Summary
Qui presentiamo un metodo modificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali umane aggiungendo l'inibitore della roccia, Y-27632, al metodo tradizionale. Questo metodo è più semplice, richiede meno tempo, migliora le proprietà delle cellule staminali e produce un numero maggiore di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per il laboratorio che per le applicazioni cliniche.
Abstract
Il tessuto gengivale è la prima struttura che protegge i tessuti parodontali e svolge ruoli significativi in molte funzioni orali. L'epitelio gengivale è un'importante struttura del tessuto gengivale, specialmente nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale. Studiare le funzioni delle cellule epiteliali gengivali ha un valore scientifico cruciale, come la riparazione dei difetti orali e la rilevazione della compatibilità dei biomateriali. Poiché le cellule epiteliali gengivali umane sono cellule cheratinizzate altamente differenziate, la loro durata è breve e sono difficili da passare. Finora, ci sono solo due modi per isolare e colturare cellule epiteliali gengivali, un metodo di espianto diretto e un metodo enzimatico. Tuttavia, il tempo necessario per ottenere cellule epiteliali utilizzando il metodo di espianto diretto è più lungo e il tasso di sopravvivenza cellulare del metodo enzimatico è inferiore. Clinicamente, l'acquisizione del tessuto gengivale è limitata, quindi è necessario un sistema di isolamento e coltura in vitro stabile, efficiente e semplice. Abbiamo migliorato il metodo enzimatico tradizionale aggiungendo Y-27632, un inibitore della chinasi rho-associata (ROCK), che può promuovere selettivamente la crescita delle cellule epiteliali. Il nostro metodo enzimatico modificato semplifica le fasi del metodo enzimatico tradizionale e aumenta l'efficienza della coltura delle cellule epiteliali, che presenta vantaggi significativi rispetto al metodo di espianto diretto e al metodo enzimatico.
Introduction
La gengiva umana, la struttura di difesa di prima linea che protegge il tessuto parodontale, non è solo una barriera fisica e chimica1, ma secerne anche diverse classi di mediatori infiammatori che partecipano alle risposte immunitarie e costituiscono una barriera immunitaria2,3. L'epitelio gengivale svolge un ruolo importante nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale. Pertanto, studiare la difesa e l'immunità dell'epitelio gengivale è di grande importanza per comprendere l'insorgenza, la diagnosi e il trattamento della parodontite. L'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali dal tessuto gengivale umano è il primo passo necessario per studiare l'epitelio gengivale. Tale procedura richiede operazioni di base come la produzione di cellule di semi per l'ingegneria tissutale, modelli in vitro di malattie associate parodontali e materiali per la riparazione di difetti parodontali.
Le cellule epiteliali gengivali primarie sono caratterizzate da un basso tasso di divisione in vitro4, i ricercatori hanno cercato un metodo di isolamento e coltivazione ottimale per decenni. Ad oggi, due diverse tecniche, un metodo di espianto diretto e un metodo enzimatico, sono comunemente utilizzate nei laboratori per ottenere cellule epiteliali gengivali primarie in vitro4,5. Il metodo di espianto diretto presenta vantaggi come la necessità di una minore quantità di campioni di tessuto e una semplice procedura di isolamento, ma presenta gli svantaggi di un tempo di coltura più lungo e della suscettibilità alla contaminazione5. Sebbene il metodo enzimatico ridavi il tempo di coltura richiesto, l'efficienza è relativamente bassa e varia a seconda degli enzimi e del mezzo utilizzato. Kedjarune et al.6 hanno dimostrato che il metodo di espianto diretto, che richiede più tempo prima della sottocoltura (2 settimane), sembra avere più successo per la coltivazione di cellule epiteliali gengivali rispetto al metodo enzimatico. Tuttavia, confrontando questi due metodi, Klingbeil et al.7 hanno scoperto che il metodo enzimatico aveva i migliori risultati per le colture primarie di cellule epiteliali orali ed era possibile ottenere la resa cellulare ottimale nel più breve periodo di tempo (11,9 giorni contro 14,2 giorni).
Pertanto, era importante sviluppare un metodo più conveniente ed efficace per l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali orali4. Abbiamo precedentemente riportato che l'aggiunta di Y-27632, un inibitore della proteina chinasi rho-associata (ROCK), semplifica la procedura di isolamento delle cellule epidermiche primarie umane e dei cheratinociti dai tessuti cutanei adulti8,9,10. Abbiamo sviluppato G-medium, un nuovo mezzo di inoculazione condizionato che separa spontaneamente le cellule epidermiche da quelle dermiche e supporta la crescita e la resa delle cellule epidermiche primarie8,9,10. Nel presente studio, abbiamo sviluppato una nuova tecnica di isolamento e coltura senza siero per le cellule epiteliali gengivali combinando G-medium con Y-27632. In sostanza, il nostro metodo si basa su una semplificazione del tradizionale metodo enzimatico in due fasi, quindi abbiamo confrontato il nostro nuovo metodo con il metodo dell'espianto diretto. Questo metodo enzimatico modificato riduce significativamente il tempo necessario per separare le cellule epiteliali gengivali dal tessuto gengivale e aumenta l'efficienza della coltura delle cellule epiteliali gengivali.
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Protocol
I tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono tessuti gengivali adulti freschi scartati dalle estrazioni dei denti colpiti nel Dipartimento di Chirurgia Maxillo-Facciale secondo le linee guida del Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Istituzione (Protocollo n. GR201711, Data: 27-02-2017).
1. Preparativi
- Raccogliere tessuti gengivali adulti freschi in provette da 15 mL contenenti 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con penicillina/streptomicina (P/S) al 3% e mantenere i tessuti a 4 °C.
NOTA: Trattare i tessuti come descritto di seguito entro 24 ore dall'escissione.
2. Preparare i reagenti e il terreno di coltura
- Preparare la soluzione di lavaggio: 3% P/S. Mescolare 50 mL di PBS con 1,5 mL di penicillina (100 U/mL) e 1,5 mL di streptomicina (100 mg/L).
- Preparare 500 mL di terreno contenente fattore di crescita (chiamato G-medium): DMEM / F12 (3: 1) mezzo contenente 1% P / S, 2% supplemento B27, 20 ng / mL di fattore di crescita epidermico (EGF), 40 ng / mL di fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) e 40 μg / mL di fungizone.
- Preparare soluzioni di digestione enzimatica per il nuovo metodo: Sciogliere 125 mg di polvere di dispasi e 125 mg di collagenasi di tipo I in polvere in 50 ml di DMEM.
NOTA: Filtrare tutte le soluzioni enzimatiche attraverso un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C. - Preparare 500 ml del mezzo per neutralizzare la digestione enzimatica: 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% P/S nel mezzo DMEM.
3. Metodo di espianto diretto
- Pretrattamento del tessuto gengivale
- Lavare il tessuto gengivale con 5 ml di etanolo al 75% per 30 s. Quindi, risciacquare due volte con 5 ml della soluzione di lavaggio (passaggio 2.1) per 5 minuti.
NOTA: Eseguire tutti i lavaggi in piatti di coltura cellulare con un diametro di 50 mm.
- Lavare il tessuto gengivale con 5 ml di etanolo al 75% per 30 s. Quindi, risciacquare due volte con 5 ml della soluzione di lavaggio (passaggio 2.1) per 5 minuti.
- Coltura cellulare epiteliale gengivale
- Tagliare il tessuto gengivale in 1 mme 3 pezzi e disperderli in un piatto di coltura cellulare da 100 mm. Utilizzare pinza a punta fine e forbici oftalmiche per le operazioni di taglio.
- Aggiungere il G-medium (passaggio 2.2) al piatto di coltura. Quindi, incubare il piatto di coltura in un incubatore a CO2 al 5% a 37 °C. Utilizzare un microscopio invertito (40x) per esaminare i tessuti ogni 24 ore.
- Rimuovere i pezzi di tessuto gengivale quando le cellule epiteliali si sono propagate a un diametro di 2-5 mm attorno ai pezzi di tessuto. Cambiare il G-medium ogni 2-4 giorni.
4. Il nuovo metodo enzimatico modificato
- Pretrattamento del tessuto gengivale
- Per questo, seguire gli stessi passaggi descritti per il metodo di espianto diretto, passaggio 3.1.1.
- Digestione del tessuto gengivale
- Tagliare il tessuto gengivale in piccoli pezzi, di circa <1 mm, con due lame sterilizzate. Ripetere il processo di triturazione con due lame chirurgiche.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di 2,5 mg/mL dispasi + collagenasi in un tubo di centrifuga da 1,5 mL contenente i pezzi di tessuto gengivale, quindi incubare il tubo per 15-20 minuti in un incubatore a 37 °C.
- Quando il tessuto diventa trasparente e flocculante, aggiungere 1 mL della soluzione di neutralizzazione per terminare la digestione. Mescolare accuratamente la soluzione pipettando su e giù 10-15 volte. Passare la soluzione attraverso un filtro a rete da 100 μm.
- Centrifuga a 200 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e risusegnare il pellet cellulare sul fondo in 10 ml di terreno contenente fattore di crescita (fase 2.2). Trasferire la sospensione cellulare in una vasca di coltura cellulare da 100 mm. Aggiungere 10 μM di Y-27632 alla parabola di coltura cellulare.
- Colturare le cellule a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%. Sostituire il vecchio G-medium con il G-medium fresco ogni 2 giorni. Osserva le cellule il giorno 1 e il giorno 3.
5. Passaggio cellulare
- Togliere il piatto dall'incubatrice, rimuovere il mezzo esaurito e lavare due volte con PBS. Aggiungere 2 ml di tripsina dello 0,05% per ogni piatto da 100 mm.
NOTA: Agitare il piatto per assicurarsi che ci sia abbastanza contatto tra la soluzione di tripsina e il fondo del piatto. - Lasciare il piatto in un'incubatrice circa 5 minuti a 37 °C per il processo di digestione.
- Utilizzare un microscopio (40x) per esaminare le cellule e assicurarsi che la maggior parte delle cellule si siano separate dal fondo del piatto.
- Aggiungere 2 mL della soluzione di neutralizzazione per fermare la digestione e trasferire le cellule in un tubo da 15 ml. Pipetta su e giù 10-15 volte. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min.
- Rimuovere lentamente il surnatante. Risuspentare le cellule con 10 ml di G-medium e contare il numero di cellule.
- Aggiungere circa 1 x 106 celle in 10 mL di G-medium e 10 μM Y-27632 a ciascun piatto da 100 mm.
- Rinnovare il G-medium e l'Y-27632 ogni 2 giorni. Visualizza le celle il giorno 1 e il giorno 5.
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Representative Results
La Figura 1 mostra un diagramma schematico del metodo di espianto diretto e del metodo enzimatico modificato. Il metodo di espianto diretto non ha bisogno di alcun enzima digestivo durante l'intero processo. Al contrario, il metodo enzimatico tradizionale di solito ha bisogno di due serie di enzimi digestivi, dispasi e collagenasi, per separare il foglio epiteliale dallo strato di fibroblasti sottostante, e quindi tripsina per rilasciare le cellule epiteliali in sospensione. Il nostro nuovo metodo omette la fase di separazione ed è un metodo enzimatico semplificato. Inoltre, l'aggiunta di Y-27632 al mezzo G promuove efficacemente la crescita delle cellule epiteliali. Il metodo di espianto diretto di solito richiede circa 2 settimane affinché le cellule epiteliali gengivali crescano sufficientemente per passare ed è facilmente contaminato. Tuttavia, il numero di cellule epiteliali gengivali ottenute con il nuovo metodo è significativamente maggiore di quello ottenuto con il metodo dell'espianto diretto e richiede solo una media di 8 giorni per soddisfare i requisiti per il passaging.
Figura 1: Confronto tra il metodo di espianto diretto e il nuovo metodo. (A) Schema che mostra il processo del metodo di espianto diretto. I pezzi di tessuto gengivale sono posti in un piatto di coltura. Le cellule epiteliali vengono coltivate in G-medium e crescono dai pezzi di tessuto. Il metodo di espianto diretto di solito richiede circa 13 giorni affinché le cellule epiteliali raggiungano l'80% di confluenza. (B) Schema che illustra il processo del nuovo metodo enzimatico. I frammenti di tessuto gengivale vengono digeriti dalla dispasi e dalla collagenasi I, dopo di che i pellet cellulari vengono coltivati in G-medium con Y-27632. Il nuovo metodo enzimatico di solito impiega circa 6 giorni per raggiungere l'80% di confluenza che è adatto per il passaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Cellule epiteliali gengivali adulte preparate con il metodo dell'espianto diretto e con il nuovo metodo sono state osservate al microscopio il terzo e il settimo giorno (Figura 2A). Si può vedere che il nuovo metodo ha aumentato significativamente la produzione di cellule epiteliali gengivali al terzo e settimo giorno. Le curve di crescita delle cellule epiteliali gengivali ottenute con il nuovo metodo e con il metodo dell'espianto diretto sono state misurate utilizzando un kit di conteggio delle cellule (CCK-8) in diversi punti temporali (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d) (Figura 2B). Il tempo di raddoppio delle cellule preparate utilizzando il nuovo metodo è stato di circa 1-2 giorni, ma il tempo di raddoppio delle cellule preparate utilizzando il metodo di espianto diretto è stato di circa 5-6 giorni. Le rese cellulari con i due metodi sono state calcolate il settimo giorno (Figura 2C) e hanno mostrato che il numero di cellule prodotte con il nuovo metodo (9 x 106) era più di tre volte superiore al numero di cellule prodotte con il metodo dell'espianto diretto (3 x 106). La figura 2D mostra che ci è voluto circa la metà del tempo perché il nuovo metodo (6 giorni) raggiungesse l'80% di confluenza rispetto al metodo di espianto diretto (13 giorni).
Figura 2: Il nuovo metodo enzimatico aumenta la produzione di cellule epiteliali gengivali primarie. (A) Immagini di cellule epiteliali gengivali preparate con il metodo dell'espianto diretto (riga inferiore) e il nuovo metodo enzimatico (riga superiore) il terzo e il settimo giorno dopo l'inoculazione iniziale. Le barre di scala = 200 μm. (B) Le cellule epiteliali gengivali coltivate con il metodo diretto e il nuovo metodo enzimatico sono state raccolte nei giorni 1, 2, 3, 4, 5 e 6 e il numero di cellule epiteliali gengivali è stato analizzato utilizzando un kit CCK-8. (C) Dopo 7 giorni di coltura, le cellule epiteliali gengivali sono state staccate dalla tripsina e sono state raccolte. Una piastra di conteggio cellulare è stata utilizzata per determinare il numero di cellule epiteliali gengivali preparate separatamente con i due metodi. Il numero di celle è stato calcolato dai due metodi, che sono stati ripetuti tre volte separatamente, e i risultati sono espressi come il numero medio di celle per piatto da 100 mm. (D) Viene confrontato il tempo medio per raggiungere l'80% di confluenza di cellule epiteliali gengivali primarie (passaggio 0) preparato con il nuovo metodo enzimatico e con il metodo dell'espianto diretto. B, C e D: è stato utilizzato il t-testdello studente; le barre di errore mostrano la deviazione standard; n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 quando si confronta il nuovo metodo enzimatico con il metodo dell'espianto diretto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'analisi di immunofluorescenza delle cellule epiteliali gengivali (al passaggio 3) ottenuta con il nuovo metodo ha mostrato che l'espressione di CK5, CK18 e Pan-CK (CK14, CK15, CK16 e CK19) era positiva (Figura 3A, C, D)11,12,13,14,15, mentre l'espressione di CK10 e vimentina era bassa ( Figura3B,E)11,16. CK5 e Pan-CK (CK14, CK15, CK16 e CK19) erano principalmente localizzati nello strato basale delle cellule epiteliali, che è un segno del loro alto potenziale di differenziazione11,14,15. CK10 è un marcatore dell'epitelio differenziato11e la vimentina è un marcatore dei fibroblasti gengivali16. Il tasso di cheratina positiva delle cellule epiteliali gengivali isolate con il nuovo metodo era più alto, in particolare CK5, CK18 e Pan-CK(Figura 3A,C, D),che indicavano che le cellule epiteliali gengivali isolate potevano mantenere una buona funzione della membrana basale. La bassa espressione del marcatore di differenziazione CK10 (Figura 3B) ha indicato che le cellule epiteliali gengivali avevano un elevato potenziale di differenziazione. Le colture in vitro hanno mostrato che le cellule epiteliali gengivali isolate con il nuovo metodo potevano essere coltivate fino all'ottava generazione e la bassa espressione di vimentina indicava che le cellule epiteliali gengivali avevano un'elevata purezza, che nessun fibroblasto gengivale le contaminava e che l'efficienza di isolamento era elevata (Figura 3E).
Figura 3: Marcatori specifici di cellule epiteliali gengivali (P3) preparati con il nuovo metodo enzimatico. (A-E) mostrano CK5 (rosso), CK10 (rosso), CK18 (rosso), Pan-CK (rosso) e cellule positive alla vimentina (rossa), DAPI (blu) è stato usato per colorare i nuclei. (A-C) barre di scala = 100 μm; (D) e (E) barre di scala = 50 μm; l'esperimento è stato ripetuto quattro volte in modo indipendente. (A), (C) e (D) mostrano l'espressione positiva di CK5, CK18 e pan-ck (CK14, 15, 16 e 19) nelle cellule epiteliali gengivali, mentre (B) ed (E) mostrano la bassa espressione di CK10 e vimentina nelle cellule epiteliali gengivali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il nuovo metodo ha aumentato l'espressione di ki67, p63 e p75NGFR (recettore del fattore di crescita nervoso a bassa affinità p75) nelle cellule epiteliali gengivali primarie. Le cellule del passaggio 3 sono state selezionate per l'analisi di immunofluorescenza, che ha rivelato che l'espressione positiva di ki67, p63 e p75NGFR era superiore a quella delle cellule epiteliali gengivali ottenute con il metodo dell'espiantio diretto (Figura 4A, C , E). I tassi di espressione positiva di ki67, p63 e p75NGFR erano rispettivamente dell'80%, 98% e 96% nel nuovo metodo, che erano significativamente superiori a quelli di ki67 (35%), p63 (40%) e p75NGFR (47%) ottenuti con il metodo diretto (Figura 4B, D , F). Ki67, p63 e p75NGFR sono marcatori di cellule staminali epiteliali orali17. Questi risultati hanno indicato che le cellule epiteliali gengivali primarie isolate e coltivate utilizzando il nuovo metodo contenevano popolazioni di cellule staminali, avevano un alto potenziale di proliferazione e mantenevano le proprietà delle cellule staminali delle cellule epiteliali gengivali.
Figura 4: Le caratteristiche delle cellule staminali delle cellule epiteliali gengivali (P3) ottenute con il metodo dell'espianto diretto e il nuovo metodo enzimatico. (A), (C) e (E) mostrano immagini rappresentative di immunofluorescenza di cellule epiteliali gengivali al passaggio 3 (P3), rispettivamente, mostrando cellule positive ki67 (rosso), p63 (rosso) e p75NGFR (rosso) ottenute con il metodo di espianto diretto e il nuovo metodo enzimatico. DAPI (blu) è stato usato per macchiare i nuclei. Le barre di scala = 50 μm. (B), (D) e (F) mostrano l'analisi quantitativa delle cellule ki67-positive, delle cellule p63-positive e delle cellule p75NGFR-positive, rispettivamente, nelle cellule epiteliali gengivali (P3) ottenute con il metodo dell'espianto diretto e con il nuovo metodo enzimatico. Un totale di 400 cellule sono state contate per quantificare ciascun gruppo e vengono mostrati i numeri medi di cellule positive ki67, p63 e p75NGFR. B, D e F: è stato utilizzato il t-testdello studente; le barre di errore mostrano la deviazione standard; l'esperimento è stato ripetuto quattro volte indipendentemente (n = 4); **p < 0,01, quando si confronta il nuovo metodo enzimatico con il metodo dell'espianto diretto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il tessuto gengivale è una struttura chiave che mantiene l'integrità parodontale e la salute. Le cellule epiteliali gengivali hanno ruoli significativi nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale e possono essere utilizzate nella ricerca scientifica e nelle applicazioni cliniche e campi correlati, tra cui biologia orale, farmacologia, tossicologia e carenze della mucosa orale18. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo stabile ed efficiente per raccogliere le cellule epiteliali orali19. Le cellule epiteliali primarie sono una sorta di cellule completamente differenziate con pochi passaggi e una breve durata di vita. La coltivazione di cellule epiteliali si è dimostrata più complessa della coltivazione di fibroblasti5.
Allo stato attuale, la letteratura pubblicata mostra che esistono vari protocolli per l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali. Tuttavia, due metodi, il metodo di espianto diretto e il metodo enzimatico, sono i più frequentemente utilizzati tra questi protocolli. Nel 1910, Carrel e Burrows descrissero per la prima volta un metodo per ottenere cellule epiteliali gengivali e buccali chiamato metodo di espianto diretto20. Il metodo di espianto diretto ha i vantaggi di requisiti di peso ridotto per i campioni di tessuto, procedure meno complicate, meno variazioni e meno coinvolgimento nelle fasi, ma ha gli svantaggi di richiedere un lungo tempo di coltura ed è altamente suscettibile alla contaminazione5. Nel 1975, Rheinwald e Green hanno riportato per la prima volta il metodo enzimatico utilizzando fibroblasti di topo 3T3 irradiati come strato di alimentazione per la coltura di cellule epiteliali orali in vitro21. Sebbene tale metodo abbia notevolmente migliorato la resa dei cheratinociti, lo strato di cellule di alimentazione del topo irradiato aveva potenziali rischi biologici22. Successivamente, sono stati sviluppati sistemi di coltura senza cellule di alimentazione22 e senza siero23,24 che hanno dimostrato che le cellule 3T3 non erano necessarie per le colture cellulari epiteliali. Sebbene il metodo enzimatico richieda meno tempo di coltura, l'efficienza è relativamente bassa e varia a seconda degli enzimi e del mezzo utilizzato25. Diversi laboratori hanno confrontato i due metodi e Kedjarune et al.6 hanno osservato che la tecnica di espianto diretto ha avuto più successo rispetto al metodo enzimatico e ha trovato un più alto tasso di proliferazione cellulare. Shwetha et al.26 hanno concluso che il metodo di espianto diretto sembra essere una tecnica semplice e di successo per l'isolamento dei cheratinociti della mucosa orale. Tuttavia, Klingbeil et al.7 hanno concluso proprio il contrario, cioè il metodo enzimatico ha mostrato i migliori risultati in meno tempo con una buona durata della vita. Un sondaggio condotto nel Regno Unito da Daniels et al.19 ha esaminato i metodi di isolamento e coltura cellulare dei cheratinociti umani e ha riferito che 21 dei 34 laboratori che hanno risposto hanno utilizzato il metodo enzimatico con alcune variazioni. Sebbene il metodo di espianto diretto richieda meno tessuto e abbia meno passaggi di manipolazione rispetto al metodo enzimatico, è stato suggerito che il metodo enzimatico è più veloce e più facile da gestire6. Pertanto, è stato necessario sviluppare un metodo più conveniente ed efficace per l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali orali4. Il nostro nuovo metodo, un metodo enzimatico semplificato che utilizza Y-27632, ha aumentato significativamente la produzione di cellule epiteliali gengivali e ha ridotto il tempo necessario per separare le cellule epiteliali gengivali dal tessuto gengivale.
La Figura 2A mostra che il nuovo metodo ha aumentato significativamente la produzione di cellule epiteliali gengivali al terzo e settimo giorno. La figura 2B mostra che il tempo di raddoppio delle cellule preparate utilizzando il nuovo metodo enzimatico è stato di circa 1-2 giorni, ma l'utilizzo del metodo di espianto diretto ha richiesto circa 5-6 giorni. Il numero di cellule prodotte con il nuovo metodo enzimatico (9 x 106) è stato più di tre volte maggiore del metodo di espianto diretto (3 x 106) il settimo giorno (Figura 2C). Le cellule preparate utilizzando il nuovo metodo enzimatico hanno impiegato 13 giorni per diventare confluenti all'80%, il che è coerente con studi precedenti, mentre il metodo di espianto diretto ha richiesto circa 2 settimane6,20,25 ± 1,05 giorni18 e 14,2 ± 2,76 giorni7 affinché le cellule diventasse completamente confluente prima della sottocoltura. Tuttavia, il nuovo metodo enzimatico ha impiegato solo 6 giorni per diventare confluente all'80%, che è molto più breve del metodo di espianto diretto di 13 giorni nel nostro laboratorio e del metodo enzimatico7 di Klingbeil et al. di 11,9 ± 2,36 giorni. Abbiamo anche trovato un fenomeno interessante, cioè le colonie cellulari epiteliali sono cresciute in una struttura multistrato nel metodo dell'espianto diretto, mentre una struttura monostrato uniforme è stata osservata usando il nuovo metodo enzimatico. Ovviamente, le colonie multistrato più spesse prolungano il tempo necessario per diventare confluenti all'80% -100%. Il motivo per cui il nuovo metodo enzimatico promuove la proliferazione cellulare è l'aggiunta di Y-27632, un inibitore di ROCK1 e ROCK2. Y-27632 è stato inizialmente segnalato per i suoi effetti positivi sulla proliferazione e differenziazione delle cellule epiteliali umane nel 200827. Chapman et al.28 hanno riferito che il trattamento con Y-27632 ha notevolmente aumentato la capacità proliferativa dei cheratinociti e ha portato a un'immortalizzazione efficiente senza crisi cellulari rilevabili. Nei nostri studi precedenti, abbiamo scoperto che Y-27632 semplifica la procedura di isolamento delle cellule epidermiche primarie umane e dei cheratinociti dal tessuto cutaneo adulto8,9,10. Strudwick et al.29 hanno riferito che l'uso di 10 μM Y-27632 insieme a basso contenuto di calcio ha permesso di farinociti umani primari di essere coltivati senza uno strato di alimentazione cellulare per periodi di tempo più lunghi, pur mantenendo la capacità di differenziare e formare un epitelio stratificato. In questo studio, il nuovo metodo enzimatico che utilizza Y-27632 ha notevolmente aumentato la raccolta di cellule epiteliali estendendo la loro durata e promuovendo la loro capacità proliferativa.
Il metodo enzimatico tradizionale contiene due operazioni di digestione. La prima digestione consiste nel separare il tessuto epiteliale dal tessuto connettivo usando la dispasi, che funziona dal latostromale 4,5. La seconda digestione di solito utilizza la tripsina per separare le cellule epiteliali dal tessuto epiteliale4,5. A causa della distruzione delle cellule epiteliali da parte della tripsina, l'efficienza del metodo enzimatico è influenzata4. Il nuovo metodo enzimatico qui descritto è un metodo semplificato che omette una fase di digestione. Le principali differenze tra i metodi enzimatici nuovi e tradizionali si riferiscono ai protocolli di separazione del tessuto epiteliale dal tessuto connettivo5. Inoltre, il nuovo metodo utilizza la dispasi e la collagenasi invece della tripsina nella fase di digestione, e quindi l'integrità delle cellule epiteliali è ben protetta. Clinicamente, è molto più difficile ottenere la stessa quantità di tessuto dalla gengiva umana che dalla pelle e dalla mucosa buccale. Il metodo dell'espianto diretto richiedeva solo piccoli pezzi di tessuto gengivale e coltivava un numero maggiore di cellule rispetto al metodo enzimatico18. Abbiamo trattato una piccola quantità di tessuto epiteliale gengivale utilizzando il nuovo metodo e raccolto una densità cellulare molto soddisfacente. Ciò dimostra che il nuovo metodo non dipende da quantità relativamente grandi di tessuto da fornire inizialmente. Una possibile limitazione del nuovo metodo è che potrebbe apparire una piccola quantità (<5%) di contaminazione dei fibroblasti alla coltura iniziale (passaggio 0), ma può essere facilmente rimossa da un trattamento a breve termine dello 0,05% di tripsina come riportato previsouly9.
In questo studio, CK5, CK18 e Pan-CK (CK14, CK15, CK16 e CK19) sono risultati positivi (Figura 3A,C, D). Ciò ha suggerito che le cellule epiteliali gengivali isolate erano in grado di mantenere la loro funzione di membrana basale, il che è coerente con gli studi di Orazizadeh et al.30 e Kedjarune et al.6. CK5 e CK14 sono espressi da cellule indifferenziate localizzate nello strato epiteliale-basale. CK19 si trova tipicamente nell'epitelio semplice e nell'epitelio stratificato non cheratinizzato31. L'analisi di immunofluorescenza delle cellule epiteliali gengivali (P3) ottenuta utilizzando il nuovo metodo enzimatico ha mostrato che i livelli di espressione di ki67, p63 e p75NGFR erano più alti rispetto alle cellule ottenute con il metodo dell'espiantio diretto (Figura 4). Questo risultato indica che il nuovo metodo può mantenere le proprietà delle cellule staminali delle cellule epiteliali gengivali e promuove il potenziale di proliferazione delle cellule epiteliali gengivali. Il nostro studio precedente ha scoperto che Y-27632 mantiene il potenziale delle cellule staminali epidermiche della pelle dopo l'espansione8. Wang et al. hanno scoperto che Y-27632 facilita la proliferazione, la migrazione e la pluripotenza delle cellule staminali del legamento parodontale umano32.
In sintesi, il nuovo metodo enzimatico modificato fornisce una procedura semplificata ed efficace per isolare e coltura cellule epiteliali primarie umane dal tessuto gengivale adulto. Questo nuovo metodo è più semplice, richiede meno tempo e migliora le loro proprietà delle cellule staminali, e quindi ha evidenti vantaggi rispetto al metodo di espianto diretto in molti parametri. Questo metodo avanzato è più adatto per la produzione di un gran numero di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per applicazioni di laboratorio che per applicazioni cliniche.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Key Program della Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) e dal Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) a X.W.; il programma chiave di ricerca e sviluppo della provincia di Shandong (2018GSF118240) a J.G.; Progetto di sviluppo medico e sanitario scientifico e tecnologico della provincia di Shandong (2018WS163) a Z.X. e il progetto di sviluppo medico e sanitario scientifico e tecnologico della provincia di Shandong (2019WS045) a J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
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