Summary
在这里，我们提出了一个改进的方法，通过添加岩石抑制剂，Y-27632，以传统的方法隔离和培养人类金吉瓦尔上皮细胞。这种方法更容易，更省时，提高干细胞的特性，并产生更多的高潜力上皮细胞，无论是为实验室和临床应用。
Abstract
牙周组织是保护牙周组织的第一个结构，在许多口腔功能中起着有意义的作用。金银核酸上皮是金银组织的重要结构，特别是在牙周组织的修复和再生中。研究金吉瓦尔上皮细胞的功能具有重要的科学价值，如修复口腔缺陷和检测生物材料的兼容性。由于人类上皮细胞是高度分化的角蛋白细胞，其寿命短，难以通过。到目前为止，只有两种方法可以分离和培养金吉瓦尔上皮细胞，一种是直接的外生方法，另一种是酶。然而，使用直接外生法获得上皮细胞所需的时间较长，酶法的细胞存活率较低。临床上，金银组织采集有限，因此需要一个稳定、高效、简单的 体外 隔离培养系统。我们通过添加Y-27632（一种与Rho相关的激酶（ROCK）抑制剂，改进了传统的酶方法，这种抑制剂可以选择性地促进上皮细胞的生长。我们改良的酶法简化了传统酶方法的步数，提高了上皮细胞的培养效率，比直接除菌法和酶法具有显著优势。
Introduction
人牙石是保护牙周组织的第一道防线结构，它不仅是物理和化学屏障1，而且分泌不同类别的炎症调解员参与免疫反应，构成免疫屏障2、3。金银上皮在牙周组织的修复和再生中起着重要的作用。因此，研究牙周炎的防御和免疫，对于了解牙周炎的发生、诊断和治疗具有重要意义。从人类金银杏组织中分离和培养金吉瓦尔上皮细胞是研究金吉瓦尔上皮的第一步。这种程序需要基本操作，如为组织工程生产种子细胞、牙周相关疾病的体外模型以及修复牙周缺陷的材料。
原发性金银体上皮细胞的特点是体外4的分化率低，几十年来，研究人员一直在寻找最佳的分离和培养方法。迄今为止，实验室中通常使用两种不同的技术，即直接外生法和酶法，在体外获得原发性金吉瓦尔上皮细胞。直接除种方法具有组织标本量低、隔离程序简单等优点，但具有培养时间长、易受污染等优点。虽然酶方法缩短了所需的培养时间，但效率相对较低，并且因使用的酶和介质而异。Kedjarune等人6表明，与酶方法相比，直接外植方法在亚文化（2周）之前需要更多的时间，在培养金吉瓦尔上皮细胞方面似乎更为成功。然而，比较这两种方法，Klingbeil等人发现，这种酶方法对口腔上皮细胞的原发培养效果最好，并且有可能在最短的时间内（11.9天对14.2天）获得最佳细胞产量。
因此，开发一种更方便、更有效的口腔上皮细胞分离与培养方法非常重要。我们之前报告说，添加Y-27632，Rho相关蛋白激酶（ROCK）的抑制剂，简化了人类原发性表皮细胞和角蛋白细胞从成人皮肤组织8，9，10的分离程序。我们开发了G-media，一种新的条件接种介质，自发地将表皮与皮肤细胞分离，支持原发性表皮细胞8、9、10的生长和产量。在本研究中，我们通过将G-中型细胞与Y-27632结合，开发出一种新的无血清分离培养技术。从本质上讲，我们的方法是基于对传统两步酶方法的简化，因此我们比较了新方法和直接外生方法。这种改良的酶方法大大缩短了将金吉瓦尔上皮细胞与金银杏组织分离所需的时间，并提高了培养金吉瓦尔上皮细胞的效率。
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Protocol
根据该学会人类研究伦理委员会的指导方针，本协议中使用的人体组织是从Maxillo面部外科拔出受影响的牙齿中丢弃的新鲜成人金银杏组织。GR201711，日期：02-27-2017）。
1. 准备工作
- 在含有 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 15 mL 管中收集新鲜的成人金银杏组织，辅以 3% 青霉素/链霉素 （P/S），并将组织保持在 4 °C。
注：切除后24小时内将下面的组织详细处理。
2. 准备试剂和文化媒介
- 准备洗涤溶液：3% P/S. 将 50 mL 的 PBS 与 1.5 mL 的青霉素 （100 U/mL） 和 1.5 mL 链霉素 （100 毫克/升） 混合。
- 准备500 mL的生长因子含生长因子介质（称为G-中型）：DMEM/F12（3：1）介质，含1%P/S，2%B27补充剂，20 ng/mL表皮生长因子（EGF），40 ng/mL成纤维细胞生长因子2（FGF2）和40微克/mL真菌酮。
- 为新方法准备酶消化溶液：在 50 mL 的 DMEM 中溶解 125 毫克的脱脂粉和 125 毫克的 I 型拼贴粉。
注意：通过 0.22 μm 过滤器过滤所有酶溶液，并在 4 °C 下存储。 - 准备500 mL的介质中和酶消化：10%的胎儿牛血清（FBS）和1%的P/S在DMEM介质。
3. 直接外植方法
- 金吉瓦尔组织预处理
- 用 5 mL 的 75% 乙醇清洗金银组织 30s 。然后，用 5 mL 的洗涤液（步骤 2.1）冲洗两次，5 分钟。
注：在直径为50毫米的细胞培养皿中进行所有洗涤。
- 用 5 mL 的 75% 乙醇清洗金银组织 30s 。然后，用 5 mL 的洗涤液（步骤 2.1）冲洗两次，5 分钟。
- 金吉瓦尔上皮细胞培养
- 将金银组织切成1毫米3 片，撒在100毫米细胞培养皿中。使用精细的尖钳和眼科剪刀进行切割操作。
- 将 G 中等（步骤 2.2）添加到培养皿中。然后，在 37 °C 的 5% CO2 孵化器中孵育培养皿。 使用倒置显微镜（40倍）每24小时检查一次组织。
- 当上皮细胞在组织片周围传播到直径为 2-5 mm 时，取出金银杏组织片。每 2-4 天更改一次 G-中型。
4. 新的改性酶方法
- 金吉瓦尔组织预处理
- 为此，请遵循与描述的直接除植物方法相同的步骤，步骤 3.1.1。
- 金银组织消化
- 用两个消毒刀片将金银组织切成小块，大小约为<1毫米。用两个手术刀片重复粉碎过程。
- 将 1 mL 2.5 毫克/mL 脱脂 ® 拼贴剂溶液添加到包含金银组织碎片的 1.5 mL 离心机管中，然后在 37 °C 的孵化器中孵育管 15-20 分钟。
- 当组织变得透明和絮落时，加入1 mL的中和溶液来终止消化。通过上下管道 10-15 次彻底混合溶液。通过 100 μm 网状过滤器传递解决方案。
- 离心机在 200 x g 5 分钟。
- 取出超高颗粒，在含有生长因子的介质（步骤 2.2）的 10 mL 中将细胞颗粒重新悬浮在底部。将细胞悬浮转移到 100 mm 细胞培养盘中。在细胞培养皿中加入 10 μM Y-27632。
- 在 5% CO2 孵化器中培养 37 °C 的细胞。每 2 天用新鲜的 G 媒体替换旧的 G 媒体。在第 1 天和第 3 天观察细胞。
5. 细胞传递
- 将盘子从孵化器中取出，取出用过的介质，用 PBS 洗两次。每100毫米菜加入2mL的0.05%试用素。
注意：摇动盘，以确保 Trypsin 溶液和菜底之间有足够的接触。 - 将盘子放在孵化器中约 5 分钟，在 37 °C 处进行消化过程。
- 使用显微镜 （40x） 检查细胞，并确保大多数细胞与盘底分离。
- 加入2mL的中和溶液，以阻止消化，并将细胞转移到15mL管中。派佩特上下 10 - 15 次。将细胞以 200 x g 为离心，5 分钟。
- 慢慢取出超高超。用10mL的G-中等重用细胞，并计算细胞数量。
- 在 10 mL的 G 中型和 10 μM Y-27632 中加入约 1 x 10 6 个细胞到每个 100 mm 盘中。
- 每 2 天更新一次 G 中型和 Y-27632。查看第 1 天和第 5 天的单元格。
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Representative Results
图1 显示了直接外分法和改性酶法的示意图。在整个过程中，直接外生方法不需要任何消化酶。相比之下，传统的酶方法通常需要两套消化酶，脱口而出和拼贴，将上皮板从底层成纤维细胞层分离，然后尝试将上皮细胞释放到悬浮中。我们的新方法省略了分离的步骤，是一种简化的酶方法。此外，在G-中型中加入Y-27632可有效促进上皮细胞生长。直接外植方法通常需要大约2周的时间，使金吉瓦尔上皮细胞生长到足以通过，很容易被污染。然而，新方法获得的金吉瓦尔上皮细胞数量明显大于直接外植方法获得的金吉瓦尔上皮细胞数量，平均只需8天就可满足通气要求。
图1：直接外植方法与新方法的比较。 （A） 计划显示直接外植方法的过程。金银组织片被放置在培养皿中。上皮细胞在G-中培养，从组织块中生长出来。直接外分法通常需要大约13天，上皮细胞达到80%的汇合。（B） 显示新酶方法过程的计划。银屑组织片段通过脱面和拼贴剂I消化，之后细胞颗粒以Y-27632在G-中型培养。新的酶方法通常需要大约6天才能达到80%的汇合，适合通过。 请单击此处查看此图的较大版本。
在第三天和第七天，在显微镜中观察到由直接外植法和新方法制备的成人金吉瓦尔上皮细胞（图2A）。可以看到，新方法在第三天和第七天显著提高了金吉瓦尔上皮细胞的产量。新方法和直接外植方法获得的金吉瓦尔上皮细胞的生长曲线在不同时间点（1d、2d、3d、4d、5d、6d）使用细胞计数套件（CCK-8）测量。使用新方法制备的细胞加倍时间约为1-2天，但使用直接外植方法制备的细胞加倍时间约为5-6天。这两种方法的细胞产量在第七天（图2C）计算，结果表明，新方法产生的细胞数量（9×106）比直接外植法（3×106）产生的细胞数量高出3倍多。图2D显示，与直接外植方法（13天）相比，新方法（6天）大约需要一半的时间才能达到80%的汇合。
图2：新的酶方法增加了原发性金吉瓦尔上皮细胞的产生。（A） 在初始接种后的第三天和第七天由直接外分法（下排）和新的酶方法（上排）制备的金吉瓦尔上皮细胞图像。比例杆 = 200 μm.（B）由直接方法培养的金吉瓦尔上皮细胞和新的酶方法在第 1 天、第 2 天、第 3 天、第 4 天、第 5 天和第 6 天收集，并使用 CCK-8 套件分析金吉瓦尔上皮细胞的数量。（C） 经过7天的培养，金吉瓦尔上皮细胞被丁丙辛分离并收集。使用细胞计数板来确定由这两种方法单独制备的金吉瓦尔上皮细胞的数量。细胞的数量是根据两种方法计算的，这两种方法分别重复了三次，结果表示为每100毫米盘的平均细胞数。（D） 通过新的酶方法和直接外植方法，比较初级金吉瓦尔上皮细胞（通道0）平均汇合率达到80%的时间。B、C 和 D：使用学生的 t测试;错误条显示标准偏差;n = 4;**p < 0.01， *p < 0.05 比较新的酶方法与直接除植物方法.请单击此处查看此图的较大版本。
新方法获得的金吉瓦尔上皮细胞（第3段）的免疫荧光分析表明CK5的表达， CK18 和泛 CK （CK14、CK15、CK16 和 CK19） 为正 （图 3A、C、D）11、12、13、14、15，而 CK10 和维他汀的表达为低（图3B，E）11、16。CK5 和泛 CK（CK14、CK15、CK16 和 CK19）主要在上皮细胞的基底层中定位，这是它们高分化潜力 11、14、15 的标志。CK10 是差异化上皮11的标记，维他汀是金银纤维细胞16的标记。新方法分离的金吉瓦尔上皮细胞的角蛋白阳性率较高，特别是CK5、CK18和泛CK（图3A、C、D），表明分离的金吉瓦尔上皮细胞可以保持良好的基底膜功能。分化标记CK10（图3B）的低表达表明，金吉瓦尔上皮细胞具有很高的分化潜力。体外培养表明，新方法分离的金吉瓦尔上皮细胞可以培养成第八代，而维他素的低表达表明金吉瓦尔上皮细胞具有高纯度，没有金吉瓦尔成纤维细胞污染它们，隔离效率高（图3E）。
图3：新酶方法制备的金吉瓦尔上皮细胞（P3）的特定标记。（A-E）显示CK5（红色）、CK10（红色）、CK18（红色）、泛CK（红色）和维他汀（红色）阳性细胞，DAPI（蓝色）用于染色核。（A-C） 秤杆 = 100μm;（D） 和（E） 秤条 = 50μm;实验独立重复了四次。（A）、（C）和（D）在金吉瓦尔上皮细胞中显示CK5、CK18和泛ck（CK14、15、16和19）的阳性表达，而（B）和（E）则显示金吉瓦尔上皮细胞中CK10和维他汀的低表达。请单击此处查看此图的较大版本。
新方法增加了基67、p63和p75NGFR（低亲和神经生长因子受体p75）在原发性金吉瓦尔上皮细胞中的表达。通道3细胞被选作免疫荧光分析，结果表明ki67、p63和p75NGFR的阳性表达高于直接外植法获得的金吉瓦尔上皮细胞（图4A、C、E）。新方法中 ki67、p63 和 p75NGFR 的正表达率分别为 80%、98% 和 96%，明显高于直接方法获得的 ki67 （35%）、p63 （40%）和 p75NGFR （47%）（图 4B、D、F）。Ki67、p63 和 p75NGFR 是口腔上皮干细胞17的标记。这些结果表明，采用新方法分离培养的原发性金吉瓦尔上皮细胞含有干细胞群，具有很高的增殖潜力，并保持了金吉瓦尔上皮细胞的干细胞特性。
图4：通过直接外分法和新型酶法获得的金吉瓦尔上皮细胞（P3）的干细胞特性。 （A）、（C）和（E）分别显示通过3（P3）的金吉瓦尔上皮细胞的代表性免疫荧光图像，显示直接外分法和新酶法获得的ki67（红色）、p63（红色）和p75NGFR（红色）阳性细胞。DAPI（蓝色）被用来染色核。比例杆 = 50μm.（B）、（D）和（F） 分别显示由直接外生方法和新酶方法获得的金吉瓦尔上皮细胞 （P3） 中对 ki67 阳性细胞、p63 阳性细胞和 p75NGFR 阳性细胞的定量分析。总共计算了400个细胞来量化每组细胞，并显示了ki67、p63和p75NGFR阳性细胞的平均数量。B、D 和 F：使用学生t测试;错误条显示标准偏差;实验独立重复了四次（n = 4）;**p <0.01，将新的酶方法与直接外植法进行比较。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
牙周组织是维持牙周完整性和健康的关键结构。金吉瓦尔上皮细胞在牙周组织的修复和再生中起着重要作用，可用于科学研究和临床应用及相关领域，包括口腔生物学、药理学、毒理学和口腔粘膜缺乏症18。因此，有必要开发一种稳定而有效的方法来收获口腔上皮细胞19。原发性上皮细胞是一种完全分化的细胞，通道少，寿命短。培育上皮细胞已被证明是比培养成纤维细胞5更复杂。
目前，已发表的文献表明，上皮细胞的分离与培养存在各种协议。然而，两种方法，直接外植法和酶法，是这些协议中最常用的。1910年，卡雷尔和布伦斯首先描述了一种获得金吉瓦尔和布卡上皮细胞的方法，称为直接外植方法20。直接除种方法具有组织标本重量要求低、程序复杂、变异少、参与步骤少等优点，但具有培养时间长、极易受到污染的缺点。1975年，莱因瓦尔德和格林首次报告了使用辐照3T3小鼠成纤维细胞作为支线层的酶法，以培养体外21的口腔上皮细胞。虽然该方法大大提高了角蛋白细胞的产量，但辐照小鼠支线细胞层具有潜在的生物学风险。之后，开发出没有支线细胞22和血清23的培养系统，证明3T3细胞对上皮细胞培养是没有必要的。虽然酶方法需要较少的培养时间，但效率相对较低，并且因酶和使用的介质而异。几个实验室比较了这两种方法，Kedjarune等人观察到直接外植技术比酶法更成功，并发现细胞增殖率较高。Shwetha等人26日得出结论，直接外生方法似乎是一种简单而成功的口服粘膜角细胞分离技术。然而，Klingbeil等人得出的结论是恰恰相反的，即酶方法在寿命长的较短时间内显示出最佳效果。丹尼尔斯等人19日在英国进行的一项调查回顾了人类角膜细胞的分离和细胞培养方法，并报告说，在34个反应实验室中，有21个实验室使用某种变异的酶方法。虽然直接外生法比酶法需要较少的组织，处理步骤更少，但有人提出，酶法更快、更容易管理。因此，有必要开发一种更方便、更有效的口腔上皮细胞分离与培养方法。我们的新方法，一种使用Y-27632的简化酶方法，显著提高了金银杏上皮细胞的产量，缩短了将金银杏上皮细胞与金银杏组织分离所需的时间。
图2A显示，新方法在第三天和第七天显著提高了金吉瓦尔上皮细胞的产量。图2B显示，使用新酶方法制备的细胞加倍时间约为1-2天，但使用直接外植方法大约需要5-6天。使用新酶方法（9 x 106）生产的细胞数量是第七天直接外植方法（3 x 106）的三倍多（图2C）。使用新酶方法制备的细胞需要13天才能变成80%的汇合，这与先前的研究一致，而直接外植方法大约需要2周6、20.25±1.05天18和14.2±2.76天7，细胞在亚文化之前完全结合。然而，这种新酶方法仅用了6天就变成了80%的汇合，这比我们实验室13天的直接外分法和Klingbeil等人的7种酶法11.9±2.36天要短得多。我们还发现了一个有趣的现象，即上皮细胞群落生长在直接外植法中的多层结构中，而使用新的酶法观察到均匀的单层结构。显然，较厚的多层菌落延长了成为80%-100%汇流所需的时间。这种新酶方法促进细胞增殖的原因是增加了Y-27632，这是ROCK1和ROCK2的抑制剂。Y-27632最初报告其积极影响人类上皮细胞增殖和分化在2008年27日。查普曼等人28日报告说，Y-27632的治疗大大提高了角蛋白细胞的增殖能力，并导致在没有可检测细胞危机的情况下有效永生。在之前的研究中，我们发现Y-27632简化了人类原发性表皮细胞和角蛋白细胞从成人皮肤组织8，9，10的分离程序。斯特鲁德威克等人29日报告说，使用10μM Y-27632和低钙，可以培养出没有细胞支线层的原发性人类角膜细胞，同时保持分层表皮的能力。在这项研究中，使用Y-27632的新酶方法通过延长上皮细胞的寿命和提高其增殖能力，大大提高了上皮细胞的收获。
传统的酶方法包含两种消化操作。第一个消化是使用脱发将上皮组织与结缔组织分离，后者从频闪侧4，5工作。第二次消化通常使用试金鱼将上皮细胞与上皮组织4，5分离。由于上皮细胞被试金鱼破坏，酶法的效率受到影响4。这里描述的新酶方法是一种简化的方法，省略了一个消化步骤。新酶方法与传统酶方法的主要区别是指上皮组织与结缔组织分离的程序。此外，新方法在消化步骤中使用脱口和拼贴酶代替试蛋白，因此上皮细胞的完整性得到很好的保护。临床上，从人类银杏中获取相同数量的组织比从皮肤和布卡粘膜中获取相同数量的组织要困难得多。与酶法18相比，直接外植法只需要少量的金银杏组织，并培养出更多的细胞。我们用新方法治疗了少量的金吉瓦尔上皮组织，收获了非常令人满意的细胞密度。这表明，新方法并不依赖于最初提供的相对大量的组织。新方法的一个可能限制是，在初始培养物（通道 0）时可能会出现少量（<5%） 的成纤维细胞污染，但通过对9号之前报告的 0.05% 试金素的短期处理，可以很容易地去除。
在这项研究中，CK5、CK18和泛CK（CK14、CK15、CK16和CK19）为正（图3A、C、D）。这表明，孤立的金吉瓦尔上皮细胞能够维持其地下室膜功能，这与奥拉齐扎德等人和凯贾鲁内等人的研究是一致的。CK5 和 CK14 由上皮基层中局部化的未分化细胞表示。CK19通常存在于简单的上皮和非角化分层表皮31中。使用新酶法获得的金银体上皮细胞（P3）免疫荧光分析表明，ki67、p63和p75NGFR的表达水平高于使用直接外分法获得的细胞（图4）。结果表明，新方法能保持金银核上皮细胞的干细胞特性，提高金吉瓦尔上皮细胞的增殖潜力。我们先前的研究发现，Y-27632在扩张8后保持了皮肤表皮干细胞的潜力。王等人发现Y-27632有助于人类牙周韧带干细胞的增殖、迁移和多能性。
总之，新的改性酶方法提供了一个简化和有效的程序，将人类原发性上皮细胞与成人金银杏组织分离并培养。这种新方法比较简单，时间更短，具有增强干细胞特性，因此与许多参数的直接外植方法相比具有明显的优势。这种先进的方法更适合生产大量的高潜力上皮细胞，既适合实验室，也适合临床应用。
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Disclosures
所有作者都声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了山东省自然科学基金重点项目（ZR2019ZD36）和山东省重点研究发展计划（2019GSF108107）的支持。山东省重点研发计划（2018GSF118240）向J.G.：山东省医疗卫生科技发展项目（2018WS163）至Z.X.，山东省医疗卫生科技发展项目（2019WS045）至J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
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