Summary
여기서 우리는 전통적인 방법에 록 억제제 Y-27632를 추가하여 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 변형된 방법을 제시한다. 이 방법은 더 쉽고 시간이 많이 걸리며 줄기 세포 특성을 향상시키며 실험실과 임상 응용 분야에서 더 많은 수의 고잠재 상피 세포를 생성합니다.
Abstract
gingival 조직은 치주 조직을 보호하고 많은 구강 기능에 있는 의미 있는 역할을 하는 첫번째 구조물입니다. gingival 상피는 치지항 조직의 중요한 구조, 특히 치주 조직의 수리 및 재생에서. gingival 상피 세포의 기능을 연구하는 것은 구강 결함을 복구하고 생체 재료의 호환성을 검출하는 것과 같은 중요한 과학적 가치가 있습니다. 인간 gingival 상피 세포는 높게 분화된 각질 세포이기 때문에, 그들의 수명은 짧고, 통과하기 어렵습니다. 지금까지, 분리 및 배양 gingival 상피 세포, 직접 절제 방법 및 효소 방법이 있는 두 가지 방법이 있습니다. 그러나, 직접 적인 절제 방법을 사용하여 상피 세포를 얻는 데 필요한 시간은 더 길고, 효소 방법의 세포 생존율은 낮다. 임상적으로, gingival 조직의 취득이 제한되어 있으므로 안정적이고 효율적이며 간단한 체외 격리 및 배양 시스템이 필요합니다. 상피 세포의 성장을 선택적으로 촉진할 수 있는 Rho-관련 키나아제(ROCK) 억제제인 Y-27632를 첨가하여 전통적인 효소 방법을 개선했습니다. 당사의 변형된 효소 방법은 기존의 효소 방법의 단계를 단순화하고 직접 적인 절제 방법 및 효소 방법에 비해 상당한 이점을 갖는 상피 세포를 배양하는 효율성을 증가시킵니다.
Introduction
치주 조직을 보호하는 제1라인 방어 구조인 인간 칭기바는 물리적 및 화학적 장벽1일뿐만 아니라 면역 반응에 참여하고 면역 장벽2,3을구성하는 다양한 종류의 염증 중물질을 분비한다. gingival 상피는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을한다. 따라서, 칭기발 상피의 방어 및 면역을 공부하는 것은 치주염의 발생, 진단 및 처리를 이해하는 데 큰 의미가 있습니다. 인간 칭기질 조직에서 gingival 상피 세포의 격리 및 배양은 칭기발 상피를 연구하는 데 필요한 첫 번째 단계입니다. 이러한 절차는 조직 공학을 위한 종자 세포 생산, 치주 관련 질병의 체외 모델 및 치주 결함을 복구하기 위한 재료와 같은 기본적인 수술이 필요합니다.
1 차적인 gingival 상피 세포는 시험관 4에 있는낮은 분할 비율에 의해 특징지이며, 연구원은 수십 년 동안 최적 격리 및 재배 방법을 찾고 있습니다. 현재까지, 두 개의 상이한 기술, 직접 절제 방법 및 효소 방법, 일반적으로 시험관 4에서1차 칭기발 상피 세포를 얻기 위해 실험실에서 사용된다4,5. 직접 적인 절제 방법은 낮은 양의 조직 시편과 간단한 격리 절차의 요구 사항과 같은 장점을 가지고 있지만, 더 긴 배양 시간과 오염에 대한 감수성의 단점이5. 효소 방법은 필요한 배양 시간을 단축하지만, 효율은 상대적으로 낮으며 사용되는 효소 및 매체에 따라 다릅니다. Kedjarune외. 6 서브컬쳐 (2 주) 전에 더 많은 시간을 필요로 하는 직접 적인 절제 방법은 효소 방법에 비해 칭기발 상피 세포를 배양하는 데 더 성공한 것으로 나타났다. 그러나, 이들 두 가지 방법을 비교하면, 클링베일 외7은 효소 방법이 경구 상피 세포의 1차 배양에 가장 좋은 결과를 가져온 것으로 나타났으며, 최단 기간(11.9일 대 14.2일) 내에 최적의 세포 수율을 얻을 수 있었다.
따라서, 경구 상피 세포의 격리 및 배양에 대한 보다 편리하고 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요했다4. 우리는 이전에 Y-27632, Rho 관련 단백질 키나아제 (ROCK)의 억제제, 성인 피부 조직에서 인간 1 차형 표피 세포 및 각질 세포의 격리 절차를 단순화한다는 것을보고8,9,10. 우리는 G-배지를 개발, 자발적으로 진피 세포에서 표피를 분리하고 1 차성 표피 세포의 성장과 수율을 지원하는 새로운 조건부 접종 배지8,9,10. 본 연구에서는 G-배지와 Y-27632를 결합하여 gingival 상피 세포를 위한 새로운 혈청 없는 격리 및 배양 기술을 개발했습니다. 본질적으로, 우리의 방법은 기존의 2 단계 효소 방법의 단순화를 기반으로, 그래서 우리는 직접 절제 방법과 우리의 새로운 방법을 비교했다. 이 수정된 효소 방법은 칭기발 조직으로부터 칭기발 상피 세포를 분리하는 데 필요한 시간을 현저히 단축하고 칭기발 상피 세포를 배양하는 효율을 증가시킵니다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용되는 인간 조직은 기관의 인간 연구 윤리위원회의 지침에 따라 맥시안면 외과 부서에서 영향을 받은 치아의 추출에서 버려진 신선한 성인 gingival 조직입니다 (의정서 번호. GR201711, 날짜: 02-27-2017).
1. 준비
- 3% 페니실린/연쇄상구균(P/S)으로 보충된 10mL의 인산염 완충식식염(PBS)을 포함하는 15mL 튜브에서 신선한 성인 게이발 조직을 수집하고 조직을 4°C로 유지한다.
참고: 절제 후 24시간 이내에 조직에 대해 자세히 설명합니다.
2. 시약 및 문화 매체 준비
- 세탁 용액 준비: 페니실린 (100 U/mL) 및 1.5 mL의 페니실린 (100 U/mL)와 1.5 mL (100 mg/L)와 PBS의 3 % P / S. 믹스 50 mL.
- 성장인자 함유 배지(G-medium라고 함): DMEM/F12(3:1) 배지1% P/S, 2% B27 보충제, 표피 성장 인자(EGF) 20 ng/mL, 섬유아세포 성장인자 2(FGF2), 40 μg/mL의 40μg/mL을 준비한다.
- 새로운 방법에 대한 효소 소화 용액 준비: Dispase 분말 125 mg과 DMEM의 50 mL에 타입 I 콜라게나아제 분말 125 mg을 용해하십시오.
참고: 0.22 μm 여과기를 통해 모든 효소 솔루션을 필터링하고 4°C에 보관하십시오. - 효소 소화를 중화시키기 위해 배지 의 500mL를 준비하십시오: 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 DMEM 배지에서 1% P/S.
3. 직접 적인 절제 방법
- 깅지발 조직 전처리
- 30 s에 대 한 75% 에탄올의 5 mL로 gingival 티슈를 세척. 이어서, 5분 동안 세척용액(2.1단계)으로 2회 헹구세요.
참고: 직경 50mm의 세포 배양 접시에 모든 세초를 수행합니다.
- 30 s에 대 한 75% 에탄올의 5 mL로 gingival 티슈를 세척. 이어서, 5분 동안 세척용액(2.1단계)으로 2회 헹구세요.
- 깅지발 상피 세포 배양
- 깅지발 조직을 1mm3개로 자르고 100mm 세포 배양 접시에 뿌립니다. 절삭 작업에 미세 한 뾰족한 집게와 안과 가위를 사용합니다.
- G-배지(2.2단계)를 문화 요리에 넣습니다. 이어서, 문화 접시를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터로 배양한다. 반전된 현미경(40x)을 사용하여 24시간마다 조직을 검사합니다.
- 상피 세포가 조직 조각 주위직경 2-5 mm로 전파되었을 때 칭기발 조직 조각을 제거하십시오. 2-4일마다 G-배지를 변경합니다.
4. 새로운 수정 된 효소 방법
- 깅지발 조직 전처리
- 이를 위해, 직접 절제 방법, 단계 3.1.1에 대해 설명된 것과 동일한 단계를 따릅니다.
- 칭기발 조직의 소화
- 치지발 조직을 약 <1mm 크기의 작은 조각으로 자르고 두 개의 살균 된 블레이드를 넣습니다. 두 개의 수술 용 블레이드로 파쇄하는 과정을 반복하십시오.
- 2.5 mg/mL 디스파스 + 콜라게나아제 용액 1mL을 깅지발 조직 조각을 포함하는 1.5 mL 원심분리기 튜브에 추가한 다음 37°C의 인큐베이터에서 15-20분 동안 튜브를 배양합니다.
- 조직이 투명하고 flocculent가되면, 소화를 종료하는 중화 용액의 1 mL을 추가합니다. 10-15회 위아래로 피펫팅하여 용액을 철저히 혼합합니다. 100 μm 메쉬 필터를 통해 솔루션을 전달합니다.
- 원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.
- 상체를 제거하고 성장 인자 함유 배지의 10mL에서 하단의 세포 펠릿을 재중단한다(단계 2.2). 셀 현탁액을 100mm 세포 배양 접시로 옮기. 세포 배양 접시에 Y-27632의 10 μM을 추가합니다.
- 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다. 오래된 G-배지를 2일마다 신선한 G-매체로 교체하십시오. 1일과 3일에 세포를 관찰하십시오.
5. 세포 패시징
- 인큐베이터에서 접시를 꺼내 소비 한 매체를 제거하고 PBS로 두 번 씻으십시오. 각 100mm 접시에 0.05% 트립신 2mL를 추가합니다.
참고: 접시를 흔들어 트립신 솔루션과 접시 바닥 사이에 충분한 접촉이 있는지 확인합니다. - 소화 과정을 위해 37°C에서 약 5분 동안 인큐베이터에 접시를 둡니다.
- 현미경 (40x)을 사용하여 세포를 검사하고 대부분의 세포가 접시의 바닥에서 분리되었는지 확인하십시오.
- 중화 용액의 2mL를 추가하여 소화를 멈추고 세포를 15mL 튜브로 옮춥니까. 파이펫 을 위아래로 10-15 번. 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
- 상체를 천천히 제거합니다. G-배지의 10mL로 세포를 다시 중단하고 세포의 수를 계산합니다.
- G-배지 10mL에 약 1 x 106 셀을 추가하고 각 100mm 접시에 10 μM Y-27632를 추가합니다.
- 2일마다 G-배지 및 Y-27632를 갱신합니다. 1일과 5일에 셀을 봅니다.
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Representative Results
도 1은 직접 절제 방법 및 수정된 효소 방법의 회로도도를 나타낸다. 직접 적인 절제 방법은 전체 과정에서 소화 효소가 필요하지 않습니다. 대조적으로, 전통적인 효소 방법은 일반적으로 기형 섬유아세포 층에서 상피 시트를 분리하기 위해 소화 효소, 디스파제 및 콜라게나아제 의 두 세트를 필요로하고, 다음 트립신은 현탁액으로 상피 세포를 방출합니다. 우리의 새로운 방법은 분리 단계를 생략하고 단순화 된 효소 방법입니다. 더욱이, G-배지에 Y-27632를 첨가하면 상피 세포 성장을 효과적으로 촉진한다. 직접 적인 박리 방법은 일반적으로 통과하기에 충분히 성장하는 gingival 상피 세포에 대한 약 2 주가 걸리고 쉽게 오염된다. 그러나, 새로운 방법에 의해 얻어진 진피세포의 수는 직접 적인 절제 방법에 의해 얻어진 것보다 훨씬 크며, 패혈증요건을 충족시키기 위해 평균 8일만 소요된다.
도 1: 직접 식각 방법 및 새로운 방법의 비교. (A)직접 적인 절제 방법의 과정을 보여주는 방식. 깅지발 티슈 조각은 문화 접시에 배치됩니다. 상피 세포는 G-배지에서 배양되고 조직 조각에서 자랍니다. 직접 적인 박사 방법은 일반적으로 80% 합류에 도달하는 상피 세포에 대 한 약 13 일 걸립니다. (B)새로운 효소 방법의 과정을 보여주는 방식. gingival 조직 단편은 디스파제 와 콜라게나아제 I에 의해 소화되고, 그 후 세포 펠릿은 Y-27632와 G 배지에서 배양된다. 새로운 효소 방법은 일반적으로 통과에 적합한 80 %의 합류에 도달하는 데 약 6 일이 걸립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
직접 식소 방법에 의해 제조된 성체 진피 세포와 새로운 방법에 의해 3일과 7일에 현미경으로 관찰하였다(도2A). 새로운 방법이 3일과 7일에 치지발 상피 세포의 생산을 현저히 증가시켰다는 것을 알 수 있다. 새로운 방법에 의해 얻어진 진지성 상피 세포의 성장 곡선은 서로 다른 시간 지점에서 세포 계수 키트(CCK-8)를 사용하여 측정하였다(1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d)(도 2B). 새로운 방법을 사용하여 준비된 세포의 두 배 시간은 약 1-2일였지만, 직접 적인 절제 방법을 사용하여 제조된 세포의 두 배 시간은 약 5-6일이었다. 두 가지 방법에 의한 세포 수율은7일째(도 2C)에계산되었으며, 새로운 방법(9 x 10 6)에 의해 생성된 세포의 수가 직접 절제 방법(3 x 106)에의해 생성된 세포 수보다 3배 이상 높은 것으로 나타났다. 도 2D는 직접 적인 병자 방법(13일)에 비해 80%의 합류를 달성하기 위해 새로운 방법(6일)에 대한 시간의 약 절반을 걸렸다는 것을 보여준다.
그림 2: 새로운 효소 방법은 1 차칭 상피 세포의 생산을 증가시킵니다. (A)직접 절제 방법(아래 줄)에 의해 제조된 칭기발 상피 세포의 이미지와 초기 접종 후 3일과 7일에 새로운 효소 방법(위쪽 행)이 제조된다. 스케일 바 = 200 μm.(B)칭지발 상피 세포는 직접 적인 방법에 의해 배양되고 새로운 효소 방법은 일 1, 2, 3, 4, 5 및 6일에 수집되었으며, gingival 상피 세포의 수는 CCK-8 키트를 사용하여 분석되었다. (C)7일간의 배양 후, 깅지발 상피 세포는 트립신에 의해 분리되어 수집되었다. 세포 계수 플레이트는 두 가지 방법에 의해 별도로 제조된 칭지성 상피 세포의 수를 결정하는 데 사용되었다. 세포의 수는 세 번 별도로 반복된 두 가지 방법으로부터 계산되었으며, 결과는 100mm 당 평균 세포 수로 표현되었다. (D)새로운 효소 방법에 의해 제조된 1차 치지발 상피세포(passage 0)의 80%에 도달하는 평균 시간은 직접 적인 절제 방법에 의해 비교된다. B, C 및 D: 학생의 t-시험이 사용되었습니다. 오류 막대에는 표준 편차가 표시됩니다. n = 4; **p < 0.01, *p < 0.05 는 새로운 효소 방법을 직접 절제 방법과 비교할 때 0.05를 <. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
새로운 방법에 의해 얻어진 칭지발 상피 세포의 면역형광 분석(passage 3)은 CK5의 발현이 있음을 보여주었으며, CK18, 및 팬CK(CK14, CK15, CK16 및 CK19)는양성(그림 3A,C, D)11,12,13,14,15,CK10 및 비멘틴의 발현이 낮았을 때(그림3B,E)11, 16. CK5 및 범CK(CK14, CK15, CK16 및 CK19)는 주로 상피 세포의 기저층에서 국한되었으며, 이는 높은 분화 전위11,14,15의표시이다. CK10은 분화된상피(11)의마커이며, 비멘틴은 칭기발섬유아세포(16)의마커이다. 새로운 방법에 의해 분리된 칭지발 상피 세포의 케라틴 양성율은 특히 CK5, CK18 및 Pan-CK(도3A,C,D)가높았으며, 이는 고립된 칭기발 상피 세포가 양호한 지하 막 기능을 유지할 수 있음을 나타냈다. 분화 마커 CK10(도3B)의낮은 발현은 칭기발 상피 세포가 높은 분화 전위를 가졌다는 것을 나타냈다. 시험관 내 배양은 새로운 방법에 의해 분리된 진피세포가 8세대로 배양될 수 있음을 보여주었으며, 비멘틴의 낮은 발현은 칭기발 상피 세포가 높은 순도를 가지는 것으로 나타났으며, gingival fibroblasts가 오염되지 않았으며 절연 효율이 높았다(도3E).
도 3: 새로운 효소 방법에 의해 제조된 진지성 상피 세포(P3)의 특이적 마커. (A-E)CK5(빨강), CK10(빨간색), CK18(빨간색), 범CK(red), 및 비멘틴(red) 양성 세포, DAPI(블루)가 핵을 얼룩지게 하는 데 사용되었다. (A-C)스케일 바 = 100 μm; (D)및(E)스케일 바 = 50 μm; 실험은 독립적으로 4회 반복되었다. (A),(C),및(D)는칭지발 상피 세포에서 CK5, CK18 및 범크(CK14, 15, 16 및 19)의 양성 현현을 나타내고,반면(B)및(E)칭기발 상피 세포에서 CK10 및 비멘틴의 낮은 발현을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
새로운 방법은 1차 치경상피세포에서 키67, p63 및 p75NGFR(저친화신경성장인자 수용체 p75)의 발현을 증가시켰다. 통과 3 세포는 면역형질 분석을 위해 선택되었으며, 이는 ki67, p63 및 p75NGFR의 양성 발현이 직접 절제방법(도 4A,C,E)에의해 얻어진 칭지성 상피 세포의 양화발보다 높았다는 것을 밝혔다. 키67, p63, p75NGFR의 양성발률은 각각 80%, 98%, 96%로, 직접적인방법(그림 4B,D,F)에의해 얻어진 키67(35%), p63(40%), p75NGFR(47%)보다 현저히 높았다. Ki67, p63 및 p75NGFR은 경구 상피 줄기세포(17)의마커이다. 이러한 결과는 새로운 방법을 사용하여 분리되고 배양된 1차 식형 세포가 줄기 세포 집단을 포함하고, 높은 증식 잠재력을 가지고 있으며, 칭기발 상피 세포의 줄기 세포 특성을 유지하였다는 것을 나타냈다.
도 4: 직접 식극 방법 및 새로운 효소 방법에 의해 얻어진 칭기발 상피 세포(P3)의 줄기 세포 특성. (A),(C)및(E)3(P3)에서 치지발 상피 세포의 대표적인 면역형광 이미지를 각각 나타내고, ki67(빨강), p63(빨간색), 및 p75NGFR(red) 양성 세포를 직접 절제 방법 및 새로운 효소 방법에 의해 수득하였다. DAPI(파란색)는 핵을 염색하는 데 사용되었다. 스케일 바 = 50 μm.(B),(D)및(F)는키67 양성 세포, p63 양성 세포 및 p75NGFR 양성 세포의 정량적 분석을 각각, 칭지발 상피 세포(P3)에서 직접 절제 방법 및 새로운 효소 방법에 의해 수득된다. 총 400개의 세포가 각 군을 정량화하기 위해 계산되었고, 평균 수의 ki67, p63 및 p75NGFR 양성 세포가 나타났다. B, D 및 F: 학생의 t-시험이 사용되었습니다. 오류 막대에는 표준 편차가 표시됩니다. 실험은 독립적으로 4회 반복하였다(n = 4); **p < 0.01, 직접 절제 방법과 새로운 효소 방법을 비교할 때. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
gingival 조직은 치주 무결성 및 건강을 유지하는 중요한 구조입니다. Gingival 상피 세포는 치주 조직의 수리 및 재생에 중요한 역할을 하며 경구 생물학, 약리학, 독성학 및 구강 점막 결핍을 포함한 과학 연구 및 임상 응용 프로그램 및 관련 분야에서 사용될 수 있다18. 따라서 경구상피세포(19)를수확하는 안정적이고 효율적인 방법을 개발할 필요가 있다. 1 차상 세포는 몇몇 통로 및 짧은 수명을 가진 완전히 분화한 세포의 종류입니다. 상피 세포를 배양하는 것은 섬유아세포5를배양하는 것보다 더 복잡한 것으로 입증되었습니다.
현재, 출판 된 문헌은 상피 세포의 격리 및 문화에 대한 다양한 프로토콜이 존재한다는 것을 보여줍니다. 그러나, 두 가지 방법, 직접 절제 방법 및 효소 방법은 이러한 프로토콜 중 가장 자주 사용 됩니다. 1910년, Carrel 및 Burrows는 먼저 직접식소법(20)이라고불리는 칭기발 및 부칼 상피 세포를 얻는 방법을 설명했다. 직접 적인 절제 방법은 조직 표본에 대한 저체중 요구 사항의 장점을 가지며, 덜 복잡한 절차, 적은 변이, 단계에 덜 개입하지만, 긴 배양 시간을 필요로 하는 단점이 있으며 오염에 매우 취약하다5. 1975년, Rheinwald와 Green은 먼저 시험관 외21에서경구 상피 세포를 배양하기 위해 피더 층으로 조사된 3T3 마우스 섬유아세포를 사용하여 효소 방법을 보고했다. 그 방법은 각질 세포의 수율을 크게 향상시켰지만, 조사된 마우스 피더 세포 층은 잠재적인 생물학적 위험이있었다(22). 그 후, 피더 세포가 없는 배양시스템(22)과 혈청(23)이없는,24는 상피 세포 배양에 3T3 세포가 필요하지 않다는 것을 입증하였다. 효소 방법은 배양 시간이 적지만, 효율은 상대적으로 낮으며 사용되는 효소 및배지(25)에따라 다릅니다. 몇몇 실험실은 두 가지 방법과 Kedjarune 외.6 효소 방법 보다 더 성공 하는 직접 해병 기술을 관찰 하 고 세포 증식의 높은 비율을 발견. Shwetha외. 26 직접 축출 방법은 경구 점막 각질 각질 세포의 분리를 위한 간단하고 성공적인 기술인 것으로 보인다는 결론을 내렸습니다. 그러나, 클링베일 외7은 정반대, 즉 효소 적 방법이 양호한 수명을 가진 적은 시간에 최상의 결과를 보였다는 결론을 내렸다. 다니엘스 외19에 의해 영국에서 실시한 설문 조사는 인간 각질 세포의 격리 및 세포 배양 방법을 검토하고 반응한 34개 실험실 중 21개가 일부 변형으로 효소 방법을 사용했다고 보고했습니다. 직접 적인 절제 방법은 적은 조직을 필요로하고 효소 방법보다 적은 처리 단계를 가지고 있지만, 효소 방법은 빠르고 관리하기 쉬운 것으로 제안되고있다6. 따라서, 경구 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 보다 편리하고 효과적인 방법을 개발할 필요가 있었다4. 우리의 새로운 방법, Y-27632를 사용하는 단순화 된 효소 방법은 칭기발 상피 세포의 생산을 크게 증가시키고 칭기발 조직으로부터 칭지발 상피 세포를 분리하는 데 필요한 시간을 단축시켰다.
도 2A는 새로운 방법이 3일과 7일에 치지발 상피 세포의 생산을 현저히 증가시켰다는 것을 보여준다. 도 2B는 새로운 효소 방법을 사용하여 제조된 세포의 두 배가 시간이 약 1-2일였지만 직접 적인 절제 방법을 사용하는 데 약 5-6일이 걸렸다는 것을 보여준다. 새로운 효소 방법(9 x 106)을사용하여 생성된 세포의 수는 7일째(도2C)에직접 절제 방법(3 x 106)보다3배 이상 컸다. 새로운 효소 방법을 사용하여 준비된 세포는 이전 연구와 일치하는 80%의 컨서우물이 되는 데 13일이 걸렸으며, 직접 적인 절제 방법은 18일과 14.2일 ± 약 2주6,20.25± 1.05일18일과 14.2일 ± 2.76일 동안 세포가 서브컬쳐 전에 완전히 수렴되기까지 7일 하였다. 그러나, 새로운 효소 방법은 80%의 컨캔티가 되는 데 6일밖에 걸리지 않았으며, 이는 우리 실험실에서 13일간의 직접 적인 절제 방법보다 훨씬 짧으며 클링베일(Klingbeil et al.)의7가지 효소 방법은 11.9 ± 2.36일 ±. 또한, 상피 세포 식민지가 직접 식소 법에서 다층 구조로 성장한 반면, 새로운 효소 방법을 사용하여 균일한 단층 구조가 관찰되는 흥미로운 현상을 발견했다. 분명히, 두꺼운 다층 식민지는 80%-100% 컨서업되기 위하여 필요한 시간을 연장합니다. 새로운 효소 방법이 세포 증식을 촉진하는 이유는 ROCK1 및 ROCK2의 억제제인 Y-27632를 첨가하기 때문입니다. Y-27632는 2008년27년인간 상피 세포 증식 및 분화에 긍정적인 영향을 먼저 보고되었다. 채프먼 외28은 Y-27632로 치료하는 것이 각질 세포의 증식 능력을 크게 증가시키고 검출 가능한 세포 위기 없이 효율적인 불멸의 결과를 낳았다고 보고했다. 이전 연구에서Y-27632가 성인 피부 조직8,9,10에서인간 1차 표피 세포 및 각질 세포의 격리 절차를 단순화한다는 것을 발견했습니다. Strudwick 외29는 낮은 칼슘과 함께 10 μM Y-27632를 사용하면 1차 인간 각질 세포를 장기간 세포 피더 층 없이 배양할 수 있도록 허용하면서 계층화된 상피형을 분화하고 형성하는 능력을 유지한다고 보고했습니다. 이 연구에서, Y-27632를 사용하는 새로운 효소 방법은 수명을 연장하고 증식 능력을 촉진함으로써 상피 세포의 수확을 크게 증가시켰습니다.
전통적인 효소 방법에는 두 가지 소화 작업이 포함되어 있습니다. 첫 번째 소화는 기질 측4,5에서작동하는 디스파제를 사용하여 상피 조직을 결합 조직으로부터 분리하는 것입니다. 두 번째 소화는 일반적으로 상피 조직4,5에서상피 세포를 분리하기 위해 트립신을 사용합니다. 트립신에 의한 상피 세포의 파괴로 인해 효소 방법의 효율이4에영향을 받습니다. 여기에 설명된 새로운 효소 방법은 하나의 소화 단계를 생략하는 단순화된 방법입니다. 새로운 효소 방법 사이의 주요 차이점은 결합 조직 5에서 상피 조직을 분리하는 프로토콜을참조한다. 또한, 새로운 방법은 소화 단계에서 트립신 대신 디스파제와 콜라게나아제를 사용하므로 상피 세포의 무결성이 잘 보호됩니다. 임상적으로, 피부와 부칼 점막에서 보다 인간 치지바에서 조직의 동일한 금액을 얻는 것이 훨씬 더 어렵다. 직접 적인 절제 방법은 gingival 조직의 작은 조각만 필요하고 효소 방법(18)과비교할 때 더 많은 수의 세포를 경작하였다. 우리는 새로운 방법을 사용하여 소량의 칭기발 상피 조직을 처리하고 매우 만족스러운 세포 밀도를 수확했습니다. 이것은 새로운 방법이 처음에 제공될 조직의 상대적으로 다량에 의존하지 않는다는 것을 보여줍니다. 새로운 방법의 한 가지 가능한 한계는 초기 배양(통로 0)에서 섬유아세포의 소량(<5%) 오염이 나타날 수 있지만, 보고된 previsouly9로0.05%의 트립신의 단기 치료에 의해 쉽게 제거될 수 있다는 것이다.
본 연구에서CK5, CK18 및 팬CK(CK14, CK15, CK16 및 CK19)는양성(그림 3A,C, D)이었다. 이것은 고립 된 진지성 상피 세포가 Orazizadeh외. 30 및 Kedjarune 외. 6의 연구와 일치하는 그들의 지하 막 기능을 유지할 수 있었다는 것을건의했습니다. CK5 및 CK14는 상피 기저층에서 국소화되지 않은 세포에 의해 발현된다. CK19는 전형적으로 단순 상피및 비각질화된 계층화상층부(31)에서발견된다. 새로운 효소 방법을 사용하여 얻어진 칭지발 상피 세포(P3)의 면역형 분석결과 키67, p63 및 p75NGFR의 발현 수준이 직접 절제 방법을 사용하여 수득된 세포보다 높았다는 것을보여주었다(도 4). 이러한 결과는 새로운 방법이 칭기발 상피 세포의 줄기 세포 특성을 유지할 수 있음을 나타내며 칭기발 상피 세포의 증식 잠재력을 촉진한다. 우리의 이전 연구는 Y-27632 확장 후 피부 표피 줄기 세포 잠재력을 유지 발견8. 왕 등Y-27632는 인간 치주 인대 줄기 세포(32)의증식, 이동 및 흉부를 용이하게한다는 것을 발견했다.
요약하자면, 새로운 변형된 효소 방법은 성인 기지발 조직에서 인간 1차 상피 세포를 분리하고 배양하는 단순화되고 효과적인 절차를 제공한다. 이 새로운 방법은 더 쉽고 시간이 많이 소요되며 줄기 세포 특성을 향상시켜 많은 매개 변수에서 직접 절제 방법에 비해 명백한 장점이 있습니다. 이 고급 방법은 실험실 및 임상 응용 모두에 대 한 높은 잠재적인 상피 세포의 큰 숫자를 생산에 더 적합.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 산동성 자연과학재단(ZR2019ZD36)과 산동성 의 주요 연구 개발 프로그램(2019GSF108107)에서 X.W.에 의해 지원되었습니다. 산동성 주요 연구 개발 프로그램 (2018GSF118240)에서 J.G.에; 산동성 의료보건과학기술개발사업(2018WS163)과 산동성 의료보건과학기술개발사업(2019WS045)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
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