25. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
  26. Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).
  27. Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta). Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).
  28. Mardones, J. I., et al. Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa. Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).
  29. Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes. Diversity. 13 (5), 180 (2021).
  30. Lamb, P. D., et al. How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach. Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).
  31. Mascareño, A., et al. Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile. Ecology and Society. 23, (2018).
  32. Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons. Marine Pollution Bulletin. 150, 110603 (2020).
  33. Swanson, H. A. Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).
  34. Sakai, Y., et al. Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis. Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).

Tags

Miljøvitenskap utgave 174 skadelige algeoppblomstringer Chile HAB-overvåking metabarkodingsanalyse algebakteriell gjensidighet planteplankton lakseoppdrett
En standardisert prosedyre for overvåking av skadelige algeoppblomstringer i Chile ved metabarkodingsanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yarimizu, K., Fujiyoshi, S., Kawai,… More

Yarimizu, K., Fujiyoshi, S., Kawai, M., Acuña, J. J., Rilling, J. I., Campos, M., Vilugrón, J., Cameron, H., Vergara, K., Gajardo, G., Espinoza-González, O., Guzmán, L., Nagai, S., Riquelme, C., Jorquera, M. A., Maruyama, F. A Standardized Procedure for Monitoring Harmful Algal Blooms in Chile by Metabarcoding Analysis. J. Vis. Exp. (174), e62967, doi:10.3791/62967 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter