Summary
Hier presenteren we een aangepaste methode voor de isolatie en kweek van menselijke gingivale epitheelcellen door de Rock-remmer, Y-27632, toe te voegen aan de traditionele methode. Deze methode is eenvoudiger, minder tijdrovend, verbetert de eigenschappen van stamcellen en produceert grotere aantallen epitheelcellen met een hoog potentieel, zowel voor het laboratorium als voor klinische toepassingen.
Abstract
Het gingivale weefsel is de eerste structuur die parodontale weefsels beschermt en een betekenisvolle rol speelt in veel orale functies. Het gingivale epitheel is een belangrijke structuur van gingivaal weefsel, vooral bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel. Het bestuderen van de functies van gingivale epitheelcellen heeft cruciale wetenschappelijke waarde, zoals het repareren van orale defecten en het detecteren van de compatibiliteit van biomaterialen. Omdat menselijke gingivale epitheelcellen sterk gedifferentieerde verhoornde cellen zijn, is hun levensduur kort en zijn ze moeilijk te passeren. Tot nu toe zijn er slechts twee manieren om gingivale epitheelcellen te isoleren en te kweken, een directe explantmethode en een enzymatische methode. De tijd die nodig is om epitheelcellen te verkrijgen met behulp van de directe explantmethode is echter langer en de celoverleving van de enzymatische methode is lager. Klinisch gezien is de verwerving van tandvleesweefsel beperkt, dus een stabiel, efficiënt en eenvoudig in vitro isolatie- en kweeksysteem is nodig. We verbeterden de traditionele enzymatische methode door Y-27632 toe te voegen, een Rho-geassocieerde kinase (ROCK) -remmer, die selectief de groei van epitheelcellen kan bevorderen. Onze aangepaste enzymatische methode vereenvoudigt de stappen van de traditionele enzymatische methode en verhoogt de efficiëntie van het kweken van epitheelcellen, wat aanzienlijke voordelen heeft ten opzichte van de directe explantmethode en de enzymatische methode.
Introduction
De menselijke gingiva, de eerstelijns verdedigingsstructuur die parodontaal weefsel beschermt, is niet alleen een fysieke en chemische barrière1, maar scheidt ook verschillende klassen van ontstekingsmediatoren af die deelnemen aan immuunresponsen en een immuunbarrière vormen2,3. Het gingivale epitheel speelt een belangrijke rol bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel. Daarom is het bestuderen van de verdediging en immuniteit van het gingivale epitheel van groot belang voor het begrijpen van het optreden, de diagnose en de behandeling van parodontitis. De isolatie en kweek van gingivale epitheelcellen uit menselijk gingivaal weefsel is de eerste stap die nodig is voor het bestuderen van het gingivale epitheel. Een dergelijke procedure vereist basisoperaties zoals het produceren van zaadcellen voor weefselmanipulatie, in vitro modellen van parodontale geassocieerde ziekten en materialen voor het repareren van parodontale defecten.
Primaire gingivale epitheelcellen worden gekenmerkt door een lage delingsgraad in vitro4, onderzoekers zijn al tientallen jaren op zoek naar een optimale isolatie- en teeltmethode. Tot op heden worden twee verschillende technieken, een directe explantmethode en een enzymatische methode, vaak gebruikt in laboratoria om primaire gingivale epitheelcellen in vitrote verkrijgen4,5. De directe explantmethode heeft voordelen zoals de vereiste van een lagere hoeveelheid weefselmonsters en een eenvoudige isolatieprocedure, maar heeft de nadelen van een langere kweektijd en gevoeligheid voor besmetting5. Hoewel de enzymatische methode de benodigde kweektijd verkort, is de efficiëntie relatief laag en varieert afhankelijk van de gebruikte enzymen en het gebruikte medium. Kedjarune et al.6 toonden aan dat de directe explantmethode, die meer tijd nodig heeft voor subcultuur (2 weken), succesvoller bleek te zijn voor het kweken van gingivale epitheelcellen in vergelijking met de enzymatische methode. Bij het vergelijken van deze twee methoden vonden Klingbeil et al.7 echter dat de enzymatische methode de beste resultaten had voor primaire culturen van orale epitheelcellen en dat het mogelijk was om de optimale celopbrengst te verkrijgen binnen de kortste tijdsperiode (11,9 dagen versus 14,2 dagen).
Daarom was het belangrijk om een handigere en effectievere methode te ontwikkelen voor de isolatie en kweek van orale epitheelcellen4. We hebben eerder gemeld dat het toevoegen van Y-27632, een remmer van Rho-geassocieerd eiwitkinase (ROCK), de isolatieprocedure van menselijke primaire epidermale cellen en keratinocyten uit volwassen huidweefselsvereenvoudigt 8,9,10. We ontwikkelden G-medium, een nieuw geconditioneerd inentingsmedium dat spontaan epidermale van dermale cellen scheidt en de groei en opbrengst van primaire epidermale cellenondersteunt 8,9,10. In de huidige studie ontwikkelden we een nieuwe serumvrije isolatie- en kweektechniek voor gingivale epitheelcellen door G-medium te combineren met Y-27632. In essentie is onze methode gebaseerd op een vereenvoudiging van de traditionele tweestaps enzymatische methode, dus hebben we onze nieuwe methode vergeleken met de directe explantmethode. Deze gemodificeerde enzymatische methode verkort aanzienlijk de tijd die nodig is om gingivale epitheelcellen te scheiden van gingivaal weefsel en verhoogt de efficiëntie van het kweken van gingivale epitheelcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke weefsels die in dit protocol worden gebruikt, zijn verse volwassen gingivale weefsels die worden weggegooid bij extracties van aangetaste tanden op de afdeling Maxillofaciale Chirurgie volgens de richtlijnen van de Ethische Commissie voor Menselijk Onderzoek van de instelling (Protocolnr. GR201711, Datum: 27-02-2017).
1. Voorbereidingen
- Verzamel verse volwassen gingivale weefsels in buisjes van 15 ml met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 3% penicilline / streptomycine (P / S) en houd de weefsels op 4 ° C.
OPMERKING: Behandel de weefsels zoals hieronder beschreven binnen 24 uur na excisie.
2. Bereid reagentia en kweekmedium
- Bereid de wasoplossing voor: 3% P / S. Meng 50 ml PBS met 1,5 ml penicilline (100 E / ml) en 1, 5 ml streptomycine (100 mg / l).
- Bereid 500 ml groeifactorbevattend medium (G-medium genoemd): DMEM / F12 (3: 1) medium met 1% P / S, 2% B27 supplement, 20 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 40 ng / ml fibroblastgroeifactor 2 (FGF2) en 40 μg / ml fungizone.
- Bereid enzymverteringsoplossingen voor de nieuwe methode: Los 125 mg Dispase-poeder en 125 mg Type I collagenasepoeder op in 50 ml DMEM.
OPMERKING: Filtreer alle enzymoplossingen door een zeef van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C. - Bereid 500 ml van het medium om de enzymatische spijsvertering te neutraliseren: 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% P / S in het DMEM-medium.
3. Directe explantmethode
- Gingivale weefselvoorbehandeling
- Was gingivaal weefsel met 5 ml 75% ethanol gedurende 30 s. Spoel vervolgens tweemaal met 5 ml van de wasoplossing (stap 2.1) gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Voer alle wasbeurten uit in celkweekschalen met een diameter van 50 mm.
- Was gingivaal weefsel met 5 ml 75% ethanol gedurende 30 s. Spoel vervolgens tweemaal met 5 ml van de wasoplossing (stap 2.1) gedurende 5 minuten.
- Gingivale epitheelcelkweek
- Snijd het tandvleesweefsel in 1 mm3 stukken en strooi ze in een celkweekschaal van 100 mm. Gebruik fijne puntige tang en oogheelkundige schaar voor de snijbewerkingen.
- Voeg het G-medium (stap 2.2) toe aan de kweekschaal. Incubeer vervolgens de kweekschaal in een 5% CO2-incubator bij 37 °C. Gebruik een omgekeerde microscoop (40x) om de weefsels elke 24 uur te onderzoeken.
- Verwijder de gingivale weefselstukken wanneer de epitheelcellen zich hebben voortgeplant tot een diameter van 2-5 mm rond de weefselstukken. Vervang het G-medium elke 2-4 dagen.
4. De nieuwe gewijzigde enzymatische methode
- Gingivale weefselvoorbehandeling
- Volg hiervoor dezelfde stappen als beschreven voor de directe explantmethode, stap 3.1.1.
- Vertering van tandvleesweefsel
- Snijd het tandvleesweefsel in kleine stukjes, ongeveer <1 mm groot, met twee gesteriliseerde mesjes. Herhaal het proces van versnipperen met twee chirurgische messen.
- Voeg 1 ml dispase + collagenase-oplossing van 1,5 ml toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml die de stukjes gingivaalweefsel bevat en incubeer de buis vervolgens gedurende 15-20 minuten in een incubator bij 37 °C.
- Wanneer het weefsel transparant en vlokig wordt, voegt u 1 ml van de neutralisatieoplossing toe om de spijsvertering te beëindigen. Meng de oplossing grondig door 10-15 keer op en neer te pipetteren. Passeer de oplossing door een gaasfilter van 100 μm.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel aan de onderkant in 10 ml groeifactorbevattend medium (stap 2.2). Breng de celsuspensie over naar een celkweekschaal van 100 mm. Voeg 10 μM Y-27632 toe aan de celkweekschaal.
- Kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 incubator. Vervang de oude G-medium om de 2 dagen door het verse G-medium. Observeer de cellen op dag 1 en dag 3.
5. Cel passaging
- Haal de schaal uit de couveuse, verwijder het gebruikte medium en was twee keer met PBS. Voeg 2 ml 0,05% trypsine toe voor elke schaal van 100 mm.
OPMERKING: Schud het gerecht om ervoor te zorgen dat er voldoende contact is tussen de Trypsin-oplossing en de bodem van het gerecht. - Laat de schaal ongeveer 5 min bij 37 °C in een couveuse staan voor het verteringsproces.
- Gebruik een microscoop (40x) om de cellen te onderzoeken en zorg ervoor dat de meeste cellen zijn gescheiden van de bodem van de schaal.
- Voeg 2 ml van de neutralisatieoplossing toe om de spijsvertering te stoppen en breng de cellen over in een buis van 15 ml. Pipetteer 10-15 keer op en neer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g.
- Verwijder het supernatant langzaam. Resuspend de cellen met 10 ml G-medium en tel het aantal cellen.
- Voeg ongeveer 1 x 106 cellen in 10 ml G-medium en 10 μM Y-27632 toe aan elke schaal van 100 mm.
- Vernieuw de G-medium en Y-27632 elke 2 dagen. Bekijk de cellen op dag 1 en dag 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een schematisch diagram van de directe explantmethode en de gemodificeerde enzymatische methode. De directe explantmethode heeft tijdens het hele proces geen spijsverteringsenzym nodig. Daarentegen heeft de traditionele enzymatische methode meestal twee sets spijsverteringsenzymen nodig, dispase en collagenase, om de epitheelplaat van de onderliggende fibroblastlaag te scheiden en vervolgens trypsine om de epitheelcellen in suspensie vrij te maken. Onze nieuwe methode laat de stap van scheiding weg en is een vereenvoudigde enzymatische methode. Bovendien bevordert het toevoegen van Y-27632 aan het G-medium effectief de groei van epitheelcellen. De directe explantmethode duurt meestal ongeveer 2 weken voordat de gingivale epitheelcellen voldoende groeien om te passeren en is gemakkelijk besmet. Het aantal gingivale epitheelcellen dat door de nieuwe methode wordt verkregen, is echter aanzienlijk groter dan het aantal dat wordt verkregen door de directe explantmethode en het duurt gemiddeld slechts 8 dagen om aan de vereisten voor passaging te voldoen.
Figuur 1: Vergelijking van de directe explantmethode en de nieuwe methode. (A) Schema met het proces van de directe explantmethode. De gingivale weefselstukken worden in een kweekschaal geplaatst. De epitheelcellen worden gekweekt in G-medium en groeien uit de weefselstukken. De directe explantmethode duurt meestal ongeveer 13 dagen voordat de epitheelcellen 80% confluentie bereiken. B)Schema met het proces van de nieuwe enzymatische methode. De gingivale weefselfragmenten worden verteerd door dispase en collagenase I, waarna de celkorrels in G-medium met Y-27632 worden gekweekt. De nieuwe enzymatische methode duurt meestal ongeveer 6 dagen om 80% confluentie te bereiken, wat geschikt is voor passageing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Volwassen gingivale epitheelcellen bereid met de directe explantmethode en volgens de nieuwe methode werden waargenomen in een microscoop op de derde en zevende dag (figuur 2A). Het is te zien dat de nieuwe methode de productie van gingivale epitheelcellen op de derde en zevende dag aanzienlijk verhoogde. De groeicurven van gingivale epitheelcellen verkregen door de nieuwe methode en door de directe explantmethode werden gemeten met behulp van een celtelset (CCK-8) op verschillende tijdstippen (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d) (Figuur 2B). De verdubbelingstijd van cellen bereid met behulp van de nieuwe methode was ongeveer 1-2 dagen, maar de verdubbelingstijd van cellen bereid met behulp van de directe explantmethode was ongeveer 5-6 dagen. De celopbrengsten volgens de twee methoden werden berekend op de zevende dag (figuur 2C) en toonden aan dat het aantal cellen geproduceerd door de nieuwe methode (9 x 106) meer dan drie keer hoger was dan het aantal cellen geproduceerd door de directe explantmethode (3 x 106). Figuur 2D laat zien dat het ongeveer de helft van de tijd duurde voordat de nieuwe methode (6 dagen) 80% confluentie had bereikt in vergelijking met de directe explantmethode (13 dagen).
Figuur 2: De nieuwe enzymatische methode verhoogt de productie van primaire gingivale epitheelcellen. A) Afbeeldingen van gingivale epitheelcellen bereid met de directe explantmethode (onderste rij) en de nieuwe enzymatische methode (bovenste rij) op de derde en zevende dag na de eerste inenting. Schaalstaven = 200 μm. (B) Gingivale epitheelcellen gekweekt door de directe methode en de nieuwe enzymatische methode werden verzameld op dag 1, 2, 3, 4, 5 en 6, en het aantal gingivale epitheelcellen werd geanalyseerd met behulp van een CCK-8-kit. Na7 dagen kweek werden gingivale epitheelcellen losgemaakt door trypsine en verzameld. Een celtelplaat werd gebruikt om het aantal gingivale epitheelcellen te bepalen dat afzonderlijk door de twee methoden werd bereid. Het aantal cellen werd berekend uit de twee methoden, die drie keer afzonderlijk werden herhaald, en de resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde aantal cellen per 100 mm schaal. D) De gemiddelde tijd tot het bereiken van 80% confluentie van primaire gingivale epitheelcellen (passage 0) bereid door de nieuwe enzymatische methode en door de directe explantmethode wordt vergeleken. B, C en D: De t-toetsvan de student werd gebruikt; de foutbalken geven de standaarddeviatie weer; n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 bij vergelijking van de nieuwe enzymatische methode met de directe explantmethode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Immunofluorescentieanalyse van gingivale epitheelcellen (bij passage 3) verkregen door de nieuwe methode toonde aan dat de expressie van CK5, CK18 en Pan-CK (CK14, CK15, CK16 en CK19) positief was (Figuur 3A, C, D)11,12,13,14,15, terwijl de expressie van CK10 en vimentine laag was ( Figuur3B,E)11,16. CK5 en Pan-CK (CK14, CK15, CK16 en CK19) waren voornamelijk gelokaliseerd in de basale laag van epitheelcellen, wat een teken is van hun hoge differentiatiepotentieel11,14,15. CK10 is een marker van gedifferentieerd epitheel11, en vimentine is een marker van gingivale fibroblasten16. De keratinepositieve snelheid van gingivale epitheelcellen geïsoleerd door de nieuwe methode was hoger, vooral CK5, CK18 en Pan-CK (Figuur 3A, C, D), wat aangaf dat de geïsoleerde gingivale epitheelcellen een goede keldermembraanfunctie konden behouden. De lage expressie van de differentiatiemarker CK10 (figuur 3B) gaf aan dat de gingivale epitheelcellen een hoog differentiatiepotentieel hadden. In vitro culturen toonden aan dat de gingivale epitheelcellen geïsoleerd door de nieuwe methode konden worden gekweekt tot de achtste generatie, en de lage expressie van vimentine gaf aan dat de gingivale epitheelcellen een hoge zuiverheid hadden, dat geen gingivale fibroblasten hen verontreinigden en dat de isolatie-efficiëntie hoog was (Figuur 3E).
Figuur 3: Specifieke markers van gingivale epitheelcellen (P3) bereid door de nieuwe enzymatische methode. (A-E) tonen CK5 (rood), CK10 (rood), CK18 (rood), Pan-CK (rood) en vimentine (rood) positieve cellen, DAPI (blauw) werd gebruikt om kernen te kleuren. (A-C) schaalstaven = 100 μm; (D) en (E) schaalbalken = 50 μm; het experiment werd vier keer onafhankelijk van elkaar herhaald. (A), (C) en (D) tonen de positieve expressie van CK5, CK18 en pan-ck (CK14, 15, 16 en 19) in gingivale epitheelcellen, terwijl (B) en (E) de lage expressie van CK10 en vimentine in gingivale epitheelcellen laten zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De nieuwe methode verhoogde de expressie van ki67, p63 en p75NGFR (lage affiniteit zenuwgroeifactor receptor p75) in primaire gingivale epitheelcellen. Passage 3-cellen werden geselecteerd voor immunofluorescentieanalyse, waaruit bleek dat de positieve expressie van ki67, p63 en p75NGFR hoger was dan die van gingivale epitheelcellen verkregen door de directe explantmethode (Figuur 4A,C, E). De positieve expressiepercentages van ki67, p63 en p75NGFR waren respectievelijk 80%, 98% en 96% in de nieuwe methode, die significant hoger waren dan die van ki67 (35%), p63 (40%) en p75NGFR (47%) verkregen door de directe methode (Figuur 4B,D, F). Ki67, p63 en p75NGFR zijn markers van orale epitheelstamcellen17. Deze resultaten gaven aan dat de primaire gingivale epitheelcellen die met behulp van de nieuwe methode werden geïsoleerd en gekweekt, stamcelpopulaties bevatten, een hoog proliferatiepotentieel hadden en de stamceleigenschappen van gingivale epitheelcellen behielden.
Figuur 4: Stamcelkenmerken van gingivale epitheelcellen (P3) verkregen door de directe explantmethode en de nieuwe enzymatische methode. (A), (C) en (E) tonen representatieve immunofluorescentiebeelden van gingivale epitheelcellen bij passage 3 (P3), respectievelijk met ki67 (rood), p63 (rood) en p75NGFR (rood) positieve cellen verkregen door de directe explantmethode en de nieuwe enzymatische methode. DAPI (blauw) werd gebruikt om kernen te beitsen. Schaalstaven = 50 μm. (B), (D) en (F) tonen kwantitatieve analyse van respectievelijk ki67-positieve cellen, p63-positieve cellen en p75NGFR-positieve cellen in gingivale epitheelcellen (P3) verkregen door de directe explantmethode en door de nieuwe enzymatische methode. Een totaal van 400 cellen werden geteld om elke groep te kwantificeren, en de gemiddelde aantallen ki67, p63 en p75NGFR positieve cellen worden getoond. B, D en F: Student's t-test werd gebruikt; de foutbalken geven de standaarddeviatie weer; het experiment werd vier keer onafhankelijk herhaald (n = 4); **p < 0,01, bij vergelijking van de nieuwe enzymatische methode met de directe explantmethode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gingivale weefsel is een belangrijke structuur die parodontale integriteit en gezondheid handhaaft. Gingivale epitheelcellen spelen een belangrijke rol bij het herstel en de regeneratie van parodontaal weefsel en kunnen worden gebruikt in wetenschappelijk onderzoek en klinische toepassingen en aanverwante gebieden, waaronder orale biologie, farmacologie, toxicologie en mondslijmvliesdeficiënties18. Daarom is het noodzakelijk om een stabiele en efficiënte methode te ontwikkelen om orale epitheelcellen te oogsten19. Primaire epitheelcellen zijn een soort volledig gedifferentieerde cellen met weinig passages en een korte levensduur. Het kweken van epitheelcellen is complexer gebleken dan het kweken van fibroblasten5.
Op dit moment laat de gepubliceerde literatuur zien dat er verschillende protocollen bestaan voor de isolatie en kweek van epitheelcellen. Twee methoden, de directe explantmethode en de enzymatische methode, worden echter het meest gebruikt onder die protocollen. In 1910 beschreven Carrel en Burrows voor het eerst een methode om gingivale en buccale epitheelcellen te verkrijgen, de directe explantmethode20. De directe explantmethode heeft de voordelen van een laag gewicht voor weefselmonsters, minder gecompliceerde procedures, minder variatie en minder betrokkenheid bij de stappen, maar het heeft de nadelen dat het een lange kweektijd vereist en is zeer gevoelig voor besmetting5. In 1975 rapporteerden Rheinwald en Green voor het eerst de enzymatische methode met behulp van bestraalde 3T3-muisfibroblasten als feederlaag om orale epitheelcellen in vitrotekweken 21. Hoewel die methode de opbrengst van keratinocyten sterk verbeterde, had de bestraalde muizenvoedercellaag potentiële biologische risico's22. Daarna werden kweeksystemen zonder feedercellen22 en zonder serum23,24 ontwikkeld die bewezen dat 3T3-cellen niet nodig waren voor epitheelcelculturen. Hoewel de enzymatische methode minder kweektijd vereist, is de efficiëntie relatief laag en varieert afhankelijk van de gebruikte enzymen en het gebruikte medium25. Verschillende laboratoria vergeleken de twee methoden en Kedjarune et al.6 observeerden dat de directe explantingtechniek succesvoller was dan de enzymatische methode en vonden een hogere snelheid van celproliferatie. Shwetha et al.26 concludeerden dat de directe explantmethode een eenvoudige en succesvolle techniek lijkt te zijn voor de isolatie van orale mucosale keratinocyten. Klingbeil et al.7 concludeerden echter precies het tegenovergestelde, d.w.z. de enzymatische methode toonde de beste resultaten in minder tijd met een goede levensduur. Een onderzoek uitgevoerd in het Verenigd Koninkrijk door Daniels et al.19 beoordeelde de isolatie- en celkweekmethoden van menselijke keratinocyten en meldde dat 21 van de 34 laboratoria die reageerden de enzymatische methode met enkele variaties gebruikten. Hoewel de directe explantmethode minder weefsel vereist en minder handelingen heeft dan de enzymatische methode, is gesuggereerd dat de enzymatische methode sneller en gemakkelijker te beheren is6. Daarom was het noodzakelijk om een handigere en effectievere methode te ontwikkelen voor de isolatie en kweek van orale epitheelcellen4. Onze nieuwe methode, een vereenvoudigde enzymatische methode die Y-27632 gebruikt, verhoogde de productie van gingivale epitheelcellen aanzienlijk en verkortte de tijd die nodig was om gingivale epitheelcellen van gingivaal weefsel te scheiden.
Figuur 2A laat zien dat de nieuwe methode de productie van gingivale epitheelcellen op de derde en zevende dag aanzienlijk verhoogde. Figuur 2B laat zien dat de verdubbelingstijd van cellen bereid met behulp van de nieuwe enzymatische methode ongeveer 1-2 dagen was, maar dat het gebruik van de directe explantmethode ongeveer 5-6 dagen duurde. Het aantal cellen geproduceerd met behulp van de nieuwe enzymatische methode (9 x 106) was meer dan drie keer groter dan de directe explantmethode (3 x 106) op de zevende dag (figuur 2C). Cellen bereid met behulp van de nieuwe enzymatische methode duurde 13 dagen om 80% confluent te worden, wat consistent is met eerdere studies, terwijl de directe explantmethode ongeveer 2 wekenduurde 6,20,25 ± 1,05 dagen18 en 14,2 ± 2,76 dagen7 voordat de cellen volledig confluent werden vóór subcultuur. De nieuwe enzymatische methode duurde echter slechts 6 dagen om 80% confluent te worden, wat veel korter is dan de directe explantmethode van 13 dagen in ons laboratorium en de7 enzymatische methode van Klingbeil et al. van 11,9 ± 2,36 dagen. We vonden ook een interessant fenomeen, dat wil zeggen dat de epitheelcelkolonies groeiden in een meerlagige structuur in de directe explantmethode, terwijl een uniforme monolaagstructuur werd waargenomen met behulp van de nieuwe enzymatische methode. Het is duidelijk dat dikkere meerlagige kolonies de tijd verlengen die nodig is om 80% -100% confluent te worden. De reden waarom de nieuwe enzymatische methode celproliferatie bevordert, is de toevoeging van Y-27632, een remmer van ROCK1 en ROCK2. Y-27632 werd aanvankelijk gemeld voor zijn positieve effecten op de proliferatie en differentiatie van menselijke epitheelcellen in 200827. Chapman et al.28 rapporteerden dat behandeling met Y-27632 de proliferatieve capaciteit van keratinocyten sterk verhoogde en resulteerde in efficiënte onsterfelijkheid zonder detecteerbare celcrisis. In onze eerdere studies ontdekten we dat Y-27632 de isolatieprocedure van menselijke primaire epidermale cellen en keratinocyten van volwassen huidweefselvereenvoudigt 8,9,10. Strudwick et al.29 meldden dat het gebruik van 10 μM Y-27632 samen met een laag calcium het mogelijk maakte om primaire menselijke keratinocyten gedurende langere tijd zonder celfeederlaag te cultureren met behoud van het vermogen om te differentiëren en een gelaagd epitheel te vormen. In deze studie verhoogde de nieuwe enzymatische methode met behulp van Y-27632 het oogsten van epitheelcellen aanzienlijk door hun levensduur te verlengen en hun proliferatieve capaciteit te bevorderen.
De traditionele enzymatische methode omvat twee verteringsoperaties. De eerste spijsvertering is om epitheelweefsel te scheiden van bindweefsel met behulp van dispase, dat werkt vanaf de stromale kant4,5. De tweede spijsvertering gebruikt meestal trypsine om epitheelcellen te scheiden van epitheelweefsel4,5. Vanwege de vernietiging van epitheelcellen door trypsine wordt de efficiëntie van de enzymatische methode beïnvloed4. De nieuwe enzymatische methode die hier wordt beschreven, is een vereenvoudigde methode die één verteringsstap weglaat. De belangrijkste verschillen tussen de nieuwe en traditionele enzymatische methoden hebben betrekking op de protocollen voor het scheiden van epitheelweefsel van bindweefsel5. Bovendien gebruikt de nieuwe methode dispase en collagenase in plaats van trypsine in de verteringsstap, waardoor de integriteit van de epitheelcellen goed wordt beschermd. Klinisch gezien is het veel moeilijker om dezelfde hoeveelheid weefsel uit menselijke gingiva te verkrijgen dan uit de huid en het mondslijmvlies. De directe explantmethode vereiste slechts kleine stukjes gingivaal weefsel en kweekte een groter aantal cellen in vergelijking met de enzymatische methode18. We behandelden een kleine hoeveelheid gingivaal epitheelweefsel met behulp van de nieuwe methode en oogstten een zeer bevredigende celdichtheid. Hieruit blijkt dat de nieuwe methode niet afhankelijk is van relatief grote hoeveelheden weefsel die in eerste instantie moeten worden verstrekt. Een mogelijke beperking van de nieuwe methode is dat er een kleine hoeveelheid (<5%) besmetting van fibroblasten kan optreden bij de initiële kweek (passage 0), maar deze kan gemakkelijk worden verwijderd door een kortdurende behandeling van 0,05% trypsine zoals gemeld vóór9.
In deze studie waren CK5, CK18 en Pan-CK (CK14, CK15, CK16 en CK19) positief(figuur 3A,C, D). Dit suggereerde dat de geïsoleerde gingivale epitheelcellen in staat waren om hun keldermembraanfunctie te behouden, wat consistent is met de studies van Orazizadeh et al.30 en Kedjarune et al.6. CK5 en CK14 worden uitgedrukt door ongedifferentieerde cellen gelokaliseerd in de epitheel-basale laag. CK19 wordt meestal gevonden in eenvoudig epitheel en in niet-verhoornd gestratificeerd epitheel31. Immunofluorescentieanalyse van gingivale epitheelcellen (P3) verkregen met behulp van de nieuwe enzymatische methode toonde aan dat de expressieniveaus van ki67, p63 en p75NGFR hoger waren dan in cellen verkregen met behulp van de directe explantmethode (figuur 4). Dit resultaat geeft aan dat de nieuwe methode de stamceleigenschappen van gingivale epitheelcellen kan behouden en het proliferatiepotentieel van gingivale epitheelcellen bevordert. Onze vorige studie wees uit dat Y-27632 het epidermale stamcelpotentieel van de huid handhaaft na expansie8. Wang et al. vonden dat Y-27632 de proliferatie, migratie en pluripotentie van menselijke parodontale ligamentstamcellenvergemakkelijkt 32.
Samenvattend biedt de nieuwe gemodificeerde enzymatische methode een vereenvoudigde en effectieve procedure om menselijke primaire epitheelcellen te isoleren en te kweken uit volwassen gingivaal weefsel. Deze nieuwe methode is eenvoudiger, minder tijdrovend en verbetert hun stamceleigenschappen, en heeft dus duidelijke voordelen ten opzichte van de directe explantmethode in veel parameters. Deze geavanceerde methode is meer geschikt voor het produceren van grote aantallen epitheelcellen met een hoog potentieel, zowel voor laboratorium- als voor klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Key Program van Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) en het Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2019GSF108107) aan X.W.; het Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2018GSF118240) aan J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project van de provincie Shandong (2018WS163) tot Z.X., en het Medical and Health Science and Technology Development Project van de provincie Shandong (2019WS045) tot J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
