Summary
Här presenterar vi en modifierad metod för isolering och kultur av mänskliga gingival epitelceller genom att lägga till Rock-hämmaren, Y-27632, till den traditionella metoden. Denna metod är enklare, mindre tidskrävande, förbättrar stamcellsegenskaper och producerar ett större antal epitelceller med hög potential både för laboratoriet och för kliniska tillämpningar.
Abstract
Gingivalvävnaden är den första strukturen som skyddar parodontala vävnader och spelar meningsfulla roller i många muntliga funktioner. Gingival epitel är en viktig struktur av gingival vävnad, särskilt i reparation och regenerering av parodontala vävnad. Att studera funktionerna hos gingival epitelceller har avgörande vetenskapligt värde, såsom att reparera orala defekter och upptäcka biomaterialens kompatibilitet. Eftersom mänskliga gingival epitelceller är mycket differentierade keratiniserade celler, deras livslängd är kort, och de är svåra att passera. Hittills finns det bara två sätt att isolera och odla gingival epitelceller, en direkt explant metod och en enzymatisk metod. Den tid som krävs för att erhålla epitelceller med direkt explant-metod är dock längre och cellöverlevnaden för den enzymatiska metoden är lägre. Kliniskt är förvärvet av gingival vävnad begränsat, så ett stabilt, effektivt och enkelt in vitro isolering och kultursystem behövs. Vi förbättrade den traditionella enzymatiska metoden genom att lägga till Y-27632, en Rho-associerad kinas (ROCK) hämmare, som selektivt kan främja tillväxten av epitelceller. Vår modifierade enzymatiska metod förenklar stegen i den traditionella enzymatiska metoden och ökar effektiviteten hos odling av epitelceller, vilket har betydande fördelar jämfört med den direkta explantmetoden och den enzymatiska metoden.
Introduction
Den mänskliga gingiva, den första linjens försvarsstruktur som skyddar parodontal vävnad, är inte bara en fysisk och kemiskbarriär 1, men utsöndrar också olika klasser av inflammatoriska medlare som deltar i immunsvar och utgör enimmunbarriär 2,3. Gingival epitel spelar en viktig roll i reparation och regenerering av parodontala vävnad. Därför är studier av försvaret och immuniteten hos gingival epitel av stor betydelse för att förstå förekomsten, diagnosen och behandlingen av parodonit. Isolering och kultur av gingival epitelceller från mänskliga gingival vävnad är det första steget krävs för att studera gingival epitel. Ett sådant förfarande kräver grundläggande åtgärder som att producera fröceller för vävnadsteknik, in vitro-modeller av parodontala associerade sjukdomar och material för reparation av parodontala defekter.
Primära gingival epitelceller kännetecknas av en låg uppdelningshastighet in vitro4, forskare har letat efter en optimal isolerings- och odlingsmetod i årtionden. Hittills används två olika tekniker, en direkt explantmetod och en enzymatisk metod, ofta i laboratorier för att erhålla primära gingival epitelceller in vitro4,5. Den direkta explantmetoden har fördelar som kravet på en lägre mängd vävnadsprover och enkelt isoleringsförfarande, men det har nackdelarna med längre odlingstid och mottaglighet för kontaminering5. Även om den enzymatiska metoden förkortar den kulturtid som krävs, är effektiviteten relativt låg och varierar beroende på de enzymer och medium som används. Kedjarune et al.6 visade att den direkta explantmetoden, som kräver mer tid före subkultur (2 veckor), verkade vara mer framgångsrik för odling av gingival epitelceller jämfört med enzymatisk metod. Men genom att jämföra dessa två metoder fann Klingbeil et al.7 att den enzymatiska metoden hade de bästa resultaten för primära kulturer av orala epitelceller, och det var möjligt att få optimal cellutbyte inom den kortaste tidsperioden (11, 9 dagar jämfört med 14, 2 dagar).
Därför var det viktigt att utveckla en bekvämare och effektivare metod för isolering och kultur av muntliga epitelceller4. Vi rapporterade tidigare att tillsats av Y-27632, en hämmare av Rho-associerade proteinkinaser (ROCK), förenklar isoleringsförfarandet för mänskliga primära epidermal celler och keratinocyter från vuxnahudvävnader 8,9,10. Vi utvecklade G-medium, ett nytt konditionerat inokuleringsmedium som spontant separerar epidermal från hudceller och stöder tillväxt och utbyte av primära epidermalaceller 8,9,10. I den aktuella studien utvecklade vi en ny serumfri isolerings- och odlingsteknik för gingival epitelceller genom att kombinera G-medium med Y-27632. I huvudsak bygger vår metod på en förenkling av den traditionella tvåstegs enzymatiska metoden, så vi jämförde vår nya metod med den direkta explantmetoden. Denna modifierade enzymatiska metod förkortar avsevärt den tid som krävs för att separera gingival epitelceller från gingival vävnad och ökar effektiviteten av odling gingival epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga vävnader som används i detta protokoll är färska vuxna gingival vävnader kasseras från extraktioner av påverkade tänder i Maxillofacial Kirurgi Institutionen enligt riktlinjerna från institutionens human forskning etikkommitté (protokoll nr. GR201711, Datum: 02-27-2017).
1. Förberedelser
- Samla färska vuxna gingival vävnader i 15 ml rör som innehåller 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 3% penicillin/streptomycin (P/S) och håll vävnaderna vid 4 °C.
OBS: Behandla vävnaderna enligt nedan inom 24 timmar efter excision.
2. Förbered reagenser och odlingsmedium
- Förbered tvättlösningen: 3% P/S. Blanda 50 ml PBS med 1,5 ml penicillin (100 U/ml) och 1,5 ml streptomycin (100 mg/L).
- Förbered 500 ml tillväxtfaktorinnehållande medium (kallas G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium som innehåller 1% P/S, 2% B27 tillägg, 20 ng/mL epidermal tillväxtfaktor (EGF), 40 ng/mL fibroblast tillväxtfaktor 2 (FGF2) och 40 μg/mL svampzon.
- Förbered enzymsmältningslösningar för den nya metoden: Lös upp 125 mg dispaspulver och 125 mg kollagenaspulver av typ I i 50 ml DMEM.
OBS: Filtrera alla enzymlösningar genom en 0,22 μm sil och förvara vid 4 °C. - Förbered 500 ml av mediet för att neutralisera den enzymatiska matsmältningen: 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% P/S i DMEM medium.
3. Direkt explantmetod
- Gingival vävnad förbehandling
- Tvätta gingivalvävnad med 5 ml 75% etanol i 30 s. Skölj sedan två gånger med 5 ml tvättlösning (steg 2.1) i 5 minuter.
OBS: Utför alla tvättar i cellkulturrätter med en diameter av 50 mm.
- Tvätta gingivalvävnad med 5 ml 75% etanol i 30 s. Skölj sedan två gånger med 5 ml tvättlösning (steg 2.1) i 5 minuter.
- Gingival epitel cell kultur
- Skär gingivalvävnaden i 1 mm3 bitar och sprid dem i en 100 mm cellkulturrätt. Använd finspetsiga tångar och oftalmisk sax för skäroperationerna.
- Tillsätt G-medium (steg 2.2) i kulturrätten. Inkubera sedan kulturrätten i en 5% CO2-inkubator vid 37 °C. Använd ett inverterat mikroskop (40x) för att undersöka vävnaderna var 24: e timme.
- Ta bort de gingivala vävnadsbitarna när epitelcellerna har förökat sig till en diameter på 2-5 mm runt vävnadsbitarna. Byt G-medium var 2-4: e dag.
4. Den nya modifierade enzymatiska metoden
- Gingival vävnad förbehandling
- Följ därför samma steg som beskrivs för direkt explant-metoden, steg 3.1.1.
- Matsmältning av gingival vävnad
- Skär gingivalvävnaden i små bitar, ungefär <1 mm i storlek, med två steriliserade blad. Upprepa strimlingsprocessen med två kirurgiska blad.
- Tillsätt 1 ml 2,5 mg/ml dispase + kollagenaslösning till ett 1,5 ml centrifugeringsrör som innehåller gingivalvävnadsbitarna och inkubera sedan röret i 15-20 minuter i en inkubator vid 37 °C.
- När vävnaden blir transparent och flocculent, tillsätt 1 ml av neutraliseringslösningen för att avsluta matsmältningen. Blanda lösningen noggrant genom att leda upp och ner 10-15 gånger. Skicka lösningen genom ett 100 μm nätfilter.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i botten i 10 ml tillväxtfaktorinnehållande medium (steg 2.2). Överför cellupphängningen till en 100 mm cellkulturrätt. Tillsätt 10 μM Y-27632 till cellkulturrätten.
- Odla cellerna vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator. Byt ut det gamla G-mediet mot det färska G-mediet varannan dag. Observera cellerna dag 1 och dag 3.
5. Cell passaging
- Ta ut skålen ur inkubatorn, ta bort det förbrukade mediet och tvätta två gånger med PBS. Tillsätt 2 ml 0,05% trypsin för varje 100 mm skål.
OBS: Skaka skålen för att se till att det finns tillräckligt med kontakt mellan Trypsin-lösningen och skålbotten. - Lämna skålen i en inkubator cirka 5 min vid 37 °C för matsmältningsprocessen.
- Använd ett mikroskop (40x) för att undersöka cellerna och se till att de flesta celler har separerat från botten av skålen.
- Tillsätt 2 ml av neutraliseringslösningen för att stoppa matsmältningen och överföra cellerna till ett 15 ml-rör. Pipett upp och ner 10-15 gånger. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min.
- Ta bort supernaten långsamt. Återanvänd cellerna med 10 ml G-medium och räkna antalet celler.
- Tillsätt ca 1 x 106 celler i 10 ml G-medium och 10 μM Y-27632 till varje 100 mm skål.
- Förnya G-medium och Y-27632 varannan dag. Visa cellerna dag 1 och dag 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett schematiskt diagram över den direkta explantmetoden och den modifierade enzymatiska metoden. Den direkta explantmetoden behöver inget matsmältningsenzym under hela processen. Däremot behöver den traditionella enzymatiska metoden vanligtvis två uppsättningar matsmältningsenzymer, dispase och kollagenas, för att separera epitelialbladet från det underliggande fibroblastskiktet och sedan trypsin för att frigöra epitelcellerna i suspension. Vår nya metod utelämnar separationssteget och är en förenklad enzymatisk metod. Dessutom främjar tillägg av Y-27632 till G-medium effektivt epitelcellstillväxt. Den direkta explantmetoden tar vanligtvis cirka 2 veckor för gingival epitelcellerna att växa tillräckligt för att passera och är lätt förorenade. Antalet gingival epitelceller som erhålls med den nya metoden är dock betydligt större än det som erhålls med den direkta explantmetoden och tar endast i genomsnitt 8 dagar att uppfylla kraven för passaging.
Figur 1: Jämförelse av den direkta explantmetoden och det nya systemet(A)som visar processen för den direkta explantmetoden. Gingival vävnad bitar placeras i en kulturrätt. Epitelcellerna odlas i G-medium och växer ut från vävnadsbitarna. Den direkta explantmetoden tar vanligtvis cirka 13 dagar för epitelcellerna att nå 80% sammanflöde. B)System som visar processen för den nya enzymatiska metoden. Gingival vävnad fragment smälts av dispase och collagenase I, varefter cellpellets odlas i G-medium med Y-27632. Den nya enzymatiska metoden tar vanligtvis cirka 6 dagar att nå 80% sammanflöde som är lämplig för passaging. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Vuxna gingival epitelceller som framställs med direkt explantmetod och med den nya metoden observerades i mikroskop den tredje och sjunde dagen (figur 2A). Det kan ses att den nya metoden avsevärt ökade produktionen av gingival epitelceller på tredje och sjunde dagarna. Tillväxtkurvorna för gingival epitelceller som erhållits med den nya metoden och med den direkta explantmetoden mättes med hjälp av ett cellräkningskit (CCK-8) vid olika tidpunkter (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d) (Figur 2B). Fördubblingstiden för celler som förbereddes med den nya metoden var ca 1-2 dagar, men fördubblingstiden för celler som förbereddes med den direkta explantmetoden var ca 5-6 dagar. Cellutbytena med de två metoderna beräknades den sjunde dagen (figur 2C) och visade att antalet celler som producerades med den nya metoden (9 x 106) var mer än tre gånger högre än antalet celler som producerades med den direkta explantmetoden (3 x 106). Figur 2D visar att det tog ungefär hälften av tiden för den nya metoden (6 dagar) att uppnå 80% sammanflöde jämfört med den direkta explantmetoden (13 dagar).
Figur 2: Den nya enzymatiska metoden ökar produktionen av primära gingival epitelceller. A)Bilder av gingival epitelceller som framställs med direkt explantmetod (nedre raden) och den nya enzymatiska metoden (översta raden) den tredje och sjunde dagen efter den första vaccinationen. Skala stänger = 200 μm. (B) Gingival epitelial celler odlas med den direkta metoden och den nya enzymatiska metoden samlades in på dagarna 1, 2, 3, 4, 5 och 6, och antalet gingival epitelial celler analyserades med hjälp av en CCK-8 kit. C)Efter 7 dagars kultur frigjorde gingival epitelceller av trypsin och samlades in. En cellräkningsplatta användes för att bestämma antalet gingival epitelceller som framställs separat med de två metoderna. Antalet celler beräknades från de två metoderna, som upprepades tre gånger separat, och resultaten uttrycks som det genomsnittliga antalet celler per 100 mm skål. D)Den genomsnittliga tiden för att nå 80 % sammanflöde av primära gingivalepitela celler (passage 0) som framställs med den nya enzymatiska metoden och med den direkta explantmetoden jämförs. B, C och D: Studentens t-testanvändes; Felstaplarna visar standardavvikelsen. n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 när den nya enzymatiska metoden jämförs med den direkta explantmetoden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Immunofluorescens analys av gingival epitelceller (vid passage 3) som erhållits med den nya metoden visade att uttrycket av CK5, CK18 och Pan-CK (CK14, CK15, CK16 och CK19) var positiva (Figur 3A,C,D)11,12,13,14,15, medan uttrycket CK10 och vimentin var lågt ( Figur3B,E)11,16. CK5 och Pan-CK (CK14, CK15, CK16 och CK19) var huvudsakligen lokaliserade i det basala skiktet av epitelceller, vilket är ett tecken på deras höga differentieringspotential11,14,15. CK10 är en markör för differentierat epitel11, och vimentin är en markör för gingival fibroblaster16. Keratin positiva frekvensen av gingival epitelceller isolerades av den nya metoden var högre, särskilt CK5, CK18 och Pan-CK (Figur 3A, C, D), som anges att isolerade gingival epitelceller kunde upprätthålla en bra källare membran funktion. Det låga uttrycket för differentieringsmarkören CK10 (Figur 3B) indikerade att de gingival epitelcellerna hade en hög differentieringspotential. In vitro kulturer visade att gingival epitelial celler isolerade av den nya metoden kunde odlas till den åttonde generationen, och det låga uttrycket av vimentin anges att gingival epitelial celler hade en hög renhet, att ingen gingival fibroblaster förorenade dem och att isolering effektiviteten var hög (Figur 3E).
Figur 3:Särskildamarkörer för gingival epitelceller (P3) som framställs med den nya enzymatiska metoden. (A-C) skalstänger = 100 μm; (D) och (E) skalstänger = 50 μm; experimentet upprepades fyra gånger självständigt. A, (C) och (D) visar det positiva uttrycket av CK5, CK18 och pan-ck (CK14, 15, 16 och 19) i gingival epitelceller, medan (B) och (E) visar det låga uttrycket av CK10 och vimentin i gingival epitelial celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Den nya metoden ökade uttrycket av ki67, p63 och p75NGFR (låg affinitet nerv tillväxtfaktor receptor p75) i primära gingival epitelceller. Passage 3 celler valdes för Immunofluorescence analys, som visade att det positiva uttrycket av ki67, p63 och p75NGFR var högre än för gingival epitelial celler erhålls genom direkt explant metod (Figur 4A, C, E). De positiva uttrycksfrekvenserna ki67, p63 och p75NGFR var 80%, 98% respektive 96% i den nya metoden, som var betydligt högre än ki67 (35%), p63 (40%), och p75NGFR (47%) som erhållits med den direkta metoden(figur 4B,D,F). Ki67, p63 och p75NGFR är markörer för orala epitelstamceller17. Dessa resultat anges att de primära gingival epitelial celler isolerade och odlas med hjälp av den nya metoden innehöll stamcell populationer, hade en hög spridning potential och bibehöll stamcellsegenskaperna hos gingival epitelceller.
Figur 4: Stamcellsegenskaper hos gingivalepitela celler (P3) som erhålls med den direkta explantmetoden och den nya enzymatiska metoden. A),(C) och (E) visar representativa immunofluorescensbilder av gingival epitelceller vid passage 3 (P3), respektive visar ki67 (röd), p63 (röd) och p75NGFR (röda) positiva celler som erhållits med den direkta explantmetoden respektive den nya enzymatiska metoden. DAPI (blå) användes för att färga atomkärnor. Skalstänger = 50 μm. (B), (D) och (F) visar kvantitativ analys av ki67-positiva celler, p63-positiva celler respektive p75NGFR-positiva celler i gingival epitelceller (P3) som erhålls med den direkta explantmetoden respektive med den nya enzymatiska metoden. Totalt räknades 400 celler för att kvantifiera varje grupp, och det genomsnittliga antalet ki67-, p63- och p75NGFR-positiva celler visas. B, D och F: Studentens t-testanvändes; Felstaplarna visar standardavvikelsen. försöket upprepades fyra gånger oberoende (n = 4); **p < 0,01, när man jämför den nya enzymatiska metoden med den direkta explantmetoden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gingivalvävnaden är en nyckelstruktur som upprätthåller parodontala integritet och hälsa. Gingival epitelceller har betydande roller i reparation och regenerering av parodontala vävnad och kan användas i vetenskaplig forskning och kliniska tillämpningar och relaterade områden, inklusive muntlig biologi, farmakologi, toxikologi och muntliga slemhinnorbrister 18. Därför är det nödvändigt att utveckla en stabil och effektiv metod för att skörda orala epitelceller19. Primära epitelceller är en slags helt differentierade celler med få passager och kort livslängd. Odling epitelceller har visat sig vara mer komplexa än odling av fibroblaster5.
För närvarande visar den publicerade litteraturen att olika protokoll finns för isolering och kultur av epitelceller. Två metoder, den direkta explantmetoden och den enzymatiska metoden, används dock oftast bland dessa protokoll. År 1910 beskrev Carrel och Burrows först en metod för att få gingival och buccal epitelceller som kallas den direkta explantmetoden20. Den direkta explantmetoden har fördelarna med lågviktskrav för vävnadsprover, mindre komplicerade procedurer, mindre variation och mindre engagemang i stegen, men den har nackdelarna med att kräva en lång odlingstid och är mycket mottaglig för förorening5. År 1975 rapporterade Rheinwald och Green först den enzymatiska metoden med bestrålade 3T3 musfibroblaster som ett matarlager för att odla orala epitelceller in vitro21. Även om den metoden avsevärt förbättrade utbytet av keratinocyter, hade det bestrålade musmatarcellskiktet potentiella biologiska risker22. Därefter utvecklades odlingssystem utan matare-celler22 och utan serum23,24 som visade att 3T3 celler inte var nödvändiga för epitelial cell kulturer. Även om den enzymatiska metoden kräver mindre odlingstid, är effektiviteten relativt låg och varierar beroende på enzymer och medium som används25. Flera laboratorier jämförde de två metoderna och Kedjarune et al.6 observerade den direkta explanttekniken för att vara mer framgångsrik än den enzymatiska metoden och fann en högre frekvens av cellproliferation. Shwetha et al.26 drog slutsatsen att den direkta explantmetoden verkar vara en enkel och framgångsrik teknik för isolering av orala slemhinnor keratinocyter. Klingbeil m.fl.7 drog dock slutsatsen precis tvärtom, dvs. den enzymatiska metoden visade de bästa resultaten på kortare tid med en bra livslängd. En undersökning utförd i Storbritannien av Daniels et al.19 granskade isolerings- och cellkulturmetoderna hos mänskliga keratinocyter och rapporterade att 21 av 34 laboratorier som svarade använde den enzymatiska metoden med vissa variationer. Även om den direkta explantmetoden kräver mindre vävnad och har färre hanteringssteg än den enzymatiska metoden, har det föreslagits att den enzymatiska metoden är snabbare och lättare att hantera6. Därför var det nödvändigt att utveckla en bekvämare och effektivare metod för isolering och kultur av muntliga epitelceller4. Vår nya metod, en förenklad enzymatisk metod som använder Y-27632 ökade produktionen av gingival epitelceller avsevärt och förkortade den tid som krävs för att separera gingival epitelceller från gingival vävnad.
Figur 2A visar att den nya metoden avsevärt ökade produktionen av gingival epitelceller på den tredje och sjunde dagen. Figur 2B visar att fördubblingstiden för celler som förberetts med den nya enzymatiska metoden var ca 1-2 dagar men att använda den direkta explantmetoden tog ca 5-6 dagar. Antalet celler som producerades med den nya enzymatiska metoden (9 x 106) var mer än tre gånger större än den direkta explantmetoden (3 x 106)den sjunde dagen (figur 2C). Celler som framställs med den nya enzymatiska metoden tog 13 dagar att bli 80% konfluenta, vilket överensstämmer med tidigare studier, medan den direkta explantmetoden tog ca 2 veckor6, 20,25 ± 1, 05 dagar18 och 14,2 ± 2,76 dagar7 för att cellerna skulle bli helt konfluenta före subkultur. Den nya enzymatiska metoden tog dock bara 6 dagar att bli 80% konfluent, vilket är mycket kortare än den direkta explantmetoden på 13 dagar i vårt laboratorium och Klingbeil et al.s7 enzymatiska metod på 11,9 ± 2,36 dagar. Vi fann också ett intressant fenomen, det vill säga epitelcellkolonierna växte i en flerskiktad struktur i den direkta explantmetoden, medan en enhetlig monolayerstruktur observerades med den nya enzymatiska metoden. Uppenbarligen förlänger tjockare flerskiktade kolonier den tid som krävs för att bli 80-100% konfluent. Anledningen till att den nya enzymatiska metoden främjar cellproliferation är tillsats av Y-27632, en hämmare av ROCK1 och ROCK2. Y-27632 rapporterades ursprungligen för dess positiva effekter på human epitelcellsproliferation och differentiering 200827. Chapman et al.28 rapporterade att behandling med Y-27632 kraftigt ökade keratinocyternas proliferativa kapacitet och resulterade i effektiv odödlighet utan påvisbar cellkris. I våra tidigare studier upptäckte vi att Y-27632 förenklar isoleringsproceduren för mänskliga primära epidermala celler och keratinocyter från vuxenhudvävnad 8,9,10. Strudwick et al.29 rapporterade att användningen av 10 μM Y-27632 tillsammans med lågt kalcium gjorde det möjligt att odla primära humana keratinocyter utan cellmatarskikt under längre tidsperioder samtidigt som förmågan att differentiera och bilda ett stratifierat epitel bibehålls. I denna studie ökade den nya enzymatiska metoden med Y-27632 kraftigt skörden av epitelceller genom att förlänga deras livslängd och främja deras proliferativa kapacitet.
Den traditionella enzymatiska metoden innehåller två matsmältningsoperationer. Den första matsmältningen är att separera epitelvävnad från bindväv med hjälp av dispas, som fungerar från den stromala sidan4,5. Den andra matsmältningen använder vanligtvis trypsin för att separera epitelceller från epitelvävnad4,5. På grund av förstörelsen av epitelceller genom trypsin påverkas effektiviteten hos den enzymatiska metoden4. Den nya enzymatiska metoden som beskrivs här är en förenklad metod som utelämnar ett matsmältningssteg. De största skillnaderna mellan de nya och traditionella enzymatiska metoderna avser protokollen för att separera epitelvävnad från bindväv5. Dessutom använder den nya metoden dispase och kollagenas istället för trypsin i matsmältningssteget, och därför är epitelcellernas integritet väl skyddad. Kliniskt är det mycket svårare att få samma mängd vävnad från mänsklig gingiva än från huden och buccal slemhinna. Den direkta explantmetoden krävde endast små bitar av gingivalvävnad och odlade ett större antal celler jämfört med den enzymatiska metoden18. Vi behandlade en liten mängd gingival epitelvävnad med den nya metoden och skördade en mycket tillfredsställande celltäthet. Detta visar att den nya metoden inte är beroende av relativt stora mängder vävnad som ursprungligen ska tillhandahållas. En möjlig begränsning av den nya metoden är att det kan förekomma en liten mängd (<5%) förorening av fibroblaster vid den ursprungliga kulturen (passage 0), men det kan enkelt avlägsnas genom en kortvarig behandling av 0,05% trypsin som rapporterats previsouly9.
I denna studie var CK5, CK18 och Pan-CK (CK14, CK15, CK16 och CK19) positiva (Figur 3A,C,D). Detta föreslog att de isolerade gingival epitelial cellerna kunde upprätthålla sin källare membran funktion, vilket är förenligt med studier av Orazizadeh et al.30 och Kedjarune et al.6. CK5 och CK14 uttrycks av odifferentierade celler lokaliserade i epitelial-basal skiktet. CK19 finns vanligtvis i enkelt epitel och i icke-keratiniserat stratifierat epitel31. Immunofluorescensanalys av gingival epitelceller (P3) som erhållits med den nya enzymatiska metoden visade att uttrycksnivåerna ki67, p63 och p75NGFR var högre än i celler som erhållits med hjälp av den direkta explantmetoden (figur 4). Detta resultat indikerar att den nya metoden kan upprätthålla stamcellsegenskaperna hos gingival epitelceller och främjar spridning potentialen av gingival epitelceller. Vår tidigare studie fann att Y-27632 upprätthåller huden epidermal stamcell potential efter expansion8. Wang et al. fann att Y-27632 underlättar spridning, migration och pluripotens av mänskliga parodontala ligament stamceller32.
Sammanfattningsvis ger den nya modifierade enzymatiska metoden ett förenklat och effektivt förfarande för att isolera och odla mänskliga primära epitelceller från vuxen gingivalvävnad. Denna nya metod är enklare, mindre tidskrävande och förbättrar deras stamcellsegenskaper och har därmed uppenbara fördelar jämfört med den direkta explantmetoden i många parametrar. Denna avancerade metod är mer lämplig för att producera ett stort antal högpotential epitelceller både för laboratorie- och för kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av nyckelprogrammet för Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) och nyckelprogrammet för forskning och utveckling i Shandongprovinsen (2019GSF108107) till X.W.; Det viktigaste forsknings- och utvecklingsprogrammet i provinsen Shandong (2018GSF118240) till J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2018WS163) till Z.X., och Medical and Health Science and Technology Development Project i Shandong Province (2019WS045) till J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
