Summary
Aqui apresentamos um método modificado para o isolamento e cultura das células epiteliais gengival humanas adicionando o inibidor de Rocha, Y-27632, ao método tradicional. Este método é mais fácil, menos demorado, melhora as propriedades das células-tronco e produz um número maior de células epiteliais de alto potencial, tanto para o laboratório quanto para aplicações clínicas.
Abstract
O tecido gengival é a primeira estrutura que protege os tecidos periodontais e desempenha papéis significativos em muitas funções orais. O epitélio gengival é uma importante estrutura de tecido gengival, especialmente na reparação e regeneração do tecido periodontal. Estudar as funções das células epiteliais gengival tem valor científico crucial, como reparar defeitos orais e detectar a compatibilidade de biomateriais. Como as células epiteliais gengivais humanas são células queratinizadas altamente diferenciadas, sua vida útil é curta, e são difíceis de passar. Até agora, há apenas duas maneiras de isolar e cultivar células epiteliais gengivas, um método de explante direta e um método enzimático. No entanto, o tempo necessário para obter células epiteliais usando o método de explanta direta é maior, e a taxa de sobrevivência celular do método enzimático é menor. Clinicamente, a aquisição de tecido gengival é limitada, por isso é necessário um sistema de isolamento e cultura in vitro estável, eficiente e simples. Melhoramos o método enzimático tradicional adicionando Y-27632, um inibidor de quinase associado a Rho (ROCK), que pode promover seletivamente o crescimento de células epiteliais. Nosso método enzimático modificado simplifica os passos do método enzimático tradicional e aumenta a eficiência da cultura de células epiteliais, que tem vantagens significativas sobre o método de explante direta e o método enzimático.
Introduction
A gingiva humana, a estrutura de defesa de primeira linha que protege o tecido periodontal, não é apenas uma barreira física e química1,mas também secreta diferentes classes de mediadores inflamatórios que participam de respostas imunes e constituem uma barreira imune2,3. O epitélio gengival desempenha um papel importante na reparação e regeneração do tecido periodontal. Portanto, estudar a defesa e imunidade do epitélio gengival é de grande importância para a compreensão da ocorrência, diagnóstico e tratamento da periodontite. O isolamento e a cultura das células epiteliais gengival do tecido gengival humano é o primeiro passo necessário para estudar o epitélio gengival. Tal procedimento requer operações básicas como a produção de células de sementes para a engenharia de tecidos, modelos in vitro de doenças periodontais associadas e materiais para reparação de defeitos periodontais.
As células epiteliais gengivais primárias são caracterizadas por uma baixa taxa de divisão in vitro4, pesquisadores têm procurado um método ideal de isolamento e cultivo há décadas. Até o momento, duas técnicas diferentes, um método de explante direta e um método enzimático, são comumente utilizadas em laboratórios para obter células de epitélio gengival primário in vitro4,5. O método de explante direta tem vantagens como a exigência de uma menor quantidade de amostras de tecido e procedimento de isolamento simples, mas tem as desvantagens de maior tempo de cultura e suscetibilidade à contaminação5. Embora o método enzimático encurte o tempo de cultura necessário, a eficiência é relativamente baixa e varia dependendo das enzimas e médias utilizadas. Kedjarune et al.6 mostraram que o método de explante direta, que requer mais tempo antes da subcultura (2 semanas), parecia ser mais bem sucedido para o cultivo de células epiteliais gengivas em comparação com o método enzimático. No entanto, comparando esses dois métodos, Klingbeil et al.7 descobriram que o método enzimático teve os melhores resultados para as culturas primárias das células epiteliais orais, e foi possível obter o rendimento celular ideal no menor período de tempo (11,9 dias versus 14,2 dias).
Por isso, foi importante desenvolver um método mais conveniente e eficaz para o isolamento e cultura das células epiteliais orais4. Relatamos anteriormente que a adição de Y-27632, um inibidor da quinase proteica associada a Rho (ROCK), simplifica o procedimento de isolamento das células epidérmicas primárias humanas e queratinócitos dos tecidos de pele adultos8,9,10. Desenvolvemos o G-médio, um novo meio de inoculação condicionada que separa espontaneamente epidérmico das células dérmicas e suporta o crescimento e o rendimento das células epidérmicas primárias8,9,10. No presente estudo, desenvolvemos uma nova técnica de isolamento e cultura livre de soro para células epiteliais gengival, combinando G-médio com Y-27632. Em essência, nosso método baseia-se em uma simplificação do método enzimático tradicional de duas etapas, por isso comparamos nosso novo método com o método de explant direto. Este método enzimático modificado encurta significativamente o tempo necessário para separar as células epiteliais gengival do tecido gengival e aumenta a eficiência de cultura de células epiteliais gengivais.
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Protocol
Os tecidos humanos utilizados neste protocolo são tecidos gengival adultos frescos descartados a partir de extrações de dentes impactados no Departamento de Cirurgia Maxilofacial de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Instituição (Protocolo Nº. GR201711, Data: 27/02/2017).
1. Preparativos
- Colete tecidos gengival adultos frescos em tubos de 15 mL contendo 10 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) complementados com penicilina/estreptomicina de 3% (P/S) e mantenha os tecidos a 4 °C.
NOTA: Trate os tecidos como detalhados abaixo dentro de 24 horas após a excisão.
2. Prepare reagentes e meio de cultura
- Prepare a solução de lavagem: 3% P/S. Mix 50 mL de PBS com 1,5 mL de penicilina (100 U/mL) e 1,5 mL de estreptomicina (100 mg/L).
- Prepare 500 mL de meio contendo fator de crescimento (chamado G-médio): DMEM/F12 (3:1) médio contendo 1% P/S, 2% suplemento B27, 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), 40 ng/mL de fator de crescimento fibroblasto 2 (FGF2) e 40 μg/mL de fungiz.
- Preparar soluções de digestão enzimática para o novo método: Dissolver 125 mg de pó de dispase e 125 mg de pó de colagenase tipo I em 50 mL de DMEM.
NOTA: Filtre todas as soluções enzimásas através de um coador de 0,22 μm e armazene a 4 °C. - Prepare 500 mL do meio para neutralizar a digestão enzimática: 10% soro bovino fetal (FBS) e 1% P/S no meio DMEM.
3. Método de explante direta
- Pré-tratamento de tecido gengival
- Lave tecido gengival com 5 mL de 75% de etanol para 30 s. Em seguida, enxágue duas vezes com 5 mL da solução de lavagem (passo 2.1) por 5 min.
NOTA: Realize todas as lavagens em pratos de cultura celular com diâmetro de 50 mm.
- Lave tecido gengival com 5 mL de 75% de etanol para 30 s. Em seguida, enxágue duas vezes com 5 mL da solução de lavagem (passo 2.1) por 5 min.
- Cultura celular epitelial gengival
- Corte o tecido gengival em 1 mm3 pedaços e espalhe-os em um prato de cultura celular de 100 mm. Use fórceps pontiagudas finas e tesouras oftálmicas para as operações de corte.
- Adicione o meio-G (passo 2.2) ao prato de cultura. Em seguida, incubar o prato de cultura em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C. Use um microscópio invertido (40x) para examinar os tecidos a cada 24 horas.
- Remova os pedaços de tecido gengival quando as células epiteliais se propagaram a um diâmetro de 2-5 mm ao redor dos pedaços de tecido. Troque o G-médio a cada 2-4 dias.
4. O novo método enzimático modificado
- Pré-tratamento de tecido gengival
- Para isso, siga os mesmos passos descritos para o método de explant direto, passo 3.1.1.
- Digestão do tecido gengival
- Corte o tecido gengival em pedaços minúsculos, aproximadamente < 1 mm de tamanho, com duas lâminas esterilizadas. Repita o processo de trituração com duas lâminas cirúrgicas.
- Adicione 1 mL de dispase de 2,5 mg/mL + solução de colagenase a um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo as peças de tecido gengival e, em seguida, incubar o tubo por 15-20 min em uma incubadora a 37 °C.
- Quando o tecido se tornar transparente e flocculente, adicione 1 mL da solução de neutralização para terminar a digestão. Misture bem a solução pipetando para cima e para baixo 10-15 vezes. Passe a solução através de um filtro de malha de 100 μm.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min.
- Remova o supernasce e resuspenha a pelota celular na parte inferior em 10 mL de meio contendo fator de crescimento (passo 2.2). Transfira a suspensão celular para um prato de cultura celular de 100 mm. Adicione 10 μM de Y-27632 ao prato de cultura celular.
- Cultume as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5%. Substitua o antigo meio-G pelo meio-G fresco a cada 2 dias. Observe as células no dia 1 e dia 3.
5. Passagem celular
- Retire o prato da incubadora, retire o meio gasto e lave duas vezes com PBS. Adicione 2 mL de 0,05% de trippsina para cada prato de 100 mm.
NOTA: Agite o prato para ter certeza de que há contato suficiente entre a solução Trypsin e o fundo do prato. - Deixe o prato em uma incubadora em torno de 5 min a 37 °C para o processo de digestão.
- Use um microscópio (40x) para examinar as células e certificar-se de que a maioria das células se separou da parte inferior do prato.
- Adicione 2 mL da solução de neutralização para parar a digestão e transfira as células para um tubo de 15 mL. Pipeta para cima e para baixo 10-15 vezes. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min.
- Remova o supernatante lentamente. Resuspend as células com 10 mL de G-médio e conte o número de células.
- Adicione cerca de 1 x 106 células em 10 mL de G-médio e 10 μM Y-27632 a cada prato de 100 mm.
- Renove o G-medium e Y-27632 a cada 2 dias. Veja as células nos dias 1 e 5.
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Representative Results
A Figura 1 mostra um diagrama esquemático do método de explant direto e do método enzimático modificado. O método de explante direta não precisa de enzima digestiva durante todo o processo. Em contraste, o método enzimático tradicional geralmente precisa de dois conjuntos de enzimas digestivas, despase e colagem, para separar a folha epitelial da camada de fibroblasto subjacente, e então tentar a liberação das células epiteliais em suspensão. Nosso novo método omite a etapa da separação e é um método enzimático simplificado. Além disso, adicionar Y-27632 ao meio G promove efetivamente o crescimento das células epiteliais. O método de explante direta geralmente leva cerca de 2 semanas para que as células epiteliais gengivas cresçam o suficiente para a passagem e é facilmente contaminada. No entanto, o número de células epiteliais gengival obtidas pelo novo método é significativamente maior do que o obtido pelo método de explant direto e leva apenas uma média de 8 dias para atender aos requisitos de aprovação.
Figura 1: Comparação do método de explant direto e do novo método. (A) Esquema que mostra o processo do método de explant direto. As peças de tecido gengival são colocadas em um prato de cultura. As células epiteliais são cultivadas em meio-G e crescem a partir dos pedaços de tecido. O método de explante direta geralmente leva cerca de 13 dias para que as células epiteliais atinjam 80% de confluência. (B) Esquema mostrando o processo do novo método enzimático. Os fragmentos de tecido gengival são digeridos por dispase e colagemnase I, após o qual as pelotas celulares são cultivadas em G-médio com Y-27632. O novo método enzimático geralmente leva cerca de 6 dias para atingir 80% de confluência que é adequada para a passagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Células epiteliais gengival adultas preparadas pelo método de explante direta e pelo novo método foram observadas em um microscópio no terceiro e sétimo dias(Figura 2A). Pode-se ver que o novo método aumentou significativamente a produção de células epiteliais gengival no terceiro e sétimo dias. As curvas de crescimento das células epiteliais gengival obtidas pelo novo método e pelo método de explant direta foram medidas utilizando um kit de contagem celular (CCK-8) em diferentes pontos de tempo (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d)(Figura 2B). O tempo de duplicação das células preparadas usando o novo método foi de cerca de 1-2 dias, mas o tempo de duplicação das células preparadas usando o método de explant direto foi de cerca de 5-6 dias. Os rendimentos celulares pelos dois métodos foram calculados no sétimo dia (Figura 2C) e mostraram que o número de células produzidas pelo novo método (9 x 10 6 ) foi mais de trêsvezesmaior do que o número de células produzidas pelo método de explantação direta (3 x 106). A Figura 2D mostra que levou cerca de metade do tempo para que o novo método (6 dias) alcançasse 80% de confluência em comparação com o método de explante direta (13 dias).
Figura 2: O novo método enzimático aumenta a produção de células epiteliais gengivais primárias. (A) Imagens de células epiteliais gengivais preparadas pelo método de explante direta (linha inferior) e pelo novo método enzimático (linha superior) no terceiro e sétimo dia após a inoculação inicial. Barras de escala = 200 μm. (B) Células epiteliais gengivais cultivadas pelo método direto e o novo método enzimático foram coletadas nos dias 1, 2, 3, 4, 5 e 6, e o número de células epiteliais gengival foi analisado utilizando-se um kit CCK-8. (C) Após 7 dias de cultura, as células epiteliais gengivais foram destacadas pela trippsina e foram coletadas. Uma placa de contagem de células foi usada para determinar o número de células epiteliais gengival preparadas separadamente pelos dois métodos. O número de células foi calculado a partir dos dois métodos, que foram repetidos três vezes separadamente, e os resultados são expressos como o número médio de células por prato de 100 mm. (D) O tempo médio para atingir 80% de confluência das células epiteliais gengivais primárias (passagem 0) preparadas pelo novo método enzimático e pelo método de explanta direta é comparada. B, C e D: O teste tdo aluno foi utilizado; as barras de erro mostram o desvio padrão; n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 ao comparar o novo método enzimático com o método de explante direta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A análise da imunofluorescência das células epiteliais gengival (na passagem 3) obtida pelo novo método mostrou que a expressão de CK5, CK18, e Pan-CK (CK14, CK15, CK16 e CK19) foram positivos (Figura 3A, C,D)11,12,13,14,15, enquanto a expressão de CK10 e vimentina foi baixa(Figura 3B,E)11,16. CK5 e Pan-CK (CK14, CK15, CK16 e CK19) foram localizados principalmente na camada basal de células epiteliais, o que é um sinal de seu alto potencial de diferenciação11,14,15. CK10 é um marcador de epitélio diferenciado11, e vimentina é um marcador de fibroblastos gengival16. A taxa positiva de queratina das células epiteliais gengivais isoladas pelo novo método foi maior, especialmente CK5, CK18 e Pan-CK (Figura 3A,C,D),o que indicou que as células epiteliais gengivais isoladas poderiam manter uma boa função de membrana de porão. A baixa expressão do marcador de diferenciação CK10 (Figura 3B) indicou que as células epiteliais gengival tinham um alto potencial de diferenciação. Culturas in vitro mostraram que as células epiteliais gengival isoladas pelo novo método poderiam ser cultivadas para a oitava geração, e a baixa expressão da vimentina indicava que as células epiteliais gengival tinham alta pureza, que nenhum fibroblastos gengival as contaminou e que a eficiência do isolamento era alta(Figura 3E).
Figura 3: Marcadores específicos de células epiteliais gengival (P3) preparados pelo novo método enzimático. (A-E) mostram CK5 (vermelho), CK10 (vermelho), CK18 (vermelho), Pan-CK (vermelho) e vimentina (vermelho) células positivas, DAPI (azul) foi usado para manchar nuclei. (A-C) barras de escala = 100 μm; (D) e (E) barras de escala = 50 μm; o experimento foi repetido quatro vezes de forma independente. (A),(C), e (D) mostram a expressão positiva de CK5, CK18 e pan-ck (CK14, 15, 16 e 19) em células epiteliais gengival, enquanto (B) e (E) mostram a baixa expressão de CK10 e vimentina em células epiteliais gengival. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O novo método aumentou a expressão de ki67, p63 e p75NGFR (receptor de fator de crescimento nervoso de baixa afinidade p75) em células epiteliais gengivais primárias. Foram selecionadas as células da passagem 3 para análise de Imunofluorescência, que revelou que a expressão positiva de ki67, p63 e p75NGFR foi superior à das células epiteliais gengival obtidas pelo método de explante direta(Figura 4A, C,E). As taxas de expressão positiva de ki67, p63 e p75NGFR foram de 80%, 98% e 96% no novo método, respectivamente, significativamente superiores às de ki67 (35%), p63 (40%) e p75NGFR (47%) obtidas pelo método direto (Figura 4B,D,F). Ki67, p63 e p75NGFR são marcadores de células-tronco epiteliais orais17. Esses resultados indicaram que as células epiteliais gengivais primárias isoladas e cultivadas usando o novo método continham populações de células-tronco, tinham um alto potencial de proliferação e mantiveram as propriedades das células-tronco das células epiteliais gengivais.
Figura 4: Características das células-tronco das células epiteliais gengival (P3) obtidas pelo método de explante direta e pelo novo método enzimático. (A),(C), e (E) mostram imagens representativas de imunofluorescência de células epiteliais gengivais na passagem 3 (P3), respectivamente, mostrando células positivas ki67 (vermelha), p63 (vermelha) e p75NGFR (vermelha) obtidas pelo método de explant direto e pelo novo método enzimático. DAPI (azul) foi usado para manchar núcleos. Barras de escala = 50 μm. (B), (D), e (F) mostram análise quantitativa de células ki67 positivas, células p63 positivas e células p75NGFR positivos, respectivamente, em células epiteliais gengival (P3) obtidas pelo método de explantação direta e pelo novo método enzimático. Foram contabilizadas 400 células para quantificar cada grupo, e os números médios de células positivas ki67, p63 e p75NGFR são mostrados. B, D e F: Foi utilizado o teste tdo aluno; as barras de erro mostram o desvio padrão; o experimento foi repetido quatro vezes independentemente (n = 4); **p < 0,01, ao comparar o novo método enzimático com o método de explanta direta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O tecido gengival é uma estrutura fundamental que mantém a integridade periodontal e a saúde. As células epiteliais gengival têm papéis significativos na reparação e regeneração do tecido periodontal e podem ser utilizadas em pesquisas científicas e aplicações clínicas e áreas relacionadas, incluindo biologia oral, farmacologia, toxicologia e deficiências de mucosa oral18. Portanto, é necessário desenvolver um método estável e eficiente para a colheita das células epiteliais orais19. As células epiteliais primárias são uma espécie de células totalmente diferenciadas com poucas passagens e uma vida útil curta. As células epiteliais de cultivo provaram ser mais complexas do que os fibroblastos de cultivo5.
Atualmente, a literatura publicada mostra que existem vários protocolos para o isolamento e cultura das células epiteliais. No entanto, dois métodos, o método de explante direta e o método enzimático, são os mais utilizados entre esses protocolos. Em 1910, Carrel e Burrows descreveram pela primeira vez um método para obter células epiteliais gengivais e buccal chamadas de método de explant direto20. O método de explante direta tem as vantagens de requisitos de baixo peso para amostras de tecido, procedimentos menos complicados, menor variação e menor envolvimento nas etapas, mas tem as desvantagens de exigir um longo tempo de cultura e é altamente suscetível à contaminação5. Em 1975, Rheinwald e Green relataram pela primeira vez o método enzimático usando fibroblastos de camundongos 3T3 irradiados como uma camada alimentadora para cultivar células epiteliais orais in vitro21. Embora esse método tenha melhorado muito o rendimento dos queratinócitos, a camada celular alimentadora de camundongos irradiada tinha potenciais riscos biológicos22. Depois disso, foram desenvolvidos sistemas culturais sem células alimentador22 e sem soro23,24 que comprovaram que as células 3T3 não eram necessárias para culturas epiteliais celulares. Embora o método enzimático exija menos tempo de cultura, a eficiência é relativamente baixa e varia dependendo das enzimas e do meio utilizado25. Vários laboratórios compararam os dois métodos e Kedjarune et al.6 observaram a técnica de explant direta para ser mais bem sucedida do que o método enzimático e encontraram uma maior taxa de proliferação celular. Shwetha et al.26 concluíram que o método de explante direta parece ser uma técnica simples e bem sucedida para o isolamento de queratinócitos mucosas orais. No entanto, Klingbeil et al. 7 concluíramexatamente o oposto, ou seja, o método enzimático mostrou os melhores resultados em menos tempo com uma boa vida útil. Uma pesquisa realizada no Reino Unido por Daniels et al.19 analisou os métodos de isolamento e cultura celular dos queratinócitos humanos e informou que 21 dos 34 laboratórios que responderam utilizaram o método enzimático com algumas variações. Embora o método de explante direta exija menos tecido e tenha menos etapas de manuseio do que o método enzimático, tem sido sugerido que o método enzimático é mais rápido e fácil de gerenciar6. Por isso, foi necessário desenvolver um método mais conveniente e eficaz para o isolamento e cultura das células epiteliais orais4. Nosso novo método, um método enzimático simplificado que usa Y-27632 aumentou significativamente a produção de células epiteliais gengivales e encurtou o tempo necessário para separar as células epiteliais gengival do tecido gengival.
A Figura 2A mostra que o novo método aumentou significativamente a produção de células epiteliais gengival no terceiro e sétimo dias. A Figura 2B mostra que o tempo de duplicação das células preparadas usando o novo método enzimático foi de cerca de 1-2 dias, mas o uso do método de explante direta levou cerca de 5-6 dias. O número de células produzidas utilizando o novo método enzimático (9 x 10 6 ) foi mais de trêsvezesmaior que o método de explante direta (3 x 106) no sétimo dia(Figura 2C). As células preparadas usando o novo método enzimático levaram 13 dias para se tornarem 80% confluentes, o que é consistente com estudos anteriores, enquanto o método de explanta direta levou cerca de 2 semanas6, 20,25 ± 1,05 dias18 e 14,2 ± 2,76 dias7 para as células se tornarem totalmente confluentes antes da subcultura. No entanto, o novo método enzimático levou apenas 6 dias para se tornar 80% confluente, o que é muito menor do que o método de explante direta de 13 dias em nosso laboratório e o método enzimático de Klingbeil et al.,de 7 ± 2,36 dias. Também encontramos um fenômeno interessante, ou seja, as colônias de células epiteliais cresceram em uma estrutura de várias camadas no método de explanta direta, enquanto uma estrutura monocamada uniforme foi observada usando o novo método enzimático. Obviamente, colônias multicamadas mais grossas prolongam o tempo necessário para se tornarem 80%-100% confluentes. A razão pela qual o novo método enzimático promove a proliferação celular é a adição de Y-27632, um inibidor de ROCK1 e ROCK2. O Y-27632 foi inicialmente relatado por seus efeitos positivos na proliferação e diferenciação de células epiteliais humanas em 200827. Chapman et al.28 relataram que o tratamento com Y-27632 aumentou consideravelmente a capacidade proliferativa de queratinócitos e resultou em imortalização eficiente sem crise celular detectável. Em nossos estudos anteriores, descobrimos que o Y-27632 simplifica o procedimento de isolamento das células epidérmicas primárias humanas e queratinócitos do tecido da pele adulto8,9,10. Strudwick et al.29 relataram que o uso de 10 μM Y-27632 juntamente com baixo cálcio permitiu que os queratinócitos humanos primários fossem cultivados sem uma camada alimentadora de células por períodos mais longos de tempo, mantendo a capacidade de diferenciar e formar um epitélio estratificado. Neste estudo, o novo método enzimático utilizando Y-27632 aumentou consideravelmente a colheita de células epiteliais, prolongando sua vida útil e promovendo sua capacidade de proliferação.
O método enzimático tradicional contém duas operações de digestão. A primeira digestão é separar o tecido epitelial do tecido conjuntivo usando dispase, que funciona a partir do lado estromal4,5. A segunda digestão geralmente usa trippsina para separar células epiteliais do tecido epitelial4,5. Devido à destruição de células epiteliais por trippsina, a eficiência do método enzimático é afetada4. O novo método enzimático descrito aqui é um método simplificado que omite um passo de digestão. As principais diferenças entre os novos e tradicionais métodos enzimáticos referem-se aos protocolos de separação do tecido epitelial do tecido conjuntivo5. Além disso, o novo método usa despase e colagem em vez de trippsina na etapa de digestão, e, portanto, a integridade das células epiteliais é bem protegida. Clinicamente, é muito mais difícil obter a mesma quantidade de tecido da gingiva humana do que da pele e da mucosa bucal. O método de explante direta exigia apenas pequenos pedaços de tecido gengival e cultivava um número maior de células quando comparado com o método enzimático18. Tratamos uma pequena quantidade de tecido epitelial gengival usando o novo método e colhemos uma densidade celular muito satisfatória. Isso mostra que o novo método não depende de quantidades relativamente grandes de tecido a serem fornecidas inicialmente. Uma possível limitação do novo método é que pode parecer uma pequena quantidade (<5%) contaminação de fibroblastos na cultura inicial (passagem 0), mas pode ser facilmente removida por um tratamento de curto prazo de 0,05% de trippsina, conforme relatado previsamente9.
Neste estudo, CK5, CK18 e Pan-CK (CK14, CK15, CK16 e CK19) foram positivos(Figura 3A, C,D). Isso sugere que as células epiteliais gengival isoladas foram capazes de manter sua função de membrana no porão, o que é consistente com os estudos de Orazizadeh et al.30 e Kedjarune et al.6. CK5 e CK14 são expressos por células indiferenciadas localizadas na camada epitelial-basal. CK19 é tipicamente encontrado em epitélio simples e em epitélio estratificado não queratinizado31. A análise da imunofluorescência das células epiteliais gengival (P3) obtidas utilizando o novo método enzimático mostrou que os níveis de expressão de ki67, p63 e p75NGFR foram maiores do que nas células obtidas utilizando o método de explante direta(Figura 4). Este resultado indica que o novo método pode manter as propriedades das células-tronco das células epiteliais gengivais e promove o potencial de proliferação das células epiteliais gengival. Nosso estudo anterior descobriu que o Y-27632 mantém o potencial de células-tronco epidérmicas da pele após a expansão8. Wang et al. descobriram que o Y-27632 facilita a proliferação, migração e pluripotência das células-tronco do ligamento periodontal humano32.
Em resumo, o novo método enzimático modificado fornece um procedimento simplificado e eficaz para isolar e cultivar células epiteliais primárias humanas a partir de tecido gengival adulto. Este novo método é mais fácil, menos demorado e melhora suas propriedades de células-tronco, e, portanto, tem vantagens óbvias em comparação com o método de explanta direta em muitos parâmetros. Este método avançado é mais adequado para produzir um grande número de células epiteliais de alto potencial, tanto para aplicações laboratoriais quanto para aplicações clínicas.
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Disclosures
Todos os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa-Chave da Fundação de Ciência Natural da Província de Shandong (ZR2019ZD36) e pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento da Província de Shandong (2019GSF108107) para X.W.; o Programa de Pesquisa e Desenvolvimento chave da Província de Shandong (2018GSF118240) para J.G.; Projeto de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Médica e Em Saúde da Província de Shandong (2018WS163) para Z.X., e o Projeto de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Médica e Em Saúde da Província de Shandong (2019WS045) para J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
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