Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בידוד ותרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים ראשוניים באמצעות Y-27632

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62978
Automatic Translation
1,2,3, 4, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2,5, 1
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

Summary

כאן אנו מציגים שיטה מותאמת לבידוד ולתרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים על ידי הוספת מעכב הסלע, Y-27632, לשיטה המסורתית. שיטה זו קלה יותר, גוזלת פחות זמן, משפרת את תכונות תאי הגזע ומייצרת מספר גדול יותר של תאי אפיתל בעלי פוטנציאל גבוה הן עבור המעבדה והן עבור יישומים קליניים.

Abstract

רקמת החניכיים היא המבנה הראשון המגן על רקמות חניכיים וממלא תפקידים משמעותיים בתפקודים אוראליים רבים. אפיתל חניכיים הוא מבנה חשוב של רקמת חניכיים, במיוחד בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים. לחקר הפונקציות של תאי אפיתל חניכיים יש ערך מדעי מכריע, כגון תיקון פגמים אוראליים וזיהוי התאימות של ביו-חומרים. מכיוון שתאי אפיתל חניכים אנושיים הם תאים קרטין מובחנים מאוד, תוחלת החיים שלהם קצרה, וקשה לעבור. עד כה, יש רק שתי דרכים לבודד לתרבות תאי אפיתל חניכיים, שיטת explant ישירה ושיטה אנזימטית. עם זאת, הזמן הנדרש כדי להשיג תאי אפיתל באמצעות שיטת explant ישיר הוא ארוך יותר, ואת שיעור ההישרדות התא של השיטה אנזימטית נמוך יותר. מבחינה קלינית, רכישת רקמת חניך מוגבלת, ולכן יש צורך בבידוד ומערכת תרבות יציבה, יעילה ופשוטה. שיפרנו את השיטה האנזימטית המסורתית על ידי הוספת Y-27632, מעכב קינאז הקשור לרו (ROCK), אשר יכול לקדם באופן סלקטיבי את הצמיחה של תאי אפיתל. השיטה האנזימטית המותאמת שלנו מפשטת את צעדי השיטה האנזימטית המסורתית ומגבירה את היעילות של תאי אפיתל פולחניים פולחניים, שיש לה יתרונות משמעותיים על פני שיטת ההסבר הישיר והשיטה האנזימטית.

Introduction

הגינגיבה האנושית, מבנה ההגנה הקו הראשון המגן על רקמת חניכיים, הוא לא רקמחסוםפיזי וכימי 1 , אלא גם מפריש סוגים שונים של מתווכים דלקתיים המשתתפים בתגובות חיסוניות ומהוויםמחסוםחיסוני 2,3. האפיתל חניכיים ממלא תפקיד חשוב בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים. לכן, לימוד ההגנה והחסינות של האפיתל חניכיים הוא בעל משמעות רבה להבנת התרחשות, אבחון וטיפול של חניכיים. הבידוד והתרבות של תאי אפיתל חניך מרקמת חניך אנושית הוא הצעד הראשון הנדרש לחקר האפיתל חניך. הליך כזה דורש פעולות בסיסיות כגון ייצור תאי זרעים להנדסת רקמות, מודלים במבחנה של מחלות חניכיים, וחומרים לתיקון פגמים חניכיים.

תאי אפיתל חניכים ראשוניים מאופיינים בשיעור חלוקה נמוך במבחנה4 , חוקרים מחפשים שיטת בידוד וטיפוח אופטימלית במשךעשרותשנים. עד כה, שתי טכניקות שונות, שיטת explant ישירה ושיטה אנזימטית, משמשים בדרך כלל במעבדות כדי להשיג תאי אפיתל חניכיים ראשוניים במבחנה4,5. לשיטת explant ישיר יש יתרונות כגון הדרישה של כמות נמוכה יותר של דגימות רקמה והליך בידוד פשוט, אבל יש לו את החסרונות של זמן תרבות ארוך יותר ורגישות לזיהום5. למרות שהשיטה האנזימטית מקצרת את זמן התרבות הנדרש, היעילות נמוכה יחסית ומשתנה בהתאם לאנזימים ובינוני המשמש. Kedjarune ואח' 6 הראה כי שיטת explant ישיר, אשר דורש יותר זמן לפני תת תרבות (2 שבועות), נראה מוצלח יותר עבור כת תאי אפיתל חניכיים לעומת השיטה אנזימטית. עם זאת, בהשוואה לשתי שיטות אלה, Klingbeil ואח'7 מצא כי השיטה אנזימטית היו התוצאות הטובות ביותר עבור תרביות ראשוניות של תאי אפיתל אוראלי, וניתן היה להשיג את תפוקת התא האופטימלי בתוך פרק הזמן הקצר ביותר (11.9 ימים לעומת 14.2 ימים).

לכן, היה חשוב לפתח שיטה נוחה ויעילה יותר לבידוד ותרבות של תאי אפיתל אוראלי4. דיווחנו בעבר כי הוספת Y-27632, מעכב של קינאז חלבון הקשורים Rho (ROCK), מפשט את הליך הבידוד של תאי אפידרמיס ראשוניים אנושיים וקרטינוציטים מרקמות עור בוגרות8,9,10. פיתחנו G-medium, מדיום חיסון מותנה חדש המפריד באופן ספונטני אפידרמיס מתאי עור ותומך בצמיחה ובתשואה של תאי אפידרמיס ראשוניים8,9,10. במחקר הנוכחי, פיתחנו טכניקת בידוד ותרבות חדשה ללא סרום לתאי אפיתל חניך על ידי שילוב G-medium עם Y-27632. בעיקרו של דבר, השיטה שלנו מבוססת על פישוט של השיטה אנזימטית דו-שלבה המסורתית, ולכן השווינו את השיטה החדשה שלנו עם שיטת explant ישיר. שיטה אנזימטית שונה זו מקצרת באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להפריד תאי אפיתל חניכים מרקמת חניך ומגבירה את היעילות של תאי אפיתל חניך פולחני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

רקמות אנושיות המשמשות בפרוטוקול זה הן רקמות חניך בוגרות טריות שהושלכו מיצוי שיניים מושפעות במחלקה לכירורגיה מקסילופסיאלית על פי הנחיות ועדת האתיקה למחקר אנושי של המכון (פרוטוקול מס '. GR201711, תאריך: 02-27-2017).

1. הכנות

  1. לאסוף רקמות חניכיים למבוגרים טריים ב 15 mL צינורות המכילים 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) בתוספת 3% פניצילין / סטרפטומיצין (P/S) ולשמור על הרקמות ב 4 °C (5 °F).
    הערה: התייחסו לרקמות כמפורט להלן תוך 24 שעות לאחר כריתה.

2. הכן ריאגנטים ומדיום תרבות

  1. הכן את פתרון הכביסה: 3% P/S. לערבב 50 מ"ל של PBS עם 1.5 מ"ל של פניצילין (100 U/ML) ו 1.5 מ"ל של סטרפטומיצין (100 מ"ג / ליטר).
  2. הכן 500 מ"ל של מדיום המכיל גורם גדילה (הנקרא G-medium): DMEM/F12 (3:1) בינוני המכיל 1% P/S, תוספת B27 2%, 20 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה אפידרמיסי (EGF), 40 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה פיברובלסט 2 (FGF2), ו 40 מיקרוגרם /mL של fungizone.
  3. הכן פתרונות לעיכול אנזימים לשיטה החדשה: יש להמיס 125 מ"ג אבקת Dispase ו-125 מ"ג אבקת קולגנאז מסוג I ב-50 מ"ל של DMEM.
    הערה: לסנן את כל פתרונות האנזים באמצעות מסננת 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 °C (70 °F).
  4. הכן 500 מ"ל של המדיום כדי לנטרל את העיכול אנזימטי: 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% P /S במדיום DMEM.

3. שיטת הסבר ישירה

  1. טיפול מקדים ברקמת חניכיים
    1. לשטוף רקמת חניך עם 5 מ"ל של 75% אתנול עבור 30 s. לאחר מכן, יש לשטוף פעמיים עם 5 מ"ל של תמיסת הכביסה (שלב 2.1) למשך 5 דקות.
      הערה: בצע את כל הכביסות בצלחות תרבית התא עם קוטר של 50 מ"מ.
  2. תרבית תאי אפיתל חניך
    1. חותכים את רקמת חניך ל 1 מ"מ3 חתיכות ולפזר אותם בצלחת תרבית תאים 100 מ"מ. השתמש מלקחיים מחודדים עדינים ומספריים עיניים לפעולות חיתוך.
    2. מוסיפים את ה-G-medium (שלב 2.2) למנת התרבות. לאחר מכן, לדגור על צלחת התרבות באינקובטור5% CO 2 ב 37 °C (5 °F). השתמש במיקרוסקופ הפוך (40x) כדי לבחון את הרקמות כל 24 שעות.
    3. הסר את חתיכות רקמת חניך כאשר תאי האפיתל הופצו לקוטר 2-5 מ"מ סביב חתיכות הרקמה. לשנות את G-בינוני כל 2-4 ימים.

4. השיטה האנזימטית החדשה שהשתנתה

  1. טיפול מקדים ברקמת חניכיים
    1. עבור זאת, בצע את אותם שלבים כמתואר עבור שיטת explant ישיר, שלב 3.1.1.
  2. עיכול רקמת חניך
    1. חותכים את רקמת חניך לחתיכות זעירות, בגודל של כ -<1 מ"מ, עם שני להבים מעוקרים. חזור על תהליך הגריסה עם שני להבים כירורגיים.
    2. הוסף 1 מ"ל של 2.5 מ"ג / מ"ל dispase + פתרון collagenase לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל את חתיכות רקמת חניך, ולאחר מכן לדגור על הצינור במשך 15-20 דקות באינקובטור ב 37 °C (5 °F).
    3. כאשר הרקמה הופכת שקופה ו flocculent, להוסיף 1 מ"ל של פתרון נטרול כדי לסיים את העיכול. מערבבים היטב את הפתרון על ידי צנרת למעלה ולמטה 10-15 פעמים. להעביר את הפתרון דרך מסנן רשת 100 מיקרומטר.
    4. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות.
    5. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה התא בתחתית 10 מ"ל של מדיום המכיל גורם צמיחה (שלב 2.2). העבר את ההשעיה התאית לצלחת תרבית תאים 100 מ"מ. הוסף 10 מיקרומטר של Y-27632 לצלחת תרבית התא.
    6. תרבית התאים ב 37 °C בחממה5% CO 2. החליפו את הג'י-מדיום הישן בג'י-מדיום הטרי כל יומיים. שימו לב לתאים ביום הראשון וביום השלישי.

5. העברת תאים

  1. מוציאים את המנה מהאינקובטור, מוציאים את המדיום המושקע ושוטפים פעמיים עם PBS. יש להוסיף 2 מ"ל של טריפסין 0.05% לכל מנה של 100 מ"מ.
    הערה: לנער את המנה כדי לוודא שיש מספיק מגע בין פתרון טריפסין לתחתית המנה.
  2. השאירו את המנה באינקובטור סביב 5 דקות ב 37 °C (37 °F) לתהליך העיכול.
  3. השתמש במיקרוסקופ (40x) כדי לבחון את התאים ולוודא שרוב התאים נפרדו מתחתית המנה.
  4. הוסף 2 מ"ל של פתרון הנטרול כדי לעצור את העיכול ולהעביר את התאים לתוך צינור 15 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה 10-15 פעמים. צנטריפוגות התאים ב 200 x g במשך 5 דקות.
  5. הסר את supernatant לאט. תגדיל מחדש את התאים עם 10 מ"ל של G-medium וספור את מספר התאים.
  6. הוסף כ 1 x 106 תאים ב 10 מ"ל של G-בינוני ו 10 ΜM Y-27632 לכל צלחת 100 מ"מ.
  7. לחדש את G-medium ו- Y-27632 כל יומיים. הצג את התאים ביום הראשון וביום החמישי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג תרשים סכמטי של שיטת ההסבר הישירה ושל השיטה האנזימטית שהשתנתה. שיטת explant ישיר אינו צריך שום אנזים עיכול במהלך כל התהליך. לעומת זאת, השיטה אנזימטית המסורתית בדרך כלל צריך שני סטים של אנזימי עיכול, dispase ו collagenase, כדי להפריד את גיליון האפיתל מן השכבה פיברובלסט הבסיסית, ולאחר מכן trypsin לשחרר את תאי האפיתל לתוך השעיה. השיטה החדשה שלנו משמיטה את שלב ההפרדה והיא שיטה אנזימטית פשוטה. יתר על כן, הוספת Y-27632 ל- G-בינוני מקדמת ביעילות צמיחת תאי אפיתל. שיטת explant ישירה בדרך כלל לוקח כ 2 שבועות עבור תאי אפיתל חניכיים לגדול מספיק כדי לעבור והוא מזוהם בקלות. עם זאת, מספר תאי האפיתל חניכיים המתקבלים על ידי השיטה החדשה גדול משמעותית מזה המתקבל בשיטת explant הישירה ולוקח רק 8 ימים בממוצע כדי לעמוד בדרישות המעבר.

Figure 1
איור 1: השוואת שיטת ההסבר הישירה והשיטה החדשה. (A) ערכה המציגה את תהליך שיטת ההסבר הישיר. חתיכות רקמת חניך ממוקמות בצלחת תרבות. תאי האפיתל מתורבתים ב-G-medium וגדלים מתוך חתיכות הרקמה. שיטת explant ישיר בדרך כלל לוקח בערך 13 ימים עבור תאי האפיתל להגיע 80% מפגש. (ב)ערכה המציגה את תהליך השיטה האנזימטית החדשה. שברי רקמת חניכים מתעכלים על ידי dispase ו collagenase I, ולאחר מכן כדורי התא הם תרבית G-medium עם Y-27632. השיטה אנזימטית החדשה לוקחת בדרך כלל כ -6 ימים להגיע למפגש של 80% המתאים למעבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תאי אפיתל חניכיים בוגרים שהוכנו בשיטת ההסברה הישירה ועל ידי השיטה החדשה נצפו במיקרוסקופ בימים השלישי והשביעי(איור 2A). ניתן לראות כי השיטה החדשה הגדילה באופן משמעותי את הייצור של תאי אפיתל חניך בימים השלישי והשביעי. עקומות הצמיחה של תאי אפיתל חניכיים שהושגו בשיטה החדשה ובשיטת explant הישיר נמדדו באמצעות ערכת ספירת תאים (CCK-8) בנקודות זמן שונות (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d)(איור 2B). זמן ההכפלה של התאים שהוכנו בשיטה החדשה היה כ-1-2 ימים, אך זמן ההכפלה של התאים שהוכנו בשיטת ההסברה הישירה היה כ-5-6 ימים. תפוקות התאים על ידי שתי השיטות חושבו ביום השביעי (איור 2C) והראו כי מספר התאים המיוצרים בשיטה החדשה (9 x 106) היה גבוה פי שלושה ממספר התאים המיוצרים בשיטת explant הישירה (3 x 106). איור 2D מראה שלקח בערך מחצית מהזמן לשיטה החדשה (6 ימים) להשיג מפגש של 80% בהשוואה לשיטת ההרחבה הישירה (13 ימים).

Figure 2
איור 2: השיטה אנזימטית החדשה מגבירה את הייצור של תאי אפיתל חניכים ראשוניים. (A)תמונות של תאי אפיתל חניכיים שהוכנו על ידי שיטת explant ישירה (שורה תחתונה) ואת השיטה אנזימטית החדשה (שורה עליונה) ביום השלישי והשביעי לאחר החיסון הראשוני. מוטות קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B)תאי אפיתל חניכים בתרבית בשיטה הישירה והשיטה אנזימטית החדשה נאספו בימים 1, 2, 3, 4, 5 ו - 6, ומספר תאי האפיתל החניקיים נותח באמצעות ערכת CCK-8. (ג)לאחר 7 ימים של תרבות, תאי אפיתל חניך נותקו על ידי טריפסין ונאספו. לוח ספירת תאים שימש כדי לקבוע את מספר תאי האפיתל חניכים שהוכנו בנפרד על ידי שתי השיטות. מספר התאים חושב משתי השיטות, שחזרו על עצמן שלוש פעמים בנפרד, והתוצאות מתבטאות כמספר התאים הממוצע לצלחת של 100 מ"מ. (D)הזמן הממוצע להגיע ל-80% מפגש של תאי אפיתל חניכיים ראשוניים (מעבר 0) שהוכנו בשיטה אנזימטית החדשה ובשיטת ההסבר הישיר מושווה. B, C ו- D: נעשה שימוש במבחן tשל התלמיד; קווי השגיאה מציגים את סטיית התקן; n = 4; **p < 0.01, *p < 0.05 בעת השוואת השיטה אנזימטית החדשה עם שיטת explant ישיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח אימונופלואורסצנטיות של תאי אפיתל חניכים (במעבר 3) שהתקבל בשיטה החדשה הראה כי הביטוי של CK5, CK18, ו- Pan-CK (CK14, CK15, CK16 ו- CK19) היה חיובי (איור 3A, C, D)11,12,13,14,15, בעוד הביטוי של CK10 ו vimentin היה נמוך ( איור3B,E)11,16. CK5 ו- Pan-CK (CK14, CK15, CK16 ו- CK19) היו מקומיים בעיקר בשכבה בזאלית של תאי האפיתל, המהווה סימן לפוטנציאל הבידול הגבוה שלהם11,14,15. CK10 הוא סמן של אפיתל מובחן11, וימנטין הוא סמן של פיברובלסטים חניכים16. שיעור החיוביות של קרטין של תאי אפיתל חניכים מבודדים על ידי השיטה החדשה היה גבוה יותר, במיוחד CK5, CK18, ו Pan-CK (איור 3A,C,D),אשר הצביעו על כך שתאי האפיתל המבודדים של חניכים יכולים לשמור על תפקוד קרום מרתף טוב. הביטוי הנמוך של סמן הבידול CK10 (איור 3B) הצביע על כך שלתאי האפיתל של חניכים יש פוטנציאל בידול גבוה. תרביות במבחנה הראו כי תאי האפיתל הגחונים המבודדים בשיטה החדשה יכולים להיות מתורבתים לדור השמיני, והביטוי הנמוך של vimentin הצביע על כך שלתאי האפיתל של חניכיים יש טוהר גבוה, שאף פיברובלסטים חניכיים לא זיהם אותם וכי יעילות הבידוד הייתה גבוהה (איור 3E).

Figure 3
איור 3: סמנים ספציפיים של תאי אפיתל חניכים (P3) שהוכנו על ידי השיטה אנזימטית החדשה. (A-E) מראים CK5 (אדום), CK10 (אדום), CK18 (אדום), פאן-CK (אדום) ו vimentin (אדום) תאים חיוביים, DAPI (כחול) שימש להכתמת גרעינים. (A-C) מוטות קנה מידה = 100 מיקרומטר; (D) ו - (E) סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר; הניסוי חזר על עצמו ארבע פעמים באופן עצמאי. (A), (C), ו - (D) מציגים את הביטוי החיובי של CK5, CK18 ו- pan-ck (CK14, 15, 16 ו- 19) בתאי אפיתל חניכים, בעוד (B) ו - (E) מציגים את הביטוי הנמוך של CK10 ו vimentin בתאי אפיתל חניך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

השיטה החדשה הגדילה את הביטוי של ki67, p63 ו- p75NGFR (קולטן גורם גדילה עצבי זיקה נמוכה p75) בתאי אפיתל חניכים ראשוניים. מעבר 3 תאים נבחרו לניתוח אימונופלואורסצנטיות, אשר גילה כי הביטוי החיובי של ki67, p63 ו- p75NGFR היה גבוה יותר מזה של תאי אפיתל חניכיים שהתקבלו בשיטת explant הישירה (איור 4A, C,E). שיעורי הביטוי החיוביים של ki67, p63 ו- p75NGFR היו 80%, 98% ו-96% בשיטה החדשה, בהתאמה, שהיו גבוהים משמעותית מאלה של ki67 (35%), p63 (40%), ו- p75NGFR (47%) שהושגו בשיטה הישירה(איור 4B, D,F). Ki67, p63 ו- p75NGFR הם סמנים של תאי גזע אפיתל אוראלי17. תוצאות אלה הצביעו על כך שתאי האפיתל העיקריים המבודדים והתרביתיים בשיטה החדשה הכילו אוכלוסיות תאי גזע, בעלי פוטנציאל התפשטות גבוה, ושמרה על תכונות תאי הגזע של תאי אפיתל חניכים.

Figure 4
איור 4: מאפייני תאי גזע של תאי אפיתל חניכיים (P3) המתקבלים בשיטת explant הישירה והשיטה האנזימטית החדשה. (A), (C), ו - (E) מציגים תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של תאי אפיתל חניכיים במעבר 3 (P3), בהתאמה, המציגים ki67 (אדום), p63 (אדום) ו- p75NGFR (אדום) תאים חיוביים המתקבלים בשיטת explant הישירה והשיטה האנזימטית החדשה. DAPI (כחול) שימש להכתים גרעינים. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B), (D), ו -( F) מציגים ניתוח כמותי של תאים חיוביים ki67, תאים חיוביים p63 ותאים חיוביים p75NGFR, בהתאמה, בתאי אפיתל חניכיים (P3) המתקבלים בשיטת explant הישירה ועל ידי השיטה אנזימטית החדשה. בסך הכל נספרו 400 תאים כדי לכמת כל קבוצה, והמספרים הממוצעים של תאים חיוביים ki67, p63 ו- p75NGFR מוצגים. B, D ו- F: נעשה שימוש במבחן tשל התלמיד; קווי השגיאה מציגים את סטיית התקן; הניסוי חזר על עצמו ארבע פעמים באופן עצמאי (n = 4); **p < 0.01, בעת השוואת השיטה אנזימטית החדשה עם שיטת explant ישיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רקמת החניכיים היא מבנה מפתח השומר על שלמות ובריאות חניכיים. לתאי אפיתל חניכיים יש תפקידים משמעותיים בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים וניתן להשתמש בהם במחקר מדעי וביישומים קליניים ובתחומים קשורים, כולל ביולוגיה אוראלית, פרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה, וליקויים ברירית הפה18. לכן, יש צורך לפתח שיטה יציבה ויעילה לקצור תאי אפיתל אוראלי19. תאי אפיתל ראשוניים הם סוג של תאים מובחנים לחלוטין עם כמה מעברים ותוחלת חיים קצרה. פולחן תאי אפיתל הוכיח להיות מורכב יותר מאשר פולחן פיברובלסטים5.

כיום, הספרות שפורסמה מראה כי פרוטוקולים שונים קיימים לבידוד ותרבות של תאי אפיתל. עם זאת, שתי שיטות, שיטת ההסבר הישירה והשיטה האנזימטית, הן הנפוצות ביותר בין פרוטוקולים אלה. בשנת 1910, קארל ובורוז תיארו לראשונה שיטה להשגת תאי אפיתל חניכיים ובוקלים הנקראת שיטת הגירושהישירה 20. שיטת explant ישיר יש את היתרונות של דרישות משקל נמוך עבור דגימות רקמות, הליכים פחות מסובכים, פחות וריאציה, ופחות מעורבות בשלבים, אבל יש לו את החסרונות של צורך זמן תרבות ארוכה והוא רגיש מאוד לזיהום5. בשנת 1975, ריינוולד וגרין דיווחו לראשונה על השיטה האנזימטית באמצעות פיברובלסטים מוקרן של עכבר 3T3 כשכבת הזנה לתאי אפיתל אוראליים במבחנה21. למרות ששיטה זו שיפרה מאוד את התשואה של קרטינוציטים, שכבת תא מאכיל העכבר המוקרן היו סיכונים ביולוגיים פוטנציאליים22. לאחר מכן, מערכות תרבית ללא תאי מאכיל22 וללא סרום23,24 פותחו אשר הוכיחו כי תאים 3T3 לא היו נחוצים תרביות תאי אפיתל. למרות שהשיטה אנזימטית דורשת פחות זמן תרבות, היעילות נמוכה יחסית ומשתנה בהתאם לאנזימים ובינוני המשמש25. מספר מעבדות השוו את שתי השיטות ו Kedjarune ואח'6 הבחין בטכניקת explant ישיר להיות מוצלח יותר מאשר השיטה אנזימטית ומצא שיעור גבוה יותר של התפשטות תאים. Shwetha et al.26 הגיע למסקנה כי שיטת explant ישיר נראה טכניקה פשוטה ומוצלחת לבידוד של קרטינוציטים רירית אוראלי. עם זאת, Klingbeil ואח' 7 סיכם בדיוק את ההפך, כלומר, השיטה אנזימטית הראתה את התוצאות הטובות ביותר בפחות זמן עם תוחלת חיים טובה. סקר שנערך בבריטניה על ידי Daniels et al.19 סקר את שיטות הבידוד ותרבות התאים של קרטינוציטים אנושיים ודיווח כי 21 מתוך 34 מעבדות שהגיבו השתמשו בשיטה אנזימטית עם כמה וריאציות. למרות שיטת explant ישיר דורש פחות רקמה ויש לו פחות צעדי טיפול מאשר השיטה אנזימטית, הוצע כי השיטה אנזימטית היא מהירה יותר וקל יותר לנהל6. לכן, היה צורך לפתח שיטה נוחה ויעילה יותר לבידוד ותרבות של תאי אפיתל אוראלי4. השיטה החדשה שלנו, שיטה אנזימטית פשוטה המשתמשת Y-27632 הגדיל באופן משמעותי את הייצור של תאי אפיתל חניכיים וקיצר את הזמן הנדרש כדי להפריד תאי אפיתל חניכיים מרקמת חניכיים.

איור 2A מראה כי השיטה החדשה הגדילה באופן משמעותי את הייצור של תאי אפיתל חניך בימים השלישי והשביעי. איור 2B מראה כי זמן ההכפלה של התאים שהוכנו בשיטה אנזימטית החדשה היה כ-1-2 ימים, אך שימוש בשיטת ההסבר הישירה ארך כ-5-6 ימים. מספר התאים שנוצרו בשיטה אנזימטית החדשה (9 x 106)היה גדול פי שלושה משיטת ההרחבה הישירה (3 x 106)ביום השביעי (איור 2C). תאים שהוכנו בשיטה אנזימטית החדשה לקח 13 ימים להיות 80% מפגש, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, בעוד שיטת explant ישיר לקח בערך 2 שבועות6, 20.25 ± 1.05 ימים18 ו 14.2 ± 2.76 ימים7 עבור התאים להיות עקביים לחלוטין לפני תת תרבות. עם זאת, השיטה אנזימטית החדשה לקח רק 6 ימים כדי להיות 80% confluent, וזה הרבה יותר קצר מאשר שיטת explant ישיר של 13 ימים במעבדה שלנו ואת שיטת7 אנזימטי של 7 של 11.9 ± 2.36 ימים. מצאנו גם תופעה מעניינת, כלומר, מושבות תאי האפיתל גדלו במבנה רב שכבתי בשיטת ההסברה הישירה, בעוד מבנה מונו-שכבתי אחיד נצפה בשיטה אנזימטית החדשה. ברור, מושבות מרובות שכבות עבות להאריך את הזמן הנדרש כדי להיות 80%-100% confluent. הסיבה לכך שהשיטה האנזימטית החדשה מקדמת התפשטות תאים היא התוספת של Y-27632, מעכב של ROCK1 ו- ROCK2. Y-27632 דווח בתחילה על השפעותיו החיוביות על התפשטות תאים אפיתל אנושי ובידול בשנת 200827. צ'פמן ואח '28 דיווחו כי הטיפול ב- Y-27632 הגדיל מאוד את יכולת ההתפשטות של קרטינוציטים והביא להנצחה יעילה ללא משבר תאים ניתן לזיהוי. במחקרים הקודמים שלנו, גילינו כי Y-27632 מפשט את הליך הבידוד של תאי אפידרמיס ראשוניים אנושיים וקרטינוציטים מרקמת עור בוגרת8,9,10. Strudwick ואח '29 דיווחו כי השימוש ב 10 מיקרומטר Y-27632 יחד עם סידן נמוך אפשר קרטינוציטים אנושיים ראשוניים להיות מתורבת ללא שכבת מאכיל תאים לתקופות זמן ארוכות יותר תוך שמירה על היכולת להבדיל וליצור אפיתל רבדים. במחקר זה, השיטה אנזימטית החדשה באמצעות Y-27632 הגדילה מאוד את הקציר של תאי אפיתל על ידי הארכת תוחלת החיים שלהם וקידום יכולת השגשוג שלהם.

השיטה אנזימטית המסורתית מכילה שני ניתוחי עיכול. העיכול הראשון הוא להפריד רקמת אפיתל מרקמת חיבור באמצעות dispase, אשר עובד מהצד סטרומי4,5. העיכול השני בדרך כלל משתמש טריפסין כדי להפריד תאי אפיתל מרקמת אפיתל4,5. בשל הרס של תאי אפיתל על ידי טריפסין, היעילות של השיטה אנזימטית מושפעת4. השיטה האנזימטית החדשה המתוארת כאן היא שיטה פשוטה שמשמיטה צעד עיכול אחד. ההבדלים העיקריים בין השיטות אנזימטיות חדשות ומסורתיות מתייחסים לפרוטוקולים של הפרדת רקמת אפיתל מרקמת חיבור5. בנוסף, השיטה החדשה משתמשת dispase ו collagenase במקום טריפסין בשלב העיכול, ומכאן השלמות של תאי האפיתל מוגנת היטב. מבחינה קלינית, זה הרבה יותר קשה להשיג את אותה כמות של רקמה מן gingiva אנושי מאשר מן העור ואת הרירית buccal. שיטת explant ישיר נדרש רק חתיכות קטנות של רקמת חניכיים וטיפח מספר גדול יותר של תאים בהשוואה לשיטה אנזימטית18. טיפלנו בכמות קטנה של רקמת אפיתל חניך באמצעות השיטה החדשה וקצרנו צפיפות תאים משביעת רצון מאוד. זה מראה כי השיטה החדשה אינה תלויה בכמויות גדולות יחסית של רקמה להיות מסופק בתחילה. מגבלה אפשרית אחת של השיטה החדשה היא כי יכול להופיע כמות קטנה (<5%) זיהום של פיברובלסטים בתרבות הראשונית (מעבר 0), אבל זה יכול להיות מוסר בקלות על ידי טיפול לטווח קצר של 0.05% טריפסין כפי שדווח previsouly9.

במחקר זה, CK5, CK18, ו- Pan-CK (CK14, CK15, CK16 ו- CK19) היו חיוביים(איור 3A, C, D). זה הציע כי תאי אפיתל חניכיים מבודדים הצליחו לשמור על תפקוד קרום המרתף שלהם, אשר עולה בקנה אחד עם המחקרים של Orazizadeh ואח'30 ו Kedjarune ואח'6. CK5 ו CK14 באים לידי ביטוי על ידי תאים לא מורגשים המותאמים לשפות בשכבת האפיתל-בזאלי. CK19 נמצא בדרך כלל באפיתל פשוט ובאפיתל ריבוד לא קרטין31. ניתוח חיסוני של תאי אפיתל חניכיים (P3) שהתקבל בשיטה אנזימטית החדשה הראה כי רמות הביטוי של ki67, p63 ו- p75NGFR היו גבוהות יותר מאשר בתאים שהושגו בשיטת explant הישירה(איור 4). תוצאה זו מצביעה על כך שהשיטה החדשה יכולה לשמור על תכונות תאי הגזע של תאי אפיתל חניכים ומקדמת את פוטנציאל ההתפשטות של תאי אפיתל חניכים. המחקר הקודם שלנו מצא כי Y-27632 שומר על פוטנציאל תאי הגזע האפידרמליים בעור לאחרהרחבה 8. וואנג ואח ' מצא כי Y-27632 מקל על ההתפשטות, ההגירה, ואת pluripotency של רצועה חניכיים אנושית תאי גזע32.

לסיכום, השיטה אנזימטית החדשה שונה מספקת הליך פשוט ויעיל כדי לבודד ולתרבות תאי אפיתל ראשוניים אנושיים מרקמת חניכיים בוגרת. שיטה חדשה זו קלה יותר, גוזלת פחות זמן ומשפרת את תכונות תאי הגזע שלהם, ולכן יש לה יתרונות ברורים בהשוואה לשיטת explant הישירה בפרמטרים רבים. שיטה מתקדמת זו מתאימה יותר לייצור מספר גדול של תאי אפיתל בעלי פוטנציאל גבוה הן למעבדה והן ליישומים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית המרכזית של הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג (ZR2019ZD36) ותוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של מחוז שאנדונג (2019GSF108107) ל- X.W.; תוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של מחוז שאנדונג (2018GSF118240) לג'יי ג'י; פרויקט מדעי הרפואה והבריאות ופיתוח הטכנולוגיה של מחוז שאנדונג (2018WS163) ל- Z.X., ופרויקט מדעי הרפואה והבריאות ופיתוח הטכנולוגיה של מחוז שאנדונג (2019WS045) ל- J.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Names Abbreviations & Comments
Countess automated cell counter Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. BBA0218AC Automatic cell counting
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubation
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50 ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifugation
1.5 ml microcentrifuge Tubes KIRGEN 190691J For cell digestion
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Gingival epithelial  cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HGGEPCs dissociation
Dilution Medium Life Technologies 50-9701 For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HGGEPCs isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HGGEPCs isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Gene Operation IAD1011 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Dojindo Molecular Technologies CK04 For Cell proliferation assay
Rabbit Anti-Human CK18 Abcam ab82254 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 Abcam ab76318 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts
Rabbit Anti-Human pan-ck BD 550951 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-Ki67 Abcam 15580 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p63 Biolegend 619002 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p75NGFR Abcam ab52987 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311 (1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

Tags

ביו-הנדסה בעיה 177 תאי אפיתל חניכיים שיטה אנזימטית שיטת explant ישירה בידוד תאים תרבית תאים Y-27632 מעכב קינאז הקשור לרו ניתוח אימונופלואורסצנטיות
בידוד ותרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים ראשוניים באמצעות Y-27632
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, Z., Shi, J., Zong, M., Xu, Q.,… More

Xie, Z., Shi, J., Zong, M., Xu, Q., Liu, C., Wen, J., Zhang, Q., Liu, P., Liu, G., Guo, J., Wu, X. Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632. J. Vis. Exp. (177), e62978, doi:10.3791/62978 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter