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Bioengineering

Y-27632 का उपयोग करके प्राथमिक मानव गिंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62978

Summary

यहां हम पारंपरिक विधि में रॉक अवरोधक वाई-27632 जोड़कर मानव ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक संशोधित विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि आसान है, कम समय लेने वाली, स्टेम सेल गुणों को बढ़ाती है, और प्रयोगशाला और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों के लिए उच्च क्षमता वाले एपिथेलियल कोशिकाओं की बड़ी संख्या पैदा करती है।

Abstract

ग्इंगिवल ऊतक पहली संरचना है जो पीरियोडोन्टल ऊतकों की रक्षा करती है और कई मौखिक कार्यों में सार्थक भूमिका निभाती है। ग्इंगिवल एपिथेलियम विशेष रूप से पीरियोडोन्टल ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन में, ग्इंगिवल ऊतक की एक महत्वपूर्ण संरचना है। gingival epithelial कोशिकाओं के कार्यों का अध्ययन महत्वपूर्ण वैज्ञानिक मूल्य है, जैसे मौखिक दोषों की मरंमत और जैव सामग्री की अनुकूलता का पता लगाने के रूप में । चूंकि मानव गिंगिवल एपिथेलियल कोशिकाएं अत्यधिक विभेदित केराटिनाइज्ड कोशिकाएं हैं, इसलिए उनकी उम्र कम है, और उन्हें पारित करना मुश्किल है। अब तक, अलग-थलग करने और संस्कृति के केवल दो तरीके हैं, एक प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और एक एंजाइमेटिक विधि। हालांकि, प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि का उपयोग करके एपिथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय लंबा है, और एंजाइमेटिक विधि की सेल जीवित रहने की दर कम है। चिकित्सकीय रूप से, जिजिवल ऊतक का अधिग्रहण सीमित है, इसलिए एक स्थिर, कुशल और सरल इन विट्रो अलगाव और संस्कृति प्रणाली की आवश्यकता है। हमने वाई-27632, एक Rho-संबद्ध किनेज़ (रॉक) अवरोधक जोड़कर पारंपरिक एंजाइमेटिक विधि में सुधार किया, जो चुनिंदा रूप से एपिथेलियल कोशिकाओं के विकास को बढ़ावा दे सकता है। हमारी संशोधित एंजाइमेटिक विधि पारंपरिक एंजाइमेटिक विधि के चरणों को सरल बनाती है और एपिथेलियल कोशिकाओं को बनाने की दक्षता को बढ़ाती है, जिसके प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और एंजाइमेटिक विधि पर महत्वपूर्ण लाभ होते हैं।

Introduction

मानव gingiva, पहली पंक्ति रक्षा संरचना है कि पीरियोडोन्टल ऊतक की रक्षा करता है, न केवल एक भौतिक और रासायनिक बाधा1है, लेकिन यह भी भड़काऊ मध्यस्थों के विभिन्न वर्गों का रहस्य है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में भाग लेने और एक प्रतिरक्षा बाधा2,3 कागठन। जिंगल एपिथेलियम पीरियोडोन्टल ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसलिए, पीरियोडोन्टाइटिस की घटना, निदान और उपचार को समझने के लिए ग्इंगिवल एपिथेलियम की रक्षा और प्रतिरक्षा का अध्ययन करना बहुत महत्वपूर्ण है। मानव ग्इंगिवल ऊतक से ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति ग्इंगिवल एपिथेलियम का अध्ययन करने के लिए आवश्यक पहला कदम है। इस तरह की प्रक्रिया के लिए बुनियादी संचालन की आवश्यकता होती है जैसे ऊतक इंजीनियरिंग के लिए बीज कोशिकाओं का उत्पादन, पीरियोडोन्टल संबंधित रोगों के इन विट्रो मॉडल, और पीरियोडोन्टल दोषों की मरम्मत के लिए सामग्री।

प्राथमिक gingival epithelial कोशिकाओं को विट्रो4में कम विभाजन दर की विशेषता है, शोधकर्ता दशकों से एक इष्टतम अलगाव और खेती विधि की तलाश कर रहे हैं। आज तक, दो अलग-अलग तकनीकें, एक प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और एक एंजाइमेटिक विधि, आमतौर पर प्रयोगशालाओं में विट्रो4, 5में प्राथमिक gingival epithelium कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयोग कियाजाताहै। प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि में कम मात्रा में ऊतक नमूनों और सरल अलगाव प्रक्रिया की आवश्यकता जैसे फायदे हैं, लेकिन इसमें लंबे समय तक संस्कृति समय और संदूषण के लिए संवेदनशीलता के नुकसान हैं5। हालांकि एंजाइमीय विधि संस्कृति के समय की आवश्यकता को छोटा करती है, दक्षता अपेक्षाकृत कम होती है और एंजाइमों और उपयोग किए जाने वाले माध्यम के आधार पर भिन्न होती है। केजरून एट अल6 ने दिखाया कि प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि, जिसके लिए उपसंस्कृति (2 सप्ताह) से पहले अधिक समय की आवश्यकता होती है, एंजाइमेटिक विधि की तुलना में gingival एपिथेलियल कोशिकाओं को बनाने के लिए अधिक सफल दिखाई दिया। हालांकि, इन दो तरीकों की तुलना करते हुए, क्लिंगबेल एट अल7 ने पाया कि एंजाइमेटिक विधि में मौखिक एपिथेलियल कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों के लिए सबसे अच्छा परिणाम था, और सबसे कम समय अवधि (11.9 दिन बनाम 14.2 दिन) के भीतर इष्टतम कोशिका उपज प्राप्त करना संभव था।

इसलिए, मौखिक एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक अधिक सुविधाजनक और प्रभावी विधि विकसित करना महत्वपूर्ण था4. हमने पहले बताया कि वाई-27632 को जोड़ना, जो कि रो-संबद्ध प्रोटीन किनेज (रॉक) का अवरोधकहै, वयस्क त्वचा ऊतकों8,9,10से मानव प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं और केराटिनोसाइट्स की अलगाव प्रक्रिया को सरल बनाता है। हमने जी-माध्यम विकसित किया, एक नया वातानुकूलित टीका माध्यम जो अनायास एपिडर्मल को डर्मल कोशिकाओं से अलग करता है और प्राथमिकएपिडर्मल कोशिकाओं8,9,10के विकास और उपज का समर्थन करता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने वाई-27632 के साथ जी-माध्यम को मिलाकर gingival एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए एक नई सीरम मुक्त अलगाव और संस्कृति तकनीक विकसित की। संक्षेप में, हमारी विधि पारंपरिक दो-चरण एंजाइमेटिक विधि के सरलीकरण पर आधारित है, इसलिए हमने अपनी नई विधि की तुलना प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि से की है। यह संशोधित एंजाइमेटिक विधि gingival ऊतक से gingival epithelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक समय को काफी छोटा करती है और gingival एपिथेलियल कोशिकाओं को बनाने की दक्षता को बढ़ाती है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए जाने वाले मानव ऊतक संस्थान की मानव अनुसंधान आचार समिति (प्रोटोकॉल संख्या) के दिशा-निर्देशों के अनुसार मैक्सिलोफेशियल सर्जरी विभाग में प्रभावित दांतों के अर्क से फेंके गए ताजा वयस्क gingival ऊतक हैं । GR201711, दिनांक: 02-27-2017) ।

1. तैयारी

  1. 3% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) के साथ पूरक फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल युक्त 15 एमएल ट्यूबों में ताजा वयस्क gingival ऊतकों को इकट्ठा करें और ऊतकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
    नोट: उत्तेजना के बाद 24 घंटे के भीतर नीचे विस्तृत रूप में ऊतकों का इलाज करें।

2. रिएजेंट्स और कल्चर मीडियम तैयार करें

  1. वाशिंग सॉल्यूशन तैयार करें: 3% पी/एस मिक्स ५० एमएल पीबीएस के १.५ एमएल पेनिसिलिन (१०० यू/एमएल) और 1.5 एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०० मिलीग्राम/एल) के साथ ।
  2. विकास-कारक युक्त माध्यम (जिसे जी-माध्यम कहा जाता है) का 500 मिलियन का उत्पादन तैयार करें: डीएमईएम/एफ12 (3:1) माध्यम जिसमें 1% पी/एस, 2% B27 पूरक, 20 एनजी/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 40 एनजी/एमएनएल का फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (एफजीएफ2) और 40 μμ/mL कवकजोन।
  3. नई विधि के लिए एंजाइम पाचन समाधान तैयार करें: डीएमईएम के 50 एमएल में 125 मिलीग्राम डिस्पास पाउडर और 125 मिलीग्राम टाइप आई कोलेजनेस पाउडर को भंग करें।
    नोट: 0.22 माइक्रोन छलनी के माध्यम से सभी एंजाइम समाधानों को फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एंजाइमेटिक पाचन को बेअसर करने के लिए माध्यम के 500 एमएल तैयार करें: डीएमईएम माध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पी/एस।

3. डायरेक्ट एक्सप्लांट विधि

  1. जिंडिवल ऊतक पूर्वउपचार
    1. 30 एस के लिए 75% इथेनॉल के 5 मिलील के साथ gingival ऊतक धोएं। फिर, 5 मिनट के लिए धोने के समाधान (चरण 2.1) के 5 एमएल के साथ दो बार कुल्ला करें।
      नोट: 50 मिमी व्यास के साथ सेल संस्कृति व्यंजनों में सभी धोता प्रदर्शन करें।
  2. गिजिवल एपिथेलियल सेल संस्कृति
    1. ग्इंगिवल टिश्यू को 1 एमएम3 पीस में काट लें और उन्हें 100 एमएम सेल कल्चर डिश में तितर-बितर करें। काटने के संचालन के लिए ठीक नुकीले संदंश और नेत्र कैंची का प्रयोग करें।
    2. संस्कृति पकवान के लिए जी-माध्यम (चरण 2.2) जोड़ें। इसके बाद कल्चर डिश को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर 24 घंटे में ऊतकों की जांच करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप (40x) का उपयोग करें।
    3. जब एपिथेलियल कोशिकाओं ने ऊतक के टुकड़ों के चारों ओर व्यास में 2-5 मिमी तक प्रचारित किया हो तो गिंगिवल ऊतक के टुकड़ों को हटा दें। हर 2-4 दिन में जी-मीडियम बदलें।

4. नई संशोधित एंजाइमेटिक विधि

  1. जिंडिवल ऊतक पूर्वउपचार
    1. इसके लिए, सीधे एक्सप्लांट विधि के लिए वर्णित समान चरणों का पालन करें, चरण 3.1.1।
  2. जिजिवल ऊतक का पाचन
    1. gingival ऊतक छोटे टुकड़ों में कटौती, आकार में लगभग <1 मिमी, दो निष्फल ब्लेड के साथ । दो सर्जिकल ब्लेड के साथ श्रेडिंग की प्रक्रिया दोहराएं।
    2. 1.5 मिलीग्राम / एमएल डिस्पास + कोलेजनेस समाधान के 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में 1.5 मिलीग्राम की 1 मिलीएल डालें, जिसमें ऊग् लीववाल ऊतक के टुकड़े होते हैं, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 15-20 मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    3. जब ऊतक पारदर्शी और फ्लोकुलेंट हो जाता है, तो पाचन समाप्त करने के लिए बेअसर समाधान का 1 एमएल जोड़ें। 10-15 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं। समाधान को 100 माइक्रोन मेश फ़िल्टर के माध्यम से पास करें।
    4. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    5. सुपरनैंट निकालें और ग्रोथ-फैक्टर युक्त माध्यम (चरण 2.2) के 10 एमएल में नीचे की ओर सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। सेल निलंबन को 100 मिमी सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें। सेल कल्चर डिश में वाई-27632 के 10 माइक्रोन जोड़ें।
    6. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में। पुराने जी-मीडियम को हर 2 दिन में फ्रेश जी-मीडियम से बदलें। 1 दिन और 3 दिन पर कोशिकाओं का निरीक्षण करें ।

5. सेल पासaging

  1. डिश को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें, खर्च किए गए मीडियम को हटा दें और पीबीएस के साथ दो बार धोएं । प्रत्येक 100 मिमी डिश के लिए 0.05% ट्राइपसिन का 2 मिलियन मिलियन जोड़ें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए पकवान को हिलाएं कि ट्राइप्सिन समाधान और डिश बॉटम के बीच पर्याप्त संपर्क है।
  2. पाचन प्रक्रिया के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के आसपास एक इनक्यूबेटर में पकवान छोड़ दें।
  3. कोशिकाओं की जांच करने और यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप (40x) का उपयोग करें कि अधिकांश कोशिकाएं पकवान के नीचे से अलग हो गई हैं।
  4. पाचन को रोकने के लिए बेअसर समाधान के 2 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। पिपेट अप और डाउन 10-15 बार। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
  5. सुपरनेट को धीरे-धीरे हटा दें। जी-मीडियम की 10 एमएल वाली कोशिकाओं को रिस् पेंड करें और कोशिकाओं की संख्या गिनें।
  6. जी-मीडियम के 10 एमएल में करीब 1 x 106 सेल और हर 100 एमएम डिश में 10 माइक्रोएम वाई-27632 डालें।
  7. हर 2 दिन में जी-मीडियम और वाई-27632 को रिन्यू करें। 1 दिन और 5 दिन पर कोशिकाओं को देखें ।

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Representative Results

चित्रा 1 प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और संशोधित एंजाइमेटिक विधि का एक योजनाबद्ध आरेख दिखाता है। डायरेक्ट एक्सप्लांट विधि को पूरी प्रक्रिया के दौरान किसी भी पाचन एंजाइम की आवश्यकता नहीं होती है। इसके विपरीत, पारंपरिक एंजाइमीय विधि को आमतौर पर अंतर्निहित फाइब्रोब्लास्ट परत से एपिथेलियल शीट को अलग करने के लिए पाचन एंजाइमों, डिप्नेस और कोलेजनेस के दो सेटों की आवश्यकता होती है, और फिर एपिथेलियल कोशिकाओं को निलंबन में छोड़ने के लिए ट्राइप्सिन। हमारी नई विधि जुदाई के कदम को छोड़ देता है और एक सरलीकृत एंजाइमेटिक विधि है। इसके अलावा, जी-मीडियम में वाई-27632 जोड़ना प्रभावी रूप से एपिथेलियल सेल ग्रोथ को बढ़ावा देता है। प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि आमतौर पर gingival epithelial कोशिकाओं के लिए पर्याप्त रूप से पारित होने के लिए विकसित करने के लिए और आसानी से दूषित है के बारे में 2 सप्ताह लगते हैं । हालांकि, नई विधि द्वारा प्राप्त gingival epithelial कोशिकाओं की संख्या काफी है कि प्रत्यक्ष explant विधि द्वारा प्राप्त की तुलना में बड़ा है और केवल 8 दिनों के एक औसत के लिए passaging के लिए आवश्यकताओं को पूरा लेता है ।

Figure 1
चित्र 1:प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और नई विधि की तुलना। (ए)योजना प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि की प्रक्रिया को दिखाती है। गिंगिवल टिश्यू पीस को कल्चर डिश में रखा जाता है। एपिथेलियल कोशिकाओं को जी-मीडियम में सुसंस्कृत किया जाता है और ऊतक के टुकड़ों से बाहर निकलता है। डायरेक्ट एक्सप्लांट विधि आमतौर पर एपिथेलियल कोशिकाओं को 80% संगम तक पहुंचने में लगभग 13 दिन लगते हैं। (ख)नई एंजाइमेटिक विधि की प्रक्रिया को दर्शाने वाली योजना । गिंगिवल टिश्यू के टुकड़े डिस्पाज और कोलेजनेस आई से पचते हैं, जिसके बाद सेल छर्रों को वाई-27632 के साथ जी-मीडियम में सुसंस्कृत किया जाता है। नई एंजाइमेटिक विधि आमतौर पर 80% संगम तक पहुंचने में लगभग 6 दिन लगती है जो पासिंग के लिए उपयुक्त है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि द्वारा तैयार वयस्क ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं और नई विधि द्वारा तीसरे और सातवें दिनों(चित्रा 2 ए)पर माइक्रोस्कोप में देखा गया। यह देखा जा सकता है कि नई विधि ने तीसरे और सातवें दिनों में ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं के उत्पादन में काफी वृद्धि की। नई विधि द्वारा प्राप्त gingival epithelial कोशिकाओं के विकास घटता है और प्रत्यक्ष explant विधि द्वारा एक सेल गिनती किट (CCK-8) का उपयोग कर मापा गया अलग समय अंक (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d)(चित्रा 2B)पर । नई विधि का उपयोग करके तैयार कोशिकाओं का दोगुना समय लगभग 1-2 दिन था, लेकिन प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि का उपयोग करके तैयार कोशिकाओं का दोगुना समय लगभग 5-6 दिन था। दो तरीकों से कोशिका पैदावार सातवें दिन(चित्रा 2C)पर गणना की गई और पता चला कि नई विधि (9 x 10 6) द्वारा उत्पादित कोशिकाओं की संख्या प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि(3x 106)द्वारा उत्पादित कोशिकाओं की संख्या से तीन गुना अधिक थी। चित्रा 2D से पता चलता है कि प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि (13 दिनों) की तुलना में 80% संगम प्राप्त करने में नई विधि (6 दिन) के लिए लगभग आधा समय लगा।

Figure 2
चित्र 2:नई एंजाइमेटिक विधि प्राथमिक ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं के उत्पादन को बढ़ाती है। (क)प्रारंभिक टीका के बाद तीसरे और सातवें दिन प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि (निचली पंक्ति) और नई एंजाइमेटिक विधि (शीर्ष पंक्ति) द्वारा तैयार gingival epithelial कोशिकाओं की छवियां । स्केल बार = 200 माइक्रोन.(बी)जिंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं को प्रत्यक्ष विधि द्वारा सुसंस्कृत किया गया था और नई एंजाइमेटिक विधि 1, 2, 3, 4, 5 और 6 दिनों में एकत्र की गई थी, और एक सीकेई-8 किट का उपयोग करके जिंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं की संख्या का विश्लेषण किया गया था। (ग)संस्कृति के 7 दिनों के बाद, gingival epithelial कोशिकाओं को ट्राइप्सिन द्वारा अलग किया गया था और एकत्र किया गया था । दो तरीकों से अलग-अलग तैयार किए गए ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए एक सेल काउंटिंग प्लेट का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं की संख्या की गणना दो तरीकों से की गई थी, जिन्हें तीन बार अलग-अलग दोहराया गया था, और परिणाम प्रति 100 मिमी पकवान कोशिकाओं की औसत संख्या के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। (घ)नई एंजाइमेटिक विधि द्वारा तैयार प्राथमिक जिंजीवाल एपिथेलियल कोशिकाओं (मार्ग 0) के 80% संगम तक पहुंचने के औसत समय की तुलना की जाती है। बी, सी, और डी: छात्र टीपरीक्षण का इस्तेमाल किया गया था; त्रुटि सलाखों के मानक विचलन दिखा; द = 4; * * पी < 0.01, * पी < 0.05 जब प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि के साथ नई एंजाइमेटिक विधि की तुलना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नई विधि द्वारा प्राप्त ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं (मार्ग 3 पर) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से पता चला कि सीके 5 की अभिव्यक्ति, CK18, और पैन-सीके (CK14, CK15, CK16, और CK19) सकारात्मक था(चित्रा 3A,सी, डी)11,12,13,14,15,जबकि CK10 और vimentin की अभिव्यक्ति कम थी(चित्रा 3B,E)11, 16। सीके 5 और पैन-सीके (सीके 14, सीके 15, सीके 16 और सीके 19) मुख्य रूप से एपिथेलियल कोशिकाओं की बेसल परत में स्थानीयकृत थे, जो उनके उच्च भेदभाव क्षमता11,14,15का संकेत है। सीके10 विभेदित एपिथेलियम11का एक मार्कर है और विमेंटिन16गिंगिवल फाइब्रोब्लास्ट का एक मार्कर है । नई विधि से अलग gingival epithelial कोशिकाओं की केराटिन सकारात्मक दर अधिक थी, विशेष रूप से CK5, CK18, और पैन-सीके(चित्रा 3 ए,सी, डी),जो संकेत दिया कि अलग gingival epithelial कोशिकाओं को एक अच्छा तहखाने झिल्ली समारोह बनाए रख सकता है । विभेदन मार्कर CK10(चित्रा 3B)की कम अभिव्यक्ति ने संकेत दिया कि gingival epithelial कोशिकाओं में एक उच्च भेदभाव क्षमता थी । इन विट्रो संस्कृतियों से पता चला है कि नई विधि से अलग किए गए ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं को आठवीं पीढ़ी के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, और विमेंटिन की कम अभिव्यक्ति ने संकेत दिया कि ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं में उच्च शुद्धता थी, कि कोई भी gingival फाइब्रोब्लास्ट उन्हें दूषित नहीं करता है और पृथकताशीलता उच्च थी(चित्रा 3E)।

Figure 3
चित्रा 3:नई एंजाइमेटिक विधि द्वारा तैयार gingival epithelial कोशिकाओं (P3) के विशिष्ट मार्कर । (ए-ई)शो CK5 (लाल), CK10 (लाल), CK18 (लाल), पैन-सीके (लाल), और विमेंटिन (लाल) सकारात्मक कोशिकाओं, DAPI (नीला) का उपयोग नाभिक को दागने के लिए किया गया था । (A-C)स्केल बार = 100 माइक्रोन; (घ)और(ई)स्केल बार = 50 माइक्रोन; प्रयोग को स्वतंत्र रूप से चार बार दोहराया गया । (ए),(सी),और(डी)gingival epithelial कोशिकाओं में CK5, CK18, और पैन-ck (CK14, 15, 16, और 19) की सकारात्मक अभिव्यक्ति दिखाते हैं, जबकि(बी)और(ई)Gingival epithelial कोशिकाओं में CK10 और vimentin की कम अभिव्यक्ति दिखाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नई विधि ने प्राथमिक ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं में ki67, p63, और p75NGFR (कम आत्मीयता तंत्रिका विकास कारक रिसेप्टर पी 75) की अभिव्यक्ति में वृद्धि की। मार्ग 3 कोशिकाओं को इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए चुना गया था, जिससे पता चला कि कि ki67, p63 और p75NGFR की सकारात्मक अभिव्यक्ति प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि(चित्रा 4 ए,सी, ई)द्वारा प्राप्त gingival epithelial कोशिकाओं की तुलना में अधिक थी । कि67, p63, और p75NGFR की सकारात्मक अभिव्यक्ति दर क्रमशः 80%, 98%, और 96% थी, जो कि67 (35%), p63 (40%), और p75NGFR (47%) प्रत्यक्ष विधि(चित्रा 4B,D,F)द्वारा प्राप्त की तुलना में काफी अधिक थी। Ki67, p63, और p75NGFR मौखिक एपिथेलियल स्टेम सेल17के मार्कर हैं । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि प्राथमिक gingival epithelial कोशिकाओं को अलग और नई विधि का उपयोग कर सुसंस्कृत स्टेम सेल आबादी निहित, एक उच्च प्रसार क्षमता थी, और gingival epithelial कोशिकाओं के स्टेम सेल गुणों को बनाए रखा ।

Figure 4
चित्रा 4:प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और नई एंजाइमेटिक विधि द्वारा प्राप्त gingival epithelial कोशिकाओं (P3) की स्टेम सेल विशेषताओं। (ए),(सी),और(ई)मार्ग 3 (P3) पर gingival epithelial कोशिकाओं के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों को क्रमशः, ki67 (लाल), p63 (लाल), और p75NGFR (लाल) सकारात्मक कोशिकाओं को प्रत्यक्ष विस्तार विधि और नई एंजाइमेटिक विधि द्वारा प्राप्त दिखा । दापी (नीला) का उपयोग नाभिक को दागने के लिए किया जाता था। स्केल बार = 50 माइक्रोन(बी),(डी),और(एफ)सीधे एक्सप्लांट विधि द्वारा प्राप्त gingival एपिथेलियल कोशिकाओं (P3) में क्रमशः ki67-सकारात्मक कोशिकाओं, p63-सकारात्मक कोशिकाओं, और p75NGFR-सकारात्मक कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण दिखाते हैं। प्रत्येक समूह की मात्रा निर्धारित करने के लिए कुल 400 कोशिकाओं की गणना की गई थी, और ki67, p63 और p75NGFR सकारात्मक कोशिकाओं की औसत संख्या दिखाई जाती है। बी, डी, और एफ: छात्र टीपरीक्षण का इस्तेमाल किया गया था; त्रुटि सलाखों के मानक विचलन दिखा; प्रयोग को स्वतंत्र रूप से चार बार दोहराया गया (एन = 4); * * पी < 0.01, जब प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि के साथ नई एंजाइमेटिक विधि की तुलना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

जिंडिवल ऊतक एक प्रमुख संरचना है जो पीरियोडोन्टल अखंडता और स्वास्थ्य को बनाए रखती है। Gingival epithelial कोशिकाओं की मरम्मत और पीरियोडोन्टल ऊतक के उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिकाएं हैं और वैज्ञानिक अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों और संबंधित क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है, मौखिक जीव विज्ञान, फार्माकोलॉजी, विष विज्ञान, और मौखिक म्यूकोसा की कमीसहित 18। इसलिए, मौखिक एपिथेलियल कोशिकाओं को काटने के लिए एक स्थिर और कुशल विधि विकसित करना आवश्यक है19. प्राथमिक एपिथेलियल कोशिकाएं कुछ मार्ग और एक छोटी उम्र के साथ पूरी तरह से विभेदित कोशिकाओं का एक प्रकार हैं। कृषि एपिथेलियल कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट5की खेती की तुलना में अधिक जटिल साबित हुई हैं ।

वर्तमान में, प्रकाशित साहित्य से पता चलता है कि विभिन्न प्रोटोकॉल एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए मौजूद हैं। हालांकि, दो तरीके, प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि और एंजाइमेटिक विधि, उन प्रोटोकॉल के बीच सबसे अधिक बार उपयोग की जाती हैं। 1 9 10 में, कैरेल और बिल ने सबसे पहले20प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि नामक गिंगिवल और बुक्कल एपिथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन किया। प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि में ऊतक नमूनों, कम जटिल प्रक्रियाओं, कम भिन्नता और चरणों में कम भागीदारी के लिए कम वजन की आवश्यकताओं के फायदे हैं, लेकिन इसमें लंबे संस्कृति समय की आवश्यकता के नुकसान हैं और यह संदूषण5के लिए अतिसंवेदनशील है। 1 9 75 में, रिनवाल्ड और ग्रीन ने सबसे पहले विकिरणित 3T3 माउस फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके विट्रो21में मौखिक एपिथेलियल कोशिकाओं को संस्कृति के लिए एक फीडर परत के रूप में एंजाइमेटिक विधि की सूचना दी। यद्यपि इस विधि ने केराटिनोसाइट्स की उपज में काफी सुधार किया, लेकिन किरणित माउस फीडर सेल परत में संभावित जैविक जोखिम22थे। उसके बाद, फीडर-कोशिकाओं के बिना संस्कृति प्रणालियां22 और सीरम23के बिना,24 विकसित किए गए जिससे यह साबित हुआ कि एपिथेलियल सेल संस्कृतियों के लिए 3T3 कोशिकाएं आवश्यक नहीं थीं। हालांकि एंजाइमीय विधि कम संस्कृति समय की आवश्यकता है, दक्षता अपेक्षाकृत कम है और एंजाइमों और मध्यम25इस्तेमाल के आधार पर बदलता है । कई प्रयोगशालाओं ने दो विधियों की तुलना की और केजरून एट अल6 ने डायरेक्ट एक्सप्लांट तकनीक को एंजाइमेटिक विधि की तुलना में अधिक सफल होने का अवलोकन किया और सेल प्रसार की उच्च दर पाई। श्वेता एट अल26 ने निष्कर्ष निकाला कि प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि मौखिक म्यूकोसल केराटिनोसाइट्स के अलगाव के लिए एक सरल और सफल तकनीक प्रतीत होती है। हालांकि, Klingbeil एट अल7 बस विपरीत निष्कर्ष निकाला, यानी, एंजाइमेटिक विधि एक अच्छा जीवन अवधि के साथ कम समय में सबसे अच्छा परिणाम दिखाया । डेनियल एट अल द्वारा ब्रिटेन में किए गए एक सर्वेक्षणमें 19 ने मानव केराटिनोसाइट्स के अलगाव और सेल संस्कृति के तरीकों की समीक्षा की और बताया कि 34 प्रयोगशालाओं में से 21 ने कुछ विविधताओं के साथ एंजाइमैटिक विधि का उपयोग किया। हालांकि प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि को कम ऊतक की आवश्यकता होती है और एंजाइमेटिक विधि की तुलना में कम हैंडलिंग कदम होते हैं, यह सुझाव दिया गया है कि एंजाइमेटिक विधि6का प्रबंधन करने के लिए तेज और आसान है। इसलिए, मौखिक एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक अधिक सुविधाजनक और प्रभावी विधि विकसित करना आवश्यक था4. हमारी नई विधि, एक सरलीकृत एंजाइमेटिक विधि जो वाई-27632 का उपयोग करती है, ने ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं के उत्पादन में काफी वृद्धि की और gingival ऊतक से gingival एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक समय को छोटा कर दिया।

चित्रा 2A से पता चलता है कि नई विधि ने तीसरे और सातवें दिनों में ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं के उत्पादन में काफी वृद्धि की। चित्रा 2B से पता चलता है कि नई एंजाइमेटिक विधि का उपयोग करके तैयार कोशिकाओं का दोगुना समय लगभग 1-2 दिन था लेकिन प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि का उपयोग करने में लगभग 5-6 दिन लगे। नई एंजाइमेटिक विधि (9 x 106)का उपयोग करके उत्पादित कोशिकाओं की संख्या सातवें दिन(चित्रा 2सी)पर प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि (3 x10 6)से तीन गुना अधिक थी। नई एंजाइमेटिक विधि का उपयोग करके तैयार की गई कोशिकाओं को 80% कॉन्फ्ल्यूंट बनने में 13 दिन लगे, जो पिछले अध्ययनों के अनुरूप है, जबकि प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि में लगभग 2 सप्ताह6,20.25 ± 1.05 दिन18 और 14.2 ±2.76 दिन 7 कोशिकाओं को उपसंस्कृति से पहले पूरी तरह से कॉन्फ्लेंट बनने में लगा। हालांकि, नई एंजाइमेटिक विधि को 80% कॉन्फ्ल्यूंट बनने में केवल 6 दिन लगे, जो हमारी प्रयोगशाला में 13 दिनों की प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि से बहुत कम है और क्लिंगबेल एट अल. 11.9 ± 2.36 दिनों की7 एंजाइमेटिक विधि है। हमें एक दिलचस्प घटना भी मिली, यानी, एपिथेलियल सेल उपनिवेश प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि में एक बहुस्तरीय संरचना में वृद्धि हुई, जबकि नई एंजाइमेटिक विधि का उपयोग करके एक समान मोनोलेयर संरचना देखी गई। जाहिर है, मोटा बहुस्तरीय कालोनियों 80%-100% ढुलमुल बनने के लिए आवश्यक समय को लम्बा । कारण है कि नई एंजाइमेटिक विधि सेल प्रसार को बढ़ावा देता है Y-27632, ROCK1 और ROCK2 के एक अवरोधक के अलावा है। Y-27632 शुरू में मानव एपिथेलियल सेल प्रसार और 200827में भेदभाव पर इसके सकारात्मक प्रभाव के लिए सूचित किया गया था। फेरीवाला एट अल28 ने बताया कि वाई-27632 के साथ उपचार ने केराटिनोसाइट्स की प्रसार क्षमता में बहुत वृद्धि की और इसके परिणामस्वरूप पता लगाने योग्य कोशिका संकट के बिना कुशल अमरीकरण हुआ। हमारे पिछले अध्ययनों में, हमने पाया कि वाई-27632 वयस्क त्वचाऊतक8,9,10से मानव प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं और केराटिनोसाइट्स की अलगाव प्रक्रिया को सरल बनाता है। स्ट्राडविक एट अल29 ने बताया कि कम कैल्शियम के साथ 10 माइक्रोन वाई-27632 के उपयोग ने प्राथमिक मानव केराटिनोसाइट्स को लंबे समय तक सेल फीडर परत के बिना सुसंस्कृत होने की अनुमति दी, जबकि अंतर करने और एक स्तरीकृत एपिथेलियम बनाने की क्षमता को बनाए रखा। इस अध्ययन में, वाई-27632 का उपयोग करके नई एंजाइमेटिक विधि ने अपनी उम्र का विस्तार करके और उनकी प्रसार क्षमता को बढ़ावा देकर एपिथेलियल कोशिकाओं की कटाई में बहुत वृद्धि की।

पारंपरिक एंजाइमेटिक विधि में पाचन के दो ऑपरेशन होते हैं। पहला पाचन डिसपेज़ का उपयोग करके संयोजी ऊतक से एपिथेलियल ऊतक को अलग करना है, जो स्ट्रोमल साइड4,5से काम करता है। दूसरा पाचन आमतौर पर एपिथेलियल कोशिकाओं को एपिथेलियल ऊतक4,5से अलग करने के लिए ट्राइप्सिन का उपयोग करता है । ट्राइप्सिन द्वारा एपिथेलियल कोशिकाओं के विनाश के कारण, एंजाइमेटिक विधि की दक्षता प्रभावित होती है4. यहां वर्णित नई एंजाइमेटिक विधि एक सरलीकृत विधि है जो एक पाचन चरण को छोड़ती है। नए और पारंपरिक एंजाइमीय तरीकों के बीच मुख्य अंतर5संयोजी ऊतक से एपिथेलियल ऊतक को अलग करने के प्रोटोकॉल को संदर्भित करता है । इसके अतिरिक्त, नई विधि पाचन चरण में ट्राइप्सिन के बजाय डिस्पास और कोलेजनेस का उपयोग करती है, और इसलिए एपिथेलियल कोशिकाओं की अखंडता अच्छी तरह से संरक्षित है। चिकित्सकीय रूप से, त्वचा और बुक्कल म्यूकोसा की तुलना में मानव गिंगिवा से ऊतक की समान मात्रा प्राप्त करना बहुत अधिक कठिन है। प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि के लिए गिंजिव ऊतकों के केवल छोटे टुकड़ों की आवश्यकता होती है और एंजाइमेटिक विधिकीतुलना में अधिक संख्या में कोशिकाओं की खेती की जाती है । हमने नई विधि का उपयोग करके थोड़ी मात्रा में gingival एपिथेलियल ऊतक का इलाज किया और एक बहुत ही संतोषजनक सेल घनत्व काटा। इससे पता चलता है कि नई विधि शुरू में प्रदान किए जाने वाले ऊतकों की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा पर निर्भर नहीं करती है। नई विधि की एक संभावित सीमा यह है कि प्रारंभिक संस्कृति (मार्ग 0) में फाइब्रोब्लास्ट के एक छोटी राशि (<5%) संदूषण दिखाई दे सकता है, लेकिन इसे 0.05% ट्राइप्सिन के अल्पकालिक उपचार द्वारा आसानी से हटाया जा सकता है जैसा कि प्रीविसौली9की रिपोर्ट की गई थी।

इस अध्ययन में, CK5, CK18, और पैन-सीके (CK14, CK15, CK16, और CK19) सकारात्मक थे(चित्रा 3A,सी, डी)। यह सुझाव दिया है कि अलग gingival epithelial कोशिकाओं को अपने तहखाने झिल्ली समारोह है, जो Orazizadeh एट अल के अध्ययन के अनुरूप है बनाए रखने में सक्षम थे ।30 और Kedjarune एट अल ।6। CK5 और CK14 एपिथेलियल-बेसल परत में स्थानीय रूप से अविभेदित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए जाते हैं। CK19 आमतौर पर सरल एपिथेलियम में और गैर-केराटिनाइज्ड स्तरीकृत एपिथेलियम31में पाया जाता है। नई एंजाइमेटिक विधि का उपयोग करके प्राप्त ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं (पी 3) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से पता चला है कि सीधे एक्सप्लांट विधि(चित्र 4)का उपयोग करके प्राप्त कोशिकाओं की तुलना में ki67, p63 और p75NGFR का अभिव्यक्ति स्तर अधिक था। यह परिणाम इंगित करता है कि नई विधि gingival epithelial कोशिकाओं के स्टेम सेल गुणों को बनाए रखने और gingival epithelial कोशिकाओं की प्रसार क्षमता को बढ़ावा कर सकते हैं । हमारे पिछले अध्ययन में पाया गया कि Y-27632 विस्तार8के बाद त्वचा एपिडर्मल स्टेम सेल क्षमता रखता है । वांग एट अल ने पाया कि वाई-२७६३२ मानव पीरियोडोन्टल स्नायु स्टेम सेल३२के प्रसार, प्रवासन और pluripotency की सुविधा प्रदान करता है ।

संक्षेप में, नई संशोधित एंजाइमेटिक विधि वयस्क gingival ऊतक से मानव प्राथमिक एपीथेलियल कोशिकाओं को अलग और संस्कृति के लिए एक सरलीकृत और प्रभावी प्रक्रिया प्रदान करता है । यह नई विधि आसान है, कम समय लेने वाली है और उनके स्टेम सेल गुणों को बढ़ाती है, और इस प्रकार कई मापदंडों में प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि की तुलना में स्पष्ट फायदे हैं। यह उन्नत विधि प्रयोगशाला और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों के लिए बड़ी संख्या में उच्च क्षमता वाले एपिथेलियल कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अधिक उपयुक्त है।

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Disclosures

सभी लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को शेंडोंग प्रांत प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ZR2019ZD36) के प्रमुख कार्यक्रम और शेंडोंग प्रांत (2019GSF108107) के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम द्वारा X.W. के लिए समर्थित किया गया था; शेंडोंग प्रांत (2018GSF118240) के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम जेजी के लिए; शेंडोंग प्रांत (2018WS163) की चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास परियोजना जेड एक्स, और शेंडोंग प्रांत (2019WS045) की चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास परियोजना जेएस

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Names Abbreviations & Comments
Countess automated cell counter Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. BBA0218AC Automatic cell counting
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubation
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50 ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifugation
1.5 ml microcentrifuge Tubes KIRGEN 190691J For cell digestion
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Gingival epithelial  cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HGGEPCs dissociation
Dilution Medium Life Technologies 50-9701 For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HGGEPCs isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HGGEPCs isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Gene Operation IAD1011 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Dojindo Molecular Technologies CK04 For Cell proliferation assay
Rabbit Anti-Human CK18 Abcam ab82254 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 Abcam ab76318 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts
Rabbit Anti-Human pan-ck BD 550951 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-Ki67 Abcam 15580 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p63 Biolegend 619002 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p75NGFR Abcam ab52987 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 177 ग्इंगिवल एपिथेलियल कोशिकाएं एंजाइमेटिक विधि प्रत्यक्ष एक्सप्लांट विधि सेल अलगाव सेल कल्चर वाई-27632 रो-संबद्ध किनेस अवरोधक इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण
Y-27632 का उपयोग करके प्राथमिक मानव गिंगिवल एपिथेलियल कोशिकाओं का अलगाव और संस्कृति
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Xie, Z., Shi, J., Zong, M., Xu, Q.,More

Xie, Z., Shi, J., Zong, M., Xu, Q., Liu, C., Wen, J., Zhang, Q., Liu, P., Liu, G., Guo, J., Wu, X. Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632. J. Vis. Exp. (177), e62978, doi:10.3791/62978 (2021).

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