Summary
Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.
Abstract
Diş eti dokusu periodontal dokuları koruyan ve birçok oral fonksiyonda anlamlı roller oynayan ilk yapıdır. Diş eti epitel, özellikle periodontal dokunun onarımı ve yenilenmesinde diş eti dokusunun önemli bir yapısıdır. Diş eti epitel hücrelerinin işlevlerini incelemek, oral kusurları onarmak ve biyomalzemelerin uyumluluğunu tespit etmek gibi çok önemli bilimsel değere sahiptir. İnsan dişeti epitel hücreleri son derece farklılaştırılmış keratinize hücreler olduğundan, ömürleri kısadır ve geçişleri zordur. Şimdiye kadar, diş eti epitel hücrelerini izole etmenin ve kültürlemenin sadece iki yolu vardır, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem. Bununla birlikte, doğrudan eksplant yöntemini kullanarak epitel hücreleri elde etmek için gereken süre daha uzundur ve enzymatic yöntemin hücre sağkalım oranı daha düşüktür. Klinik olarak, diş eti dokusunun kazanımı sınırlıdır, bu nedenle istikrarlı, verimli ve basit bir in vitro izolasyon ve kültür sistemine ihtiyaç vardır. Epitel hücrelerinin büyümesini seçici olarak teşvik edebilecek Rho ile ilişkili bir kinaz (ROCK) inhibitörü olan Y-27632'yi ekleyerek geleneksel enzimmatik yöntemi geliştirdik. Modifiye enzymatic yöntemimiz, geleneksel enzymatic yöntemin adımlarını basitleştirir ve doğrudan eksplant yöntemine ve enzymatic yönteme göre önemli avantajlara sahip olan epitel hücrelerinin kült verimliliğini arttırır.
Introduction
Periodontal dokuyu koruyan ilk hat savunma yapısı olan insan dişeti, sadece fiziksel ve kimyasal bir bariyer1değil, aynı zamanda bağışıklık yanıtlarına katılan ve bağışıklık bariyeri oluşturan farklı inflamatuar mediatör sınıflarını salgılar2,3. Diş eti epitel, periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, diş eti epitelinin savunmasını ve bağışıklığını incelemek periodontitin oluşumunu, tanısını ve tedavisini anlamak için büyük öneme sahiptir. Diş eti epitel hücrelerinin insan dişeti dokusundan izolasyonu ve kültürü, diş eti epitelinin incelenmesi için gerekli ilk adımdır. Böyle bir prosedür, doku mühendisliği için tohum hücreleri üretmek, periodontal ilişkili hastalıkların in vitro modelleri ve periodontal kusurları onarmak için malzemeler gibi temel operasyonları gerektirir.
Primer diş eti epitel hücreleri düşük bölünme oranı in vitro4ile karakterizedir Araştırmacılar on yıllardır optimal bir izolasyon ve yetiştirme yöntemi aramaktadır. Bugüne kadar laboratuvarlarda primer diş eti epitel hücrelerini in vitro4,5elde etmek için iki farklı teknik, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Doğrudan eksplant yöntemi, daha az miktarda doku örneğinin gerekliliği ve basit izolasyon prosedürü gibi avantajlara sahiptir, ancak daha uzun kültür süresi ve kontaminasyona yatkınlık dezavantajlarına sahiptir5. Enzimmatik yöntem gereken kültür süresini kısaltsa da, verimlilik nispeten düşüktür ve kullanılan enzimlere ve ortama bağlı olarak değişir. Kedjarune ve ark.6, alt kültürden önce (2 hafta) daha fazla zaman gerektiren doğrudan eksplant yönteminin, enzimatik yönteme kıyasla diş eti epitel hücrelerini kültlemede daha başarılı göründüğünü göstermiştir. Bununla birlikte, bu iki yöntemi karşılaştıran Klingbeil ve ark.7, enzmatik yöntemin oral epitel hücrelerinin birincil kültürleri için en iyi sonuçlara sahip olduğunu ve en kısa süre içinde (11.9 gün ile 14.2 gün) optimal hücre verimini elde etmenin mümkün olduğunu buldu.
Bu nedenle, oral epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için daha uygun ve etkili bir yöntem geliştirmek önemliydi4. Daha önce Rho ile ilişkili protein kinazının (ROCK) bir inhibitörü olan Y-27632'nin eklenmesinin, insan primer epidermal hücrelerinin ve keratinositlerin yetişkin cilt dokularından izolasyon prosedürünü basitleştirdiğini bildirdik8,9,10. Epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen ve epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen yeni bir şartlandırılmış aşılama ortamı olan G-medium'u geliştirdik8,9,10. Bu çalışmada G-medium ile Y-27632'yi birleştirerek diş eti epitel hücreleri için yeni bir serumsuz izolasyon ve kültür tekniği geliştirdik. Özünde, yöntemimiz geleneksel iki adımlı enzymatic yöntemin basitleştirilmesine dayanmaktadır, bu nedenle yeni yöntemimizi doğrudan explant yöntemiyle karşılaştırdık. Bu modifiye enzimatik yöntem, diş eti epitel hücrelerini diş eti dokusundan ayırmak için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltır ve diş eti epitel hücrelerinin kültleme verimliliğini arttırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan insan dokuları, Kurumun İnsan Araştırmaları Etik Kurulu yönergelerine göre Maksillofasiyal Cerrahi Anabilim Dalı'nda etkilenen dişlerin ekstraksiyonlarından atılan taze erişkin diş eti dokularıdır (Protokol No. GR201711, Tarih: 02-27-2017).
1. Hazırlıklar
- %3 penisilin/streptomisidin (P/S) ile desteklenmiş 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL tüplerde taze yetişkin dişeti dokularını toplayın ve dokuları 4 °C'de tutun.
NOT: Dokuları eksizyondan sonra 24 saat içinde aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi tedavi edin.
2. Reaktifleri ve kültür ortamını hazırlayın
- Yıkama solüsyonunun hazırlayın: %3 P/S. 50 mL PBS'yi 1,5 mL penisilin (100 U/mL) ve 1,5 mL streptomisilin (100 mg/L) ile karıştırın.
- 500 mL büyüme faktörü içeren ortam hazırlayın (G-medium olarak adlandırılır): %1 P/S içeren DMEM/F12 (3:1) ortamı, %2 B27 takviyesi, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 40 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) ve 40 μg/mL mantar zonklama.
- Yeni yöntem için enzim sindirim çözeltileri hazırlayın: 50 mL DMEM'de 125 mg Dispase tozu ve 125 mg Tip I kollajenaz tozunu çözün.
NOT: Tüm enzim çözeltilerini 0,22 μm süzgeçten filtreleyin ve 4 °C'de saklayın. - Enzimamatik sindirimi nötralize etmek için ortamın 500 mL'sini hazırlayın: DMEM ortamında% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 P / S.
3. Doğrudan explant yöntemi
- Dişeti dokusu önksezisi
- Dişeti dokusunu 30 s için 5 mL% 75 etanol ile yıkayın. Ardından, 5 mL yıkama çözeltisi (adım 2.1) ile iki kez 5 dakika durulayın.
NOT: Tüm yıkamaları 50 mm çapındaki hücre kültürü yemeklerinde gerçekleştirin.
- Dişeti dokusunu 30 s için 5 mL% 75 etanol ile yıkayın. Ardından, 5 mL yıkama çözeltisi (adım 2.1) ile iki kez 5 dakika durulayın.
- Diş eti epitel hücre kültürü
- Diş eti dokusunu 1 mm3 parçaya bölün ve 100 mm hücre kültürü kabına saçın. Kesme işlemleri için ince sivri forseps ve oftalmik makas kullanın.
- G-medium'u (adım 2.2) kültür yemeğine ekleyin. Ardından, kültür çanasını 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatırın. Her 24 saatte bir dokuları incelemek için ters bir mikroskop (40x) kullanın.
- Epitel hücreleri doku parçalarının etrafında 2-5 mm çapında yayıldığında diş eti doku parçalarını çıkarın. G-medium'u her 2-4 günde bir değiştirin.
4. Yeni modifiye enzymatic yöntem
- Dişeti dokusu önksezisi
- Bunun için, doğrudan explant yöntemi olan 3.1.1 adımı için açıklanan adımları izleyin.
- Diş eti dokusunun sindirimi
- Diş eti dokusunu iki sterilize bıçak ile yaklaşık <1 mm büyüklüğünde küçük parçalar halinde kesin. İki cerrahi bıçakla parçalama işlemini tekrarlayın.
- Diş eti doku parçalarını içeren 1,5 mL santrifüj tüpüne 1 mL 2,5 mg/mL dispaz + kollajenaz çözeltisi ekleyin ve ardından tüpü 37 °C'de bir inkübatörde 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
- Doku şeffaf ve flokülent olduğunda, sindirimi sonlandırmak için nötralizasyon çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin. Çözeltiyi 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Çözeltiyi 100 μm örgü filtreden geçirin.
- 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj.
- Süpernatant çıkarın ve 10 mL büyüme faktörü içeren ortamda alttaki hücre peletini yeniden atın (adım 2.2). Hücre süspansiyonunu 100 mm hücre kültürü çanasına aktarın. Hücre kültürü yemeğine 10 μM Y-27632 ekleyin.
- %5 CO2 inkübatörde 37 °C'deki hücreleri kültüre edin. Eski G-medium'u her 2 günde bir taze G-medium ile değiştirin. 1. Gün ve 3.
5. Hücre geçişi
- Yemeği inkübatörden çıkarın, harcanan ortamı çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Her 100 mm'lik tabak için 2 mL% 0.05 tripsin ekleyin.
NOT: Trypsin çözeltisi ile bulaşık tabanı arasında yeterli temas olduğundan emin olmak için yemeği çalkalayın. - Sindirim işlemi için kabı 37 °C'de yaklaşık 5 dakika bir inkübatörde bırakın.
- Hücreleri incelemek ve çoğu hücrenin çanağın dibinden ayrıldığından emin olmak için bir mikroskop (40x) kullanın.
- Sindirimi durdurmak ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarmak için nötralizasyon çözeltisinin 2 mL'lik kısmını ekleyin. Pipet 10-15 kez yukarı ve aşağı. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin.
- Üstnatant yavaşça çıkarın. Hücreleri 10 mL G-medium ile yeniden biriktirin ve hücre sayısını sayın.
- Her 100 mm'lik yemeğe10 mL G-medium ve 10 μM Y-27632'de yaklaşık 1 x 10 6 hücre ekleyin.
- G-medium ve Y-27632'yi her 2 günde bir yenileyin. Hücreleri 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, doğrudan eksplant yönteminin ve değiştirilmiş enzymatic yönteminin şematik diyagramını gösterir. Doğrudan eksplant yöntemi tüm süreç boyunca herhangi bir sindirim enzimi gerektirmez. Buna karşılık, geleneksel enzymatic yöntem genellikle epitel tabakasını alttaki fibroblast tabakasından ayırmak için dispaz ve kollajenaz olmak üzere iki sindirim enzimi kümesine ihtiyaç duyar ve daha sonra epitel hücrelerini süspansiyona serbest bırakmak için tripsin gerekir. Yeni yöntemimiz ayırma adımını atlar ve basitleştirilmiş bir enzmatik yöntemdir. Ayrıca, G-medium'a Y-27632 eklenmesi epitel hücre büyümesini etkili bir şekilde teşvik eder. Doğrudan eksplant yöntemi genellikle diş eti epitel hücrelerinin geçiş için yeterince büyümesi yaklaşık 2 hafta sürer ve kolayca kirlenir. Bununla birlikte, yeni yöntemle elde edilen diş eti epitel hücrelerinin sayısı, doğrudan eksplant yöntemi ile elde edilenden önemli ölçüde daha büyüktür ve geçiş gereksinimlerini karşılamak için sadece ortalama 8 gün sürer.
Şekil 1: Doğrudan explant yöntemi ile yeni yöntemin karşılaştırılması. (A) Doğrudan explant yönteminin sürecini gösteren şema. Diş eti doku parçaları bir kültür yemeğine yerleştirilir. Epitel hücreleri G-medium'da kültürlenir ve doku parçalarından büyür. Epitel hücrelerinin% 80 birleştiğine ulaşması için doğrudan eksplant yöntemi genellikle yaklaşık 13 gün sürer. (B) Yeni enzymatic yöntemin sürecini gösteren şema. Diş eti doku parçaları dispaz ve kollajenaz I ile sindirilir, daha sonra hücre peletleri Y-27632 ile G-medium'da kültürlenir. Yeni enzymatic yöntemin pas geçme için uygun olan % 80 izdihama ulaşması genellikle yaklaşık 6 gün sürer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Doğrudan eksplant yöntemi ve yeni yöntemle hazırlanan erişkin diş eti epitel hücreleri üçüncü ve yedinci günlerde mikroskopta gözlenmiştir(Şekil 2A). Yeni yöntemin üçüncü ve yedinci günlerde diş eti epitel hücrelerinin üretimini önemli ölçüde artırdığı görülebilir. Yeni yöntemle ve doğrudan eksplant yöntemiyle elde edilen diş eti epitel hücrelerinin büyüme eğrileri, farklı zaman noktalarında (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d) bir hücre sayım kiti (CCK-8) kullanılarak ölçüldü (Şekil 2B). Yeni yöntem kullanılarak hazırlanan hücrelerin iki katına çıkarma süresi yaklaşık 1-2 gün, ancak doğrudan eksplant yöntemi kullanılarak hazırlanan hücrelerin iki katına çıkarma süresi yaklaşık 5-6 gün idi. İki yöntemle hücre verimi yedinci günde hesaplanmıştır (Şekil 2C) ve yeni yöntemle üretilen hücre sayısının (9 x 106)doğrudan eksplant yöntemiyle üretilen hücre sayısından üç kat daha fazla olduğunu göstermiştir (3 x 106). Şekil 2D, yeni yöntemin (6 gün) doğrudan eksplant yöntemine (13 gün) kıyasla% 80 izdiham elde etmesinin yaklaşık yarım zaman aldığını göstermektedir.
Şekil 2: Yeni enzimatik yöntem primer diş eti epitel hücrelerinin üretimini artırır. (A) İlk aşılamadan sonraki üçüncü ve yedinci günde doğrudan eksplant yöntemi (alt sıra) ve yeni enzimatik yöntem (üst sıra) tarafından hazırlanan diş eti epitel hücrelerinin görüntüleri. Ölçek çubukları = 200 μm. (B) Doğrudan yöntemle kültürlenen gingival epitel hücreleri ve yeni enzimatik yöntem 1, 2, 3, 4, 5 ve 6. günlerde toplanmış ve dişeti epitel hücrelerinin sayısı bir CCK-8 kiti kullanılarak analiz edilmiştir. (C) 7 günlük kültürden sonra diş eti epitel hücreleri tripsin ile ayrılarak toplandı. İki yöntemle ayrı ayrı hazırlanan diş eti epitel hücrelerinin sayısını belirlemek için hücre sayım plakası kullanılmıştır. Hücre sayısı, ayrı ayrı üç kez tekrarlanan iki yöntemden hesaplandı ve sonuçlar 100 mm çanak başına ortalama hücre sayısı olarak ifade edildi. (D) Yeni enzimatik yöntemle ve doğrudan eksplant yöntemi ile hazırlanan primer diş eti epitel hücrelerinin (pasaj 0) %80 birleşmesi için ortalama süre karşılaştırılır. B, C ve D: Öğrencinin t-testi kullanıldı; hata çubukları standart sapmayı gösterir; n = 4; **p < 0.01, *p yeni enzymatic yöntemi doğrudan explant yöntemi ile karşılaştırırken 0.05 <. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Yeni yöntemle elde edilen diş eti epitel hücrelerinin immünoresans analizi (3. geçişte) CK5 ekspresyonunun, CK18 ve Pan-CK (CK14, CK15, CK16 ve CK19) pozitifti (Şekil 3A,C,D)11,12,13,14,15, CK10 ve vimentin ifadesi düşükken ( Şekil3B,E)11,16. CK5 ve Pan-CK (CK14, CK15, CK16 ve CK19) esas olarak epitel hücrelerinin bazal tabakasında lokalize edildi, bu da yüksek farklılaşma potansiyellerinin bir işaretidir11,14,15. CK10 farklılaştırılmış epitel11'inbir işaretidir ve vimentin diş eti fibroblastlarının bir işaretidir16. Yeni yöntemle izole edilen diş eti epitel hücrelerinin keratin pozitif oranı daha yüksekti, özellikle CK5, CK18 ve Pan-CK (Şekil 3A, C,D), izole edilen diş eti epitel hücrelerinin iyi bir bodrum membran fonksiyonunu koruyabileceğini gösterdi. CK10(Şekil 3B)farklılaşma işaretleyicisinin düşük ifadesi, diş eti epitel hücrelerinin yüksek bir farklılaşma potansiyeline sahip olduğunu gösterdi. İn vitro kültürler, yeni yöntemle izole edilen dişeti epitel hücrelerinin sekizinci nesle kültürlendirilebileceğini ve vimentin ekspresyonunun düşüklüğünün diş eti epitel hücrelerinin yüksek saflığa sahip olduğunu, hiçbir dişeti fibroblastının onları kirlettiğini ve izolasyon verimliliğinin yüksek olduğunugöstermiştir (Şekil 3E).
Şekil 3: Yeni enzimatik yöntemle hazırlanan diş eti epitel hücrelerinin (P3) spesifik belirteçleri. (A-E) CK5 (kırmızı), CK10 (kırmızı), CK18 (kırmızı), Pan-CK (kırmızı) ve vimentin (kırmızı) pozitif hücreleri, çekirdekleri lekelendirmek için DAPI (mavi) kullanılmıştır. (A-C) ölçek çubukları = 100 μm; (D) ve (E) ölçek çubukları = 50 μm; deney bağımsız olarak dört kez tekrarlandı. (A), (C) ve (D) dişeti epitel hücrelerinde CK5, CK18 ve pan-ck (CK14, 15, 16 ve 19) pozitif ifadesini gösterirken, (B) ve (E) diş eti epitel hücrelerinde CK10 ve vimentin düşük ifadesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Yeni yöntem primer diş eti epitel hücrelerinde ki67, p63 ve p75NGFR (düşük benzeşimli sinir büyüme faktörü reseptörü p75) ekspresyonunun arttırılmıştır. Ki67, p63 ve p75NGFR'nin pozitif ekspresyonunun doğrudan eksplant yöntemiyle elde edilen diş eti epitel hücrelerinden daha yüksek olduğunu ortaya çıkaran immunofluoresans analizi için pasaj 3 hücreleri seçildi (Şekil 4A,C,E). Ki67, p63 ve p75NGFR pozitif ifade oranları yeni yöntemde sırasıyla %80, %98 ve %96 idi ve bu oran doğrudan yöntemle elde edilen ki67 (%35), p63 (%40) ve p75NGFR (%47) oranlarından anlamlı olarak yüksekti (Şekil 4B,D,F). Ki67, p63 ve p75NGFR oral epitel kök hücrelerinin belirteçleridir17. Bu sonuçlar, yeni yöntem kullanılarak izole edilen ve kültürlenen primer dişeti epitel hücrelerinin kök hücre popülasyonları içerdiğini, yüksek çoğalma potansiyeline sahip olduğunu ve dişeti epitel hücrelerinin kök hücre özelliklerini koruduğunu gösterdi.
Şekil 4: Doğrudan eksplant yöntemi ve yeni enzimatik yöntemle elde edilen diş eti epitel hücrelerinin (P3) kök hücre özellikleri. (A), (C) ve (E) pasaj 3 'teki (P3) diş eti epitel hücrelerinin temsili immünofluoresans görüntülerini gösterir, sırasıyla doğrudan eksizyon yöntemi ve yeni enzimatik yöntemle elde edilen ki67 (kırmızı), p63 (kırmızı) ve p75NGFR (kırmızı) pozitif hücreleri gösterir. Çekirdekleri lekelendirmek için DAPI (mavi) kullanılmıştır. Ölçek çubukları = 50 μm. (B), (D) ve (F) doğrudan eksizyon yöntemi ve yeni enzimatik yöntemle elde edilen diş eti epitel hücrelerinde (P3) sırasıyla ki67 pozitif hücrelerin, p63 pozitif hücrelerin ve p75NGFR pozitif hücrelerin nicel analizini gösterir. Her grubu ölçmek için toplam 400 hücre sayıldı ve ortalama ki67, p63 ve p75NGFR pozitif hücre sayıları gösterildi. B, D ve F: Öğrencinin t-testi kullanıldı; hata çubukları standart sapmayı gösterir; deney bağımsız olarak dört kez tekrarlandı (n = 4); **p < 0.01, yeni enzymatic yöntemi doğrudan explant yöntemi ile karşılaştırırken. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diş eti dokusu periodontal bütünlüğü ve sağlığı koruyan anahtar bir yapıdır. Dişeti epitel hücreleri periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli rollere sahiptir ve oral biyoloji, farmakoloji, toksikoloji ve oral mukoza eksiklikleri de dahil olmak üzere bilimsel araştırma ve klinik uygulamalarda ve ilgili alanlarda kullanılabilir18. Bu nedenle, oral epitel hücrelerini hasat etmek için istikrarlı ve verimli bir yöntem geliştirmek gerekir19. Birincil epitel hücreleri, birkaç pasajı ve kısa ömrü olan bir tür tamamen farklılaştırılmış hücrelerdir. Kült epitel hücrelerinin, fibroblastları kültlemekten daha karmaşık olduğu kanıtlanmıştır5.
Şu anda, yayınlanan literatür epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için çeşitli protokollerin mevcut olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, doğrudan eksplant yöntemi ve enzymatic yöntem olmak üzere iki yöntem, bu protokoller arasında en sık kullanılan yöntemdir. 1910'da Carrel ve Burrows ilk olarak doğrudan eksplant yöntemi20adı verilen diş eti ve bukkal epitel hücrelerini elde etmek için bir yöntem tanımladılar. Doğrudan eksplant yöntemi, doku örnekleri için düşük ağırlık gereksinimleri, daha az karmaşık prosedürler, daha az varyasyon ve adımlara daha az katılım avantajlarına sahiptir, ancak uzun bir kültür süresi gerektirme dezavantajlarına sahiptir ve kontaminasyona karşı oldukça hassastır5. 1975'te, Rheinwald ve Green ilk olarak ışınlanmış 3T3 fare fibroblastlarını tüp bebek21'dekioral epitel hücrelerini kültüre beslemek için bir besleyici katman olarak kullanarak enzimatik yöntemi bildirdiler. Bu yöntem keratinositlerin verimini büyük ölçüde artırmış olsa da, ışınlanmış fare besleyici hücre katmanı potansiyel biyolojik risklere sahipti22. Bundan sonra, besleyici hücreleri olmayan kültür sistemleri22 ve serumsuz23,24 epitel hücre kültürleri için 3T3 hücrelerinin gerekli olmadığını kanıtlamaktadır. Enzimmatik yöntem daha az kültür zamanı gerektirse de, verimlilik nispeten düşüktür ve enzimlere ve kullanılan ortama bağlı olarak değişir25. Birkaç laboratuvar iki yöntemi karşılaştırdı ve Kedjarune ve ark.6, doğrudan eksplant tekniğinin enzmatik yöntemden daha başarılı olduğunu gözlemledi ve daha yüksek bir hücre çoğalma oranı buldu. Shwetha ve ark.26, doğrudan eksplant yönteminin oral mukozal keratinositlerin izolasyonu için basit ve başarılı bir teknik gibi göründüğü sonucuna vardı. Bununla birlikte, Klingbeil ve ark.7 tam tersi, yani enzymatic yöntemin iyi bir yaşam süresi ile daha kısa sürede en iyi sonuçları gösterdiği sonucuna vardı. Daniels ve ark.19 tarafından İngiltere'de yapılan bir anket, insan keratinositlerinin izolasyon ve hücre kültürü yöntemlerini gözden geçirdi ve yanıt veren 34 laboratuvardan 21'inin bazı varyasyonlarla enzymatic yöntemini kullandığını bildirdi. Doğrudan eksplant yöntemi daha az doku gerektirse ve enzymatic yöntemden daha az elleçleme adımına sahip olsa da, enzymatic yöntemin daha hızlı ve daha kolay yönetilmesi önerilmiştir6. Bu nedenle, oral epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için daha uygun ve etkili bir yöntem geliştirmek gerekiyordu4. Yeni yöntemimiz, Y-27632 kullanan basitleştirilmiş bir enzimatik yöntem, dişeti epitel hücrelerinin üretimini önemli ölçüde artırdı ve dişeti epitel hücrelerini diş eti dokusundan ayırmak için gereken süreyi kısalttı.
Şekil 2A, yeni yöntemin üçüncü ve yedinci günlerde diş eti epitel hücrelerinin üretimini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Şekil 2B, yeni enzmatik yöntem kullanılarak hazırlanan hücrelerin iki katına çıkarma süresinin yaklaşık 1-2 gün olduğunu ancak doğrudan eksplant yönteminin kullanılmasının yaklaşık 5-6 gün sürdüğünü göstermektedir. Yeni enzmatik yöntem (9 x 106)kullanılarak üretilen hücre sayısı, yedinci günde doğrudan eksplant yönteminden (3 x 106)üç kat daha fazlaydı (Şekil 2C). Yeni enzymatic yöntem kullanılarak hazırlanan hücrelerin % 80 izdiah olması 13 gün sürerken, doğrudan eksplant yöntemi yaklaşık 2 haftasürdü 6, 20.25 ± 1.05 gün18 ve 14.2 ±2.76 gün 7 hücrelerin alt kültürden önce tam olarak bir araya gelmesi için. Bununla birlikte, yeni enzymatic yöntemin% 80 konfüçyüs haline gelmesi sadece 6 gün sürdü, bu da laboratuvarımızdaki 13 günlük doğrudan eksplant yönteminden ve Klingbeil ve arkadaşlarının11.9 ± 2.36 günlük 7 enzymatik yönteminden çok daha kısadır. Ayrıca ilginç bir fenomen bulduk, yani epitel hücre kolonileri doğrudan eksplant yönteminde çok katmanlı bir yapıda büyürken, yeni enzymatic yöntem kullanılarak tek tip bir monolayer yapı gözlendi. Açıkçası, daha kalın çok katmanlı koloniler% 80-% 100 birleşin olması için gereken süreyi uzatır. Yeni enzymatic yöntemin hücre çoğalmasını desteklemesinin nedeni, ROCK1 ve ROCK2 inhibitörü olan Y-27632'nin eklenmesidir. Y-27632 başlangıçta insan epitel hücre çoğalması ve farklılaşması üzerindeki olumlu etkileri için 200827yılında bildirilmiştir. Chapman ve ark.28, Y-27632 ile tedavinin keratinositlerin proliferatif kapasitesini büyük ölçüde artırdığını ve tespit edilebilir hücre krizi olmadan verimli ölümsüzleşme ile sonuçlendiğini bildirdi. Önceki çalışmalarımızda, Y-27632'nin yetişkin cilt dokusundan insan primer epidermal hücrelerinin ve keratinositlerin izolasyon prosedürünü basitleştirdiğini keşfettik8,9,10. Strudwick ve ark.29, düşük kalsiyum ile birlikte 10 μM Y-27632 kullanımının, birincil insan keratinositlerinin hücre besleyici tabakası olmadan daha uzun süre kültürlendirilmesine izin verdiğini ve tabakalı bir epitel ayırt etme ve oluşturma yeteneğini koruduğunu bildirdi. Bu çalışmada, Y-27632 kullanan yeni enzimatik yöntem, yaşam sürelerini uzatarak ve proliferatif kapasitelerini teşvik ederek epitel hücrelerinin hasadını büyük ölçüde artırmıştır.
Geleneksel enzymatic yöntem iki sindirim operasyonu içerir. İlk sindirim, epitel dokusunu stromal taraftan çalışan dispaz kullanarak bağ dokusundan ayırmaktır4,5. İkinci sindirim genellikle epitel hücrelerini epitel dokusundan ayırmak için tripsin kullanır4,5. Epitel hücrelerinin tripsin tarafından tahrip edilmesi nedeniyle, enzymatic yöntemin verimliliği etkilenir4. Burada açıklanan yeni enzymatic yöntem, bir sindirim adımını atlayan basitleştirilmiş bir yöntemdir. Yeni ve geleneksel enzmatik yöntemler arasındaki temel farklar, epitel dokuyu bağ dokusundan ayırma protokollerini ifade eder5. Ek olarak, yeni yöntem sindirim adımında tripsin yerine dispaz ve kollajenaz kullanır ve bu nedenle epitel hücrelerinin bütünlüğü iyi korunur. Klinik olarak, insan diş etinden aynı miktarda doku elde etmek cilt ve bukkal mukozadan çok daha zordur. Doğrudan eksplant yöntemi sadece küçük diş eti dokusu parçaları gerektiriyordu ve enzimatik yöntemle karşılaştırıldığında daha fazla sayıda hücre yetiştirdi18. Yeni yöntemi kullanarak az miktarda diş eti epitel dokusunu tedavi ettik ve çok tatmin edici bir hücre yoğunluğu topladık. Bu, yeni yöntemin başlangıçta sağlanacak nispeten büyük miktarda dokuya bağlı olmadığını göstermektedir. Yeni yöntemin olası bir sınırlaması, fibroblastların başlangıç kültüründe (pasaj 0) az miktarda (%<5) kontaminasyon ortaya çıkabilmesidir, ancak önceden bildirildiği gibi% 0.05 tripsin kısa süreli bir tedavi ile kolayca çıkarılabilir9.
Bu çalışmada CK5, CK18 ve Pan-CK (CK14, CK15, CK16 ve CK19) pozitifti (Şekil 3A,C,D). Bu, izole edilmiş diş eti epitel hücrelerinin Orazizadeh ve ark.30 ve Kedjarune ve ark.6'nınçalışmalarıyla tutarlı olan bodrum membran fonksiyonlarını koruyabildiklerini öne sürdü. CK5 ve CK14, epitel bazal tabakada lokalize olan farklılaşmamış hücrelerle ifade edilir. CK19 tipik olarak basit epitellerde ve keratinize edilmemiş tabakalıepitellerde bulunur 31. Yeni enzimatik yöntem kullanılarak elde edilen diş eti epitel hücrelerinin (P3) immünoresans analizi, ki67, p63 ve p75NGFR ekspresyon seviyelerinin doğrudan eksplant yöntemi kullanılarak elde edilen hücrelere göre daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 4). Bu sonuç, yeni yöntemin dişeti epitel hücrelerinin kök hücre özelliklerini koruyabileceğini ve diş eti epitel hücrelerinin çoğalma potansiyelini teşvik ettiğini gösterir. Önceki çalışmamız, Y-27632'nin genişlemeden sonra cilt epidermal kök hücre potansiyelini koruduğunu buldu8. Wang ve arkadaşları, Y-27632'nin insan periodontal ligament kök hücrelerinin çoğalmasını, göçini ve pluripotency'liğini kolaylaştırdığını buldu32.
Özetle, yeni modifiye enzimatik yöntem, insan primer epitel hücrelerini yetişkin diş eti dokusundan izole etmek ve kültüre etmek için basitleştirilmiş ve etkili bir prosedür sağlar. Bu yeni yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır ve kök hücre özelliklerini geliştirir ve bu nedenle birçok parametrede doğrudan explant yöntemine kıyasla bariz avantajlara sahiptir. Bu ileri yöntem, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için çok sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretmek için daha uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma, Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2019ZD36) Anahtar Programı ve Shandong Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2019GSF108107) tarafından X.W.'ye desteklenmiştir; Shandong Eyaleti Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2018GSF118240) J.G.'ye; Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2018WS163) Z.X.'ye ve Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2019WS045) J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
