Summary
Nous présentons ici une méthode modifiée pour l’isolement et la culture de cellules épithéliales gingivales humaines en ajoutant l’inhibiteur de Rock, Y-27632, à la méthode traditionnelle. Cette méthode est plus facile, prend moins de temps, améliore les propriétés des cellules souches et produit un plus grand nombre de cellules épithéliales à fort potentiel à la fois pour le laboratoire et pour les applications cliniques.
Abstract
Le tissu gingival est la première structure qui protège les tissus parodontaux et joue un rôle significatif dans de nombreuses fonctions buccales. L’épithélium gingival est une structure importante du tissu gingival, en particulier dans la réparation et la régénération du tissu parodontal. L’étude des fonctions des cellules épithéliales gingivales a une valeur scientifique cruciale, comme la réparation des défauts buccaux et la détection de la compatibilité des biomatériaux. Comme les cellules épithéliales gingivales humaines sont des cellules kératinisées hautement différenciées, leur durée de vie est courte et elles sont difficiles à passer. Jusqu’à présent, il n’existe que deux façons d’isoler et de mettre en culture des cellules épithéliales gingivales, une méthode d’explantation directe et une méthode enzymatique. Cependant, le temps nécessaire pour obtenir des cellules épithéliales en utilisant la méthode d’explantation directe est plus long et le taux de survie cellulaire de la méthode enzymatique est plus faible. Cliniquement, l’acquisition de tissu gingival est limitée, de sorte qu’un système d’isolement et de culture in vitro stable, efficace et simple est nécessaire. Nous avons amélioré la méthode enzymatique traditionnelle en ajoutant Y-27632, un inhibiteur de la kinase rho-associée (ROCK), qui peut favoriser sélectivement la croissance des cellules épithéliales. Notre méthode enzymatique modifiée simplifie les étapes de la méthode enzymatique traditionnelle et augmente l’efficacité de la culture des cellules épithéliales, ce qui présente des avantages significatifs par rapport à la méthode d’explantation directe et à la méthode enzymatique.
Introduction
La gencive humaine, la structure de défense de première ligne qui protège le tissu parodontal, n’est pas seulement une barrière physique et chimique1,mais sécrète également différentes classes de médiateurs inflammatoires qui participent aux réponses immunitaires et constituent une barrière immunitaire2,3. L’épithélium gingival joue un rôle important dans la réparation et la régénération du tissu parodontal. Par conséquent, l’étude de la défense et de l’immunité de l’épithélium gingival est d’une grande importance pour comprendre l’apparition, le diagnostic et le traitement de la parodontite. L’isolement et la culture de cellules épithéliales gingivales à partir de tissu gingival humain est la première étape nécessaire à l’étude de l’épithélium gingival. Une telle procédure nécessite des opérations de base telles que la production de cellules de semence pour l’ingénierie tissulaire, des modèles in vitro de maladies associées parodontales et des matériaux pour réparer les défauts parodontaux.
Les cellules épithéliales gingivales primaires sont caractérisées par un faible taux de division in vitro4,les chercheurs recherchent depuis des décennies une méthode optimale d’isolement et de culture. À ce jour, deux techniques différentes, une méthode d’explantation directe et une méthode enzymatique, sont couramment utilisées en laboratoire pour obtenir des cellules primaires de l’épithélium gingival in vitro4,5. La méthode d’explantation directe présente des avantages tels que l’exigence d’une quantité plus faible d’échantillons de tissus et d’une procédure d’isolement simple, mais elle présente les inconvénients d’un temps de culture plus long et d’une susceptibilité à la contamination5. Bien que la méthode enzymatique raccourcisse le temps de culture requis, l’efficacité est relativement faible et varie en fonction des enzymes et du milieu utilisés. Kedjarune et al.6 ont montré que la méthode de l’explantation directe, qui nécessite plus de temps avant la sous-culture (2 semaines), semblait être plus efficace pour la culture des cellules épithéliales gingivales que la méthode enzymatique. Cependant, en comparant ces deux méthodes, Klingbeil et al.7 ont constaté que la méthode enzymatique avait les meilleurs résultats pour les cultures primaires de cellules épithéliales orales, et qu’il était possible d’obtenir le rendement cellulaire optimal dans les plus brefs délais (11,9 jours contre 14,2 jours).
Par conséquent, il était important de développer une méthode plus pratique et efficace pour l’isolement et la culture des cellules épithéliales orales4. Nous avons précédemment rapporté que l’ajout de Y-27632, un inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK), simplifie la procédure d’isolement des cellules épidermiques primaires humaines et des kératinocytes des tissus cutanés adultes8,9,10. Nous avons développé le milieu G, un nouveau milieu d’inoculation conditionné qui sépare spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques et soutient la croissance et le rendement des cellules épidermiques primaires8,9,10. Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle technique d’isolement et de culture sans sérum pour les cellules épithéliales gingivales en combinant le milieu G avec Y-27632. En substance, notre méthode est basée sur une simplification de la méthode enzymatique traditionnelle en deux étapes, nous avons donc comparé notre nouvelle méthode avec la méthode d’explantation directe. Cette méthode enzymatique modifiée raccourcit considérablement le temps nécessaire pour séparer les cellules épithéliales gingivales du tissu gingival et augmente l’efficacité de la culture des cellules épithéliales gingivales.
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Protocol
Les tissus humains utilisés dans ce protocole sont des tissus gingivaux adultes frais jetés à partir d’extractions de dents touchées dans le département de chirurgie maxillo-faciale conformément aux lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche humaine de l’institution (Protocole No. GR201711, Date: 27-02-2017).
1. Préparatifs
- Prélever les tissus gingivaux adultes frais dans des tubes de 15 mL contenant 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) complétée par 3 % de pénicilline/streptomycine (P/S) et maintenir les tissus à 4 °C.
REMARQUE: Traiter les tissus comme détaillé ci-dessous dans les 24 heures suivant l’excision.
2. Préparer les réactifs et le milieu de culture
- Préparer la solution de lavage : 3 % P/S. Mélanger 50 mL de PBS avec 1,5 mL de pénicilline (100 U/mL) et 1,5 mL de streptomycine (100 mg/L).
- Préparer 500 mL de milieu contenant du facteur de croissance (appelé milieu G) : milieu DMEM/F12 (3:1) contenant 1 % de P/S, 2 % de supplément de B27, 20 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF), 40 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2) et 40 μg/mL de fongicide.
- Préparer des solutions de digestion enzymatique pour la nouvelle méthode: Dissoudre 125 mg de poudre de Dispase et 125 mg de poudre de collagénase de type I dans 50 mL de DMEM.
REMARQUE: Filtrer toutes les solutions enzymatiques à travers une passoire de 0,22 μm et conserver à 4 ° C. - Préparer 500 mL du milieu pour neutraliser la digestion enzymatique : 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de P/S dans le milieu DMEM.
3. Méthode d’explantation directe
- Prétraitement du tissu gingival
- Laver le tissu gingival avec 5 mL d’éthanol à 75 % pendant 30 s. Ensuite, rincez deux fois avec 5 mL de la solution de lavage (étape 2.1) pendant 5 min.
REMARQUE: Effectuer tous les lavages dans des plats de culture cellulaire d’un diamètre de 50 mm.
- Laver le tissu gingival avec 5 mL d’éthanol à 75 % pendant 30 s. Ensuite, rincez deux fois avec 5 mL de la solution de lavage (étape 2.1) pendant 5 min.
- Culture de cellules épithéliales gingivales
- Coupez le tissu gingival en morceauxde 1 mm 3 et dispersez-les dans un plat de culture cellulaire de 100 mm. Utilisez des pinces pointues fines et des ciseaux ophtalmiques pour les opérations de coupe.
- Ajouter le milieu G (étape 2.2) au plat de culture. Ensuite, incubez le plat de culture dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 °C. Utilisez un microscope inversé (40x) pour examiner les tissus toutes les 24 heures.
- Retirez les morceaux de tissu gingival lorsque les cellules épithéliales se sont propagées à un diamètre de 2 à 5 mm autour des morceaux de tissu. Changez le G-medium tous les 2-4 jours.
4. La nouvelle méthode enzymatique modifiée
- Prétraitement du tissu gingival
- Pour cela, suivez les mêmes étapes que celle décrite pour la méthode d’explantation directe, étape 3.1.1.
- Digestion du tissu gingival
- Coupez le tissu gingival en petits morceaux, d’environ <1 mm, avec deux lames stérilisées. Répétez le processus de déchiquetage avec deux lames chirurgicales.
- Ajouter 1 mL de solution de dispase + collagénase de 2,5 mg/mL dans un tube centrifuge de 1,5 mL contenant les morceaux de tissu gingival, puis incuber le tube pendant 15 à 20 min dans un incubateur à 37 °C.
- Lorsque le tissu devient transparent et floculant, ajouter 1 mL de la solution de neutralisation pour mettre fin à la digestion. Bien mélanger la solution en pipetant de haut en bas 10-15 fois. Faire passer la solution à travers un filtre maillé de 100 μm.
- Centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et ressuspend la pastille cellulaire au fond dans 10 mL de milieu contenant du facteur de croissance (étape 2.2). Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm. Ajouter 10 μM de Y-27632 à la boîte de culture cellulaire.
- Culturez les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Remplacez l’ancien milieu G par le milieu G frais tous les 2 jours. Observez les cellules le jour 1 et le jour 3.
5. Passage cellulaire
- Sortez le plat de l’incubateur, retirez le milieu usé et lavez-le deux fois avec du PBS. Ajouter 2 mL de trypsine à 0,05 % pour chaque plat de 100 mm.
REMARQUE: Secouez le plat pour vous assurer qu’il y a suffisamment de contact entre la solution de trypsine et le fond du plat. - Laisser le plat dans un incubateur environ 5 min à 37 °C pour le processus de digestion.
- Utilisez un microscope (40x) pour examiner les cellules et assurez-vous que la plupart des cellules se sont séparées du fond du plat.
- Ajouter 2 mL de la solution de neutralisation pour arrêter la digestion et transférer les cellules dans un tube de 15 mL. Pipette de haut en bas 10-15 fois. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min.
- Retirez le surnageant lentement. Resuspendez les cellules avec 10 mL de milieu G et comptez le nombre de cellules.
- Ajouter environ 1 x 106 cellules dans 10 mL de milieu G et 10 μM Y-27632 à chaque plat de 100 mm.
- Renouvelez le G-medium et le Y-27632 tous les 2 jours. Affichez les cellules le jour 1 et le jour 5.
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Representative Results
La figure 1 montre un diagramme schématique de la méthode d’explant direct et de la méthode enzymatique modifiée. La méthode d’explantation directe ne nécessite aucune enzyme digestive pendant tout le processus. En revanche, la méthode enzymatique traditionnelle a généralement besoin de deux ensembles d’enzymes digestives, la dispase et la collagénase, pour séparer la feuille épithéliale de la couche de fibroblastes sous-jacente, puis de la trypsine pour libérer les cellules épithéliales en suspension. Notre nouvelle méthode omet l’étape de séparation et est une méthode enzymatique simplifiée. De plus, l’ajout de Y-27632 au milieu G favorise efficacement la croissance des cellules épithéliales. La méthode d’explantation directe prend généralement environ 2 semaines pour que les cellules épithéliales gingivales se développent suffisamment pour passer et sont facilement contaminées. Cependant, le nombre de cellules épithéliales gingivales obtenues par la nouvelle méthode est significativement plus important que celui obtenu par la méthode d’explantation directe et ne prend en moyenne que 8 jours pour répondre aux exigences de passage.
Figure 1: Comparaison de la méthode d’explantation directe et de la nouvelle méthode. (A) Schéma montrant le processus de la méthode d’explantation directe. Les morceaux de tissu gingival sont placés dans un plat de culture. Les cellules épithéliales sont cultivées en milieu G et se développent à partir des morceaux de tissu. La méthode d’explantation directe prend généralement environ 13 jours pour que les cellules épithéliales atteignent 80% de confluence. (B) Schéma montrant le processus de la nouvelle méthode enzymatique. Les fragments de tissu gingival sont digérés par la dispase et la collagénase I, après quoi les granulés cellulaires sont cultivés en milieu G avec Y-27632. La nouvelle méthode enzymatique prend généralement environ 6 jours pour atteindre 80% de confluence, ce qui convient au passage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Des cellules épithéliales gingivales adultes préparées par la méthode de l’explantation directe et par la nouvelle méthode ont été observées au microscope les troisième et septième jours(figure 2A). On peut voir que la nouvelle méthode a considérablement augmenté la production de cellules épithéliales gingivales aux troisième et septième jours. Les courbes de croissance des cellules épithéliales gingivales obtenues par la nouvelle méthode et par la méthode de l’explantation directe ont été mesurées à l’aide d’un kit de comptage cellulaire (CCK-8) à différents points temporels (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d)(Figure 2B). Le temps de doublement des cellules préparées à l’aide de la nouvelle méthode était d’environ 1 à 2 jours, mais le temps de doublement des cellules préparées à l’aide de la méthode d’explantation directe était d’environ 5 à 6 jours. Les rendements cellulaires par les deux méthodes ont été calculés le septième jour (Figure 2C) et ont montré que le nombre de cellules produites par la nouvelle méthode (9 x 106) était plus de trois fois plus élevé que le nombre de cellules produites par la méthode d’explantation directe (3 x 106). La figure 2D montre qu’il a fallu environ la moitié du temps à la nouvelle méthode (6 jours) pour atteindre 80% de confluence par rapport à la méthode d’explantation directe (13 jours).
Figure 2: La nouvelle méthode enzymatique augmente la production de cellules épithéliales gingivales primaires. (A) Images de cellules épithéliales gingivales préparées par la méthode de l’explantation directe (rangée du bas) et la nouvelle méthode enzymatique (rangée du haut) les troisième et septième jours après l’inoculation initiale. Barres d’échelle = 200 μm. (B) Les cellules épithéliales gingivales cultivées par la méthode directe et la nouvelle méthode enzymatique ont été collectées aux jours 1, 2, 3, 4, 5 et 6, et le nombre de cellules épithéliales gingivales a été analysé à l’aide d’un kit CCK-8. (C) Après 7 jours de culture, les cellules épithéliales gingivales ont été détachées par la trypsine et ont été collectées. Une plaque de comptage cellulaire a été utilisée pour déterminer le nombre de cellules épithéliales gingivales préparées séparément par les deux méthodes. Le nombre de cellules a été calculé à partir des deux méthodes, qui ont été répétées trois fois séparément, et les résultats sont exprimés comme le nombre moyen de cellules par plat de 100 mm. (D) Le temps moyen pour atteindre 80% de confluence des cellules épithéliales gingivales primaires (passage 0) préparées par la nouvelle méthode enzymatique et par la méthode d’explantation directe est comparé. B, C et D : Le test tde Student a été utilisé; les barres d’erreur indiquent l’écart-type; n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 en comparant la nouvelle méthode enzymatique avec la méthode d’explantation directe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’analyse d’immunofluorescence des cellules épithéliales gingivales (au passage 3) obtenue par la nouvelle méthode a montré que l’expression de CK5, CK18 et Pan-CK (CK14, CK15, CK16 et CK19) était positive(Figure 3A,C, D)11,12, 13,14,15, tandis que l’expression de CK10 et de vimentine était faible (Figure 3B, E)11,16. CK5 et Pan-CK (CK14, CK15, CK16 et CK19) étaient principalement localisés dans la couche basale des cellules épithéliales, ce qui est un signe de leur potentiel de différenciation élevé11,14,15. CK10 est un marqueur de l’épithéliumdifférencié 11, et la vimentine est un marqueur des fibroblastes gingivaux16. Le taux de kératine positive des cellules épithéliales gingivales isolées par la nouvelle méthode était plus élevé, en particulier CK5, CK18 et Pan-CK (Figure 3A,C, D), ce qui indiquait que les cellules épithéliales gingivales isolées pouvaient maintenir une bonne fonction de membrane basale. La faible expression du marqueur de différenciation CK10(figure 3B)indiquait que les cellules épithéliales gingivales avaient un potentiel de différenciation élevé. Les cultures in vitro ont montré que les cellules épithéliales gingivales isolées par la nouvelle méthode pouvaient être cultivées jusqu’à la huitième génération, et la faible expression de la vimentine indiquait que les cellules épithéliales gingivales avaient une grande pureté, qu’aucun fibroblaste gingival ne les contaminait et que l’efficacité d’isolement était élevée (Figure 3E).
Figure 3: Les marqueurs spécifiques des cellules épithéliales gingivales (P3) préparés par la nouvelle méthode enzymatique. (A-E) montrent CK5 (rouge), CK10 (rouge), CK18 (rouge), Pan-CK (rouge) et vimentine (rouge), DAPI (bleu) a été utilisé pour colorer les noyaux. Barresd’échelle(A-C) = 100 μm; barresd’échelle( D ) et (E) = 50 μm; l’expérience a été répétée quatre fois indépendamment. (A), (C) et (D) montrent l’expression positive de CK5, CK18 et pan-ck (CK14, 15, 16 et 19) dans les cellules épithéliales gingivales, tandis que (B) et (E) montrent la faible expression de CK10 et vimentine dans les cellules épithéliales gingivales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La nouvelle méthode a augmenté l’expression de ki67, p63 et p75NGFR (récepteur p75 du facteur de croissance nerveuse de faible affinité) dans les cellules épithéliales gingivales primaires. Les cellules du passage 3 ont été sélectionnées pour l’analyse d’immunofluorescence, qui a révélé que l’expression positive de ki67, p63 et p75NGFR était supérieure à celle des cellules épithéliales gingivales obtenues par la méthode de l’explantation directe(Figure 4A,C, E). Les taux d’expression positive de ki67, p63 et p75NGFR étaient respectivement de 80%, 98% et 96% dans la nouvelle méthode, qui étaient significativement plus élevés que ceux de ki67 (35%), p63 (40%) et p75NGFR (47%) obtenus par la méthode directe(Figure 4B,D, F). Ki67, p63 et p75NGFR sont des marqueurs des cellules souches épithéliales orales17. Ces résultats ont indiqué que les cellules épithéliales gingivales primaires isolées et cultivées à l’aide de la nouvelle méthode contenaient des populations de cellules souches, avaient un potentiel de prolifération élevé et conservaient les propriétés des cellules épithéliales gingivales.
Figure 4: Caractéristiques des cellules souches des cellules épithéliales gingivales (P3) obtenues par la méthode de l’explantation directe et la nouvelle méthode enzymatique. (A), (C) et (E) montrent des images d’immunofluorescence représentatives des cellules épithéliales gingivales au passage 3 (P3), respectivement, montrant des cellules positives ki67 (rouge), p63 (rouge) et p75NGFR (rouge) obtenues par la méthode d’explantation directe et la nouvelle méthode enzymatique. DAPI (bleu) a été utilisé pour tacher les noyaux. Les barres d’échelle = 50 μm. (B), (D) et (F) montrent une analyse quantitative des cellules ki67 positives, des cellules p63 positives et des cellules p75NGFR positives, respectivement, dans les cellules épithéliales gingivales (P3) obtenues par la méthode de l’explantation directe et par la nouvelle méthode enzymatique. Au total, 400 cellules ont été comptées pour quantifier chaque groupe, et le nombre moyen de cellules positives ki67, p63 et p75NGFR est indiqué. B, D et F : Le test tde Student a été utilisé; les barres d’erreur indiquent l’écart-type; l’expérience a été répétée quatre fois indépendamment (n = 4); **p < 0,01, en comparant la nouvelle méthode enzymatique avec la méthode d’explantation directe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le tissu gingival est une structure clé qui maintient l’intégrité parodontale et la santé. Les cellules épithéliales gingivales ont un rôle important dans la réparation et la régénération du tissu parodontal et peuvent être utilisées dans la recherche scientifique et les applications cliniques et dans des domaines connexes, y compris la biologie buccale, la pharmacologie, la toxicologie et les déficiences buccales de la muqueuse18. Par conséquent, il est nécessaire de développer une méthode stable et efficace pour récolter des cellules épithéliales orales19. Les cellules épithéliales primaires sont une sorte de cellules entièrement différenciées avec peu de passages et une courte durée de vie. La culture des cellules épithéliales s’est avérée plus complexe que la culture des fibroblastes5.
À l’heure actuelle, la littérature publiée montre qu’il existe divers protocoles pour l’isolement et la culture des cellules épithéliales. Cependant, deux méthodes, la méthode d’explantation directe et la méthode enzymatique, sont les plus fréquemment utilisées parmi ces protocoles. En 1910, Carrel et Burrows ont décrit pour la première fois une méthode pour obtenir des cellules épithéliales gingivales et buccales appelée méthode d’explantation directe20. La méthode d’explantation directe présente les avantages d’exigences de faible poids pour les échantillons de tissus, de procédures moins compliquées, de moins de variation et de moins d’implication dans les étapes, mais elle présente les inconvénients de nécessiter une longue période de culture et est très sensible à la contamination5. En 1975, Rheinwald et Green ont signalé pour la première fois la méthode enzymatique utilisant des fibroblastes de souris 3T3 irradiés comme couche nourricière pour la culture de cellules épithéliales orales in vitro21. Bien que cette méthode ait grandement amélioré le rendement en kératinocytes, la couche de cellules nourricière de souris irradiée comportait des risques biologiques potentiels22. Après cela, des systèmes de culture sans cellules nourrissoires22 et sans sérum23,24 ont été développés qui ont prouvé que les cellules 3T3 n’étaient pas nécessaires pour les cultures de cellules épithéliales. Bien que la méthode enzymatique nécessite moins de temps de culture, l’efficacité est relativement faible et varie en fonction des enzymes et du milieu utilisés25. Plusieurs laboratoires ont comparé les deux méthodes et Kedjarune et al.6 ont observé que la technique d’explantation directe était plus efficace que la méthode enzymatique et ont constaté un taux plus élevé de prolifération cellulaire. Shwetha et al.26 ont conclu que la méthode d’explantation directe semble être une technique simple et efficace pour l’isolement des kératinocytes de la muqueuse buccale. Cependant, Klingbeil et al.7 ont conclu exactement le contraire, c’est-à-dire que la méthode enzymatique a montré les meilleurs résultats en moins de temps avec une bonne durée de vie. Une enquête menée au Royaume-Uni par Daniels et al.19 a examiné les méthodes d’isolement et de culture cellulaire des kératinocytes humains et a rapporté que 21 des 34 laboratoires qui ont répondu ont utilisé la méthode enzymatique avec quelques variations. Bien que la méthode d’explantation directe nécessite moins de tissu et comporte moins d’étapes de manipulation que la méthode enzymatique, il a été suggéré que la méthode enzymatique est plus rapide et plus facile à gérer6. Par conséquent, il était nécessaire de développer une méthode plus pratique et efficace pour l’isolement et la culture des cellules épithéliales orales4. Notre nouvelle méthode, une méthode enzymatique simplifiée qui utilise Y-27632, a considérablement augmenté la production de cellules épithéliales gingivales et raccourci le temps nécessaire pour séparer les cellules épithéliales gingivales du tissu gingival.
La figure 2A montre que la nouvelle méthode a considérablement augmenté la production de cellules épithéliales gingivales aux troisième et septième jours. La figure 2B montre que le temps de doublement des cellules préparées à l’aide de la nouvelle méthode enzymatique était d’environ 1 à 2 jours, mais que l’utilisation de la méthode d’explantation directe a pris environ 5 à 6 jours. Le nombre de cellules produites à l’aide de la nouvelle méthode enzymatique (9 x10 6)était plus de trois fois supérieur à celui de la méthode d’explantation directe (3 x10 6)le septième jour(Figure 2C). Les cellules préparées à l’aide de la nouvelle méthode enzymatique ont mis 13 jours à devenir confluentes à 80%, ce qui est cohérent avec les études précédentes, tandis que la méthode d’explantation directe a pris environ 2 semaines6,20,25 ±1,05 jours 18 et 14,2 ± 2,76 jours7 pour que les cellules deviennent complètement confluentes avant la sous-culture. Cependant, la nouvelle méthode enzymatique n’a pris que 6 jours pour devenir confluente à 80%, ce qui est beaucoup plus court que la méthode d’explantation directe de 13 jours dans notre laboratoire et la méthode enzymatique7 de Klingbeil et al. de 11,9 ± 2,36 jours. Nous avons également trouvé un phénomène intéressant, c’est-à-dire que les colonies de cellules épithéliales se sont développées dans une structure multicouche dans la méthode de l’explantation directe, tandis qu’une structure monocouche uniforme a été observée en utilisant la nouvelle méthode enzymatique. De toute évidence, les colonies multicouches plus épaisses prolongent le temps nécessaire pour devenir confluentes à 80% à 100%. La raison pour laquelle la nouvelle méthode enzymatique favorise la prolifération cellulaire est l’ajout de Y-27632, un inhibiteur de ROCK1 et ROCK2. Y-27632 a été initialement signalé pour ses effets positifs sur la prolifération et la différenciation des cellules épithéliales humaines en 200827. Chapman et al.28 ont rapporté que le traitement par Y-27632 augmentait considérablement la capacité proliférative des kératinocytes et entraînait une immortalisation efficace sans crise cellulaire détectable. Dans nos études précédentes, nous avons découvert que Y-27632 simplifie la procédure d’isolement des cellules épidermiques primaires humaines et des kératinocytes du tissucutanéadulte8,9,10. Strudwick et al.29 ont rapporté que l’utilisation de 10 μM Y-27632 avec un faible taux de calcium a permis aux kératinocytes humains primaires d’être cultivés sans couche d’alimentation cellulaire pendant de plus longues périodes de temps tout en conservant la capacité de différencier et de former un épithélium stratifié. Dans cette étude, la nouvelle méthode enzymatique utilisant Y-27632 a considérablement augmenté la récolte des cellules épithéliales en prolongeant leur durée de vie et en favorisant leur capacité proliférative.
La méthode enzymatique traditionnelle contient deux opérations de digestion. La première digestion consiste à séparer le tissu épithélial du tissu conjonctif à l’aide de dispase, qui agit du côtéstromal 4,5. La deuxième digestion utilise généralement la trypsine pour séparer les cellules épithéliales du tissu épithélial4,5. En raison de la destruction des cellules épithéliales par la trypsine, l’efficacité de la méthode enzymatique est affectée4. La nouvelle méthode enzymatique décrite ici est une méthode simplifiée qui omet une étape de digestion. Les principales différences entre les méthodes enzymatiques nouvelles et traditionnelles se réfèrent aux protocoles de séparation du tissu épithélial du tissu conjonctif5. De plus, la nouvelle méthode utilise la dispase et la collagénase au lieu de la trypsine dans l’étape de digestion, et donc l’intégrité des cellules épithéliales est bien protégée. Cliniquement, il est beaucoup plus difficile d’obtenir la même quantité de tissu de la gencive humaine que de la peau et de la muqueuse buccale. La méthode d’explantation directe ne nécessitait que de petits morceaux de tissu gingival et cultivait un plus grand nombre de cellules par rapport à la méthode enzymatique18. Nous avons traité une petite quantité de tissu épithélial gingival en utilisant la nouvelle méthode et avons récolté une densité cellulaire très satisfaisante. Cela montre que la nouvelle méthode ne dépend pas de quantités relativement importantes de tissus à fournir initialement. Une limitation possible de la nouvelle méthode est qu’il pourrait apparaître une petite quantité (<5%) de contamination des fibroblastes lors de la culture initiale (passage 0), mais elle peut être facilement éliminée par un traitement à court terme de 0,05% de trypsine comme indiqué provisoirement9.
Dans cette étude, CK5, CK18 et Pan-CK (CK14, CK15, CK16 et CK19) étaient positifs(Figure 3A,C, D). Cela suggère que les cellules épithéliales gingivales isolées étaient capables de maintenir leur fonction de membrane basale, ce qui est cohérent avec les études d’Orazizadeh et al.30 et Kedjarune et al.6. CK5 et CK14 sont exprimés par des cellules indifférenciées localisées dans la couche épithéliale-basale. CK19 se trouve généralement dans l’épithélium simple et dans l’épithélium stratifié non kératinisé31. L’analyse d’immunofluorescence des cellules épithéliales gingivales (P3) obtenues à l’aide de la nouvelle méthode enzymatique a montré que les niveaux d’expression de ki67, p63 et p75NGFR étaient plus élevés que dans les cellules obtenues par la méthode de l’explantation directe(Figure 4). Ce résultat indique que la nouvelle méthode peut maintenir les propriétés des cellules souches des cellules épithéliales gingivales et favorise le potentiel de prolifération des cellules épithéliales gingivales. Notre étude précédente a révélé que le Y-27632 maintient le potentiel de cellules souches épidermiques de la peau après l’expansion8. Wang et al. ont découvert que Y-27632 facilite la prolifération, la migration et la pluripotence des cellules souches du ligament parodontal humain32.
En résumé, la nouvelle méthode enzymatique modifiée fournit une procédure simplifiée et efficace pour isoler et mettre en culture des cellules épithéliales primaires humaines à partir de tissu gingival adulte. Cette nouvelle méthode est plus facile, moins longue et améliore leurs propriétés des cellules souches, et présente donc des avantages évidents par rapport à la méthode d’explantation directe dans de nombreux paramètres. Cette méthode avancée est plus adaptée à la production d’un grand nombre de cellules épithéliales à fort potentiel à la fois pour les applications de laboratoire et cliniques.
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Disclosures
Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme clé de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2019ZD36) et le programme clé de recherche et développement de la province du Shandong (2019GSF108107) à X.W.; le programme clé de recherche et développement de la province du Shandong (2018GSF118240) à J.G.; Projet de développement des sciences et technologies médicales et de la santé de la province du Shandong (2018WS163) à Z.X., et projet de développement des sciences et technologies médicales et de la santé de la province du Shandong (2019WS045) à J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
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