Summary
ここでは、従来の方法にロック阻害剤Y-27632を添加することにより、ヒト歯肉上皮細胞の単離および培養のための改変方法を提示する。この方法は、より簡単で、時間のかかるおらず、幹細胞の特性を高め、実験室と臨床用途の両方で、より多くの高電位上皮細胞を産生します。
Abstract
歯肉組織は歯周組織を保護し、多くの口腔機能において意味のある役割を果たす最初の構造である。歯肉上皮は歯肉組織の重要な構造であり、特に歯周組織の修復および再生において重要である。歯肉上皮細胞の機能を研究することは、口腔欠損の修復や生体物質の適合性の検出など、科学的価値が重要です。ヒト歯肉上皮細胞は高度に分化された角化細胞であるため、その寿命は短く、通過が困難です。これまでのところ、歯肉上皮細胞を単離して培養する方法は2つしかなく、直接外植法と酵素法です。しかし、直接外植法を用いて上皮細胞を得るのに要する時間は長く、酵素法の細胞生存率は低くなる。臨床的には、歯肉組織の獲得は限られているため、安定、効率的、簡便 なインビトロ 分離および培養システムが必要です。我々は、上皮細胞の増殖を選択的に促進することができるRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤であるY-27632を添加することで、従来の酵素的方法を改善した。当社の改変酵素法は、従来の酵素法のステップを簡素化し、上皮細胞の培養効率を高め、直接外植法および酵素法に対して大きな利点を有する。
Introduction
ヒト歯肉は、歯周組織を保護する第1線防御構造であり、物理的および化学的障壁1であるだけでなく、免疫応答に関与し、免疫バリア2,3を構成する炎症性メディエーターの異なるクラスを分泌する。歯肉上皮は歯周組織の修復および再生に重要な役割を果たす。したがって、歯肉上皮の防御と免疫を研究することは、歯膜炎の発生、診断、および治療を理解する上で非常に重要である。ヒト歯肉組織からの歯肉上皮細胞の単離および培養は、歯肉上皮の研究に必要な第一歩である。このような手順は、組織工学のための種子細胞の生産、歯周関連疾患のインビトロモデル、および歯周欠損を修復するための材料などの基本的な操作を必要とします。
初代歯肉上皮細胞は、vitro4における低い分裂率によって特徴付けられるが、研究者たちは何十年もの間、最適な単離および培養法を探してきた。現在までに、2つの異なる技術、直接外植法および酵素的方法は、一般的に、インビトロ4、5で一次歯肉上皮細胞を得るために実験室で使用されている。この直接外植法は、より低い量の組織標本および単純な単離手順の要件などの利点を有するが、汚染5に対する培養時間および感受性が長いという欠点を有する。酵素法は必要な培養時間を短縮するが、効率は比較的低く、使用する酵素や培地によって異なる。Kedjaruneら 6は、サブカルチャー(2週間)前により多くの時間を要する直接外植法が、酵素法と比較して歯肉上皮細胞の培養に成功したように見えることを示した。しかし、これら2つの方法を比較すると、Klingbeilら7は、酵素法が経口上皮細胞の一次培養に最良の結果を有し、最短時間(11.9日対14.2日)以内に最適な細胞収量を得ることが可能であることを発見した。
したがって、口腔上皮細胞4の単離および培養に対して、より便利で効果的な方法を開発することが重要であった。我々は、以前、Y-27632、Rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)の阻害剤を添加すると、成人の皮膚組織8、9、10からのヒト初表皮細胞およびケラチノサイトの単離手順を簡素化することを報告した。我々は、表皮を皮膚細胞から自然に分離し、初発表皮細胞8,9,10の増殖と収率を支える新しい調整接種培地であるG培地を開発した。本研究では、G培地とY-27632を組み合わせることにより、歯肉上皮細胞の新しい無血清分離および培養技術を開発した。本質的に、我々の方法は従来の2段階の酵素法の単純化に基づいているので、我々は新しい方法を直接外植法と比較した。この修飾酵素法は、歯肉の上皮細胞を歯肉組織から分離するのに必要な時間を大幅に短縮し、歯肉上皮細胞の培養の効率を高める。
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Protocol
このプロトコルで使用されるヒト組織は、本学の人間研究倫理委員会のガイドラインに従って、顎顔面外科の影響を受けた歯の抽出から廃棄された新鮮な成人の歯肉組織である(プロトコルNo.GR201711、日付:02-27-2017)。
1. 準備
- 10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む15 mLチューブに新鮮な成人歯肉組織を採取し、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を3%補充し、組織を4°Cに保ちます。
注:切除後24時間以内に、以下の詳細として組織を扱ってください。
2. 試薬・培養培地の準備
- 洗浄液を調製する:3%P/S.50mLのペニシリン(100 U/mL)と1.5mLのストレプトマイシン(100mg/L)をPBSに混ぜます。
- 500 mLの成長因子含有培地(G培地と呼ばれる):1%P/S、2%B27サプリメント、20 ng/mLの表皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子2(FGF2)の40 ng/mL、および40 μg/mLのファンギゾンを含むDMEM/F12(3:1)培地。
- 新しい方法のための酵素消化液を準備する:DMEMの50 mLでディスパーゼ粉末の125mgと125mgのタイプコラゲローゼパウダーを溶解します。
注:0.22 μmのストレーナーを通してすべての酵素溶液をフィルターし、4°Cで保管してください。 - 酵素消化を中和するために培地の500 mLを調製する:10%胎児ウシ血清(FBS)と1%P/S DMEM培地でP/S。
3. 直接出動方法
- 歯肉組織前処理
- 歯肉組織を5 mLの75%エタノールで30s洗浄します。次いで、洗浄液の5mL(ステップ2.1)で5分間2回リンスする。
メモ:直径50mmの細胞培養皿ですべての洗い物を行います。
- 歯肉組織を5 mLの75%エタノールで30s洗浄します。次いで、洗浄液の5mL(ステップ2.1)で5分間2回リンスする。
- 歯肉上皮細胞培養
- 歯肉組織を1mm3 に切り、100mmの細胞培養皿に散散らす。切断操作には、細かい尖った鉗子と眼科用ハサミを使用してください。
- G培地(ステップ2.2)を培養皿に加えます。次いで、培養皿を37°Cで5%CO2 インキュベーターでインキュベートする。 24時間ごとに組織を調べるには、反転顕微鏡(40倍)を使用してください。
- 上皮細胞が組織片の周りの直径2〜5mmに伝播した場合、歯肉組織片を取り除きます。G-培地を2~4日ごとに変更します。
4. 新しい変更された酵素的方法
- 歯肉組織前処理
- このためには、直接出動法のステップ 3.1.1 に記載されているのと同じ手順に従います。
- 歯肉組織の消化
- 歯肉組織を2つの滅菌ブレードで約<1mmの小さな部分に切ります。2つの外科用ブレードで細断するプロセスを繰り返します。
- 歯肉組織片を含む1.5mL遠心分離機チューブに2.5mg/mLジスパーゼ+コラゲナーゼ溶液1 mLを加え、37°Cでインキュベーターで15〜20分間チューブをインキュベートします。
- 組織が透明で凝集すると、1 mLの中和溶液を加え、消化を終了する。10~15回上下にピペットを入れ、溶液を完全に混合します。100 μm メッシュフィルターを通して、ソリューションを渡します。
- 200 x g で 5 分間遠心分離機。
- 上清を取り除き、成長因子含有培地の10mLで底部の細胞ペレットを再懸濁する(ステップ2.2)。細胞懸濁液を100mmの細胞培養皿に移す。細胞培養皿にY-27632の10μMを加えます。
- 5%CO2インキュベーターで37°Cで細胞を培養する。古いG培地を2日ごとに新鮮なG培地に交換してください。1日目と3日目にセルを観察します。
5. 細胞の通過
- インキュベーターから皿を取り出し、使用済み培地を取り出し、PBSで2回洗浄します。100mmの皿ごとに0.05%トリプシンを2mL加えます。
注:トリプシン溶液と皿底の間に十分な接触があることを確認するために皿を振ります。 - 消化プロセスのために37 °Cで5分前後のインキュベーターに皿を残します。
- 顕微鏡(40x)を使用して細胞を調べ、ほとんどの細胞が皿の底から分離していることを確認します。
- 2 mLの中和液を加え、消化を停止し、細胞を15 mLチューブに移します。ピペットは10-15回上下します。200 x g で細胞を 5 分間遠心分離します。
- 上清をゆっくり取り出します。G培地10mLで細胞を再懸濁し、細胞数をカウントします。
- G培地10mLに約1 x 106 細胞、10μM Y-27632を100mm皿に加えます。
- G-MediumとY-27632を2日ごとに更新します。1 日目と 5 日目のセルを表示します。
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Representative Results
図1 は、直接外植法及び改変酵素法の概略図を示す。直接の外植法は、全体のプロセス中に任意の消化酵素を必要としません。対照的に、伝統的な酵素法は通常、消化酵素の2組、ディスパスおよびコラゲアーゼを必要とし、下層の線維芽細胞層から上皮シートを分離し、次にトリプシンを使用して上皮細胞を懸濁液に放出する。我々の新しい方法は分離のステップを省略し、単純化された酵素的方法である。さらに、Y-27632をG培地に添加すると、上皮細胞増殖が効果的に促進される。直接外植法は、通常、歯肉上皮細胞が十分に増殖して十分に増殖し、容易に汚染されるのに約2週間かかる。しかし、新しい方法で得られる歯肉上皮細胞の数は、直接外植法で得られるものより有意に多く、合格の要件を満たすのに平均8日しかかかりません。
図1: 直接外植法と新しい方法の比較( A)は、直接外植法のプロセスを示す。歯肉組織片を培養皿に入れます。上皮細胞は、G培地で培養され、組織片から成長する。直接外植法は、通常、上皮細胞が合流率80%に達するまでに約13日かかります。(B) 新しい酵素法のプロセスを示すスキーム。歯肉組織断片をジスパーゼとコラゲターゼIによって消化し、その後、細胞ペレットをY-27632でG培地で培養する。新しい酵素法は、通常、過渡に適した80%合流に達するまでに約6日かかります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
直外植法および新しい方法によって調製された成体歯肉上皮細胞は、3日目および7日目に顕微鏡で観察された(図2A)。この新しい方法は、3日目と7日目に歯肉上皮細胞の産生を有意に増加させたことが分かる。新しい方法および直接外植法によって得られた歯肉上皮細胞の成長曲線を、異なる時点(1d、2d、3d、4d、5d、6d)で細胞計数キット(CCK−8)を用いて測定した(図2B)。新しい方法を用いて調製した細胞の倍加時間は約1〜2日であったが、直接外植法を用いて調製した細胞の倍加時間は約5〜6日であった。この2つの方法による細胞収量を7日目(図2C)で計算し、新しい方法(9 x106)で産生される細胞の数が、直接出植法で産生される細胞数の3倍以上(3x106)であることを示した。図2Dは、新しい方法(6日)が直接外植法(13日間)と比較して80%の合流を達成するのに約半分の時間がかかったことを示しています。
図2: 新しい酵素法により、歯肉の上皮細胞の産生が増加する。(A)最初の接種後3日目と7日目に、直接外植法(下段)と新しい酵素法(上段)によって調製された歯肉上皮細胞の画像。スケールバー=200μm(B)直接法および新しい酵素法で培養したギンジバル上皮細胞を1日目、2日目、3日目、4日目、5日、6日目に採取し、歯肉上皮細胞の数をCCK-8キットを用いて分析した。(C)7日間培養した後、歯肉上皮細胞をトリプシンにより剥離し、回収した。細胞計数板を用いて、2つの方法で別々に調製した歯肉上皮細胞の数を決定した。細胞数は、2つの方法から計算し、これを3回別々に繰り返し、その結果は100mm皿当たりの平均細胞数として表される。(D)新しい酵素法と直接外植法によって調製された一次歯肉上皮細胞(通路0)の80%合流に達するまでの平均時間を比較する。B、C、D: 学生のt-test が使用されました。誤差範囲は標準偏差を示します。n = 4;**p < 0.01, *p <新しい酵素法と直接外植法を比較する場合は 0.05.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
新しい方法により得られた歯肉上皮細胞(継ぎ手3)の免疫蛍光分析はCK5の発現を示し、 CK18、およびPan-CK(CK14、CK15、CK16、およびCK19)は陽性であった(図3A、C、D)、11、12、13、14、15、CK10およびビメンチンの発現が低い(図3B、E)11、16であった。CK5およびPan-CK(CK14、CK15、CK16、およびCK19)は、主に上皮細胞の基底層に局在し、これはそれらの高分化電位11、14、15の徴候である。CK10は、分化上皮11のマーカーであり、そしてビメンチンは歯肉線維芽細胞16のマーカーである。新しい方法で単離された歯肉上皮細胞のケラチン陽性率は、特にCK5、CK18、およびPan-CK(図3A、C、D)より高く、単離された歯肉上皮細胞が良好な地下膜機能を維持できることを示した。分化マーカーCK10(図3B)の低い発現は、歯肉上皮上皮細胞が高い分化電位を有することを示した。インビトロ培養は、新しい方法で単離された歯肉上皮細胞を8代目まで培養できることを示し、ビメンチンの低発現は、歯肉上皮上皮細胞が高純度であり、歯肉線維芽細胞がそれらを汚染しておらず、分離効率が高いことを示した(図3E)。
図3:新しい酵素法により調製された歯肉上皮細胞(P3)の特異的マーカー (A-E)はCK5(赤)、CK10(赤)、CK18(赤)、Pan-CK(赤)、ビメンチン(赤)陽性細胞を示し、DAPI(青色)を使用して核を染色した。(A-C)スケールバー = 100 μm;(D)と(E)スケールバー= 50 μm;実験を独立して4回繰り返した。(A)、(C)および(D)は、ギンジバル上皮細胞におけるCK5、CK18、およびパンCK(CK14、15、16、および19)の陽性発現を示し、一方(B)および(E)は歯肉上皮細胞におけるCK10およびビメンチンの低い発現を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
この新しい方法は、キ67、p63、およびp75NGFR(低親和性神経成長因子受容体p75)の発現を一次歯肉上皮細胞において増加させる。蛍光法で3細胞を選択したところ、キ67、p63、p75NGFRの陽性発現が、直接外植法で得られた歯肉上皮細胞よりも高いことが明らかになった(図4A、C、E)。ki67、p63、およびp75NGFRの正の発現率は、それぞれ80%、98%、96%であったが、これは、それぞれki67(35%)、p63(40%)、およびp75NGFR(図4B,D,F)より有意に高かった。Ki67,p63,およびp75NGFRは、経口上皮幹細胞17のマーカーである。これらの結果は、新しい方法を用いて培養した初等歯肉上皮細胞に幹細胞集団が含まれ、増殖ポテンシャルが高く、歯肉上皮細胞の幹細胞特性を維持したことを示した。
図4:直接外植法と新しい酵素法により得られた歯肉上皮細胞(P3)の幹細胞特性(A)、(C)及び(E)は、通路3(P3)における歯肉上皮細胞の代表的な免疫蛍光像を示し、それぞれ、キ67(赤)、p63(赤)、およびp75NGFR(赤色)を示す直接外草法および新しい酵素法により得られる陽性細胞を示す。DAPI(青)を使用して核を染色した。スケールバー=50μm(B)、(D)及び(F)は、キ67陽性細胞、p63陽性細胞、およびp75NGFR陽性細胞の定量分析をそれぞれ示し、直接外発法で得られた歯肉上皮細胞(P3)および新しい酵素法により得た。各群を定量するために計400個の細胞を数え、キ67、p63、およびp75NGFR陽性細胞の平均数を示した。B、D、F: 学生のt-test が使用されました。誤差範囲は標準偏差を示します。実験を独立して4回繰り返した(n = 4);**p<0.01、新しい酵素法を直接外植法と比較する場合。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
歯肉組織は歯周の完全性と健康を維持する重要な構造です。歯肉上皮細胞は歯周組織の修復および再生に重要な役割を有し、経口生物学、薬理学、毒物学、および口腔粘膜欠乏症を含む科学的研究および臨床応用および関連分野で使用することができる18。したがって、経口上皮細胞19を収穫するために安定かつ効率的な方法を開発する必要がある。初代上皮細胞は、少ない通路と短い寿命を持つ完全に分化した細胞の一種です。上皮細胞の培養は、線維芽細胞の培養よりも複雑であることが証明されている5.
現在、出版された文献は、上皮細胞の単離および培養のために様々なプロトコルが存在することを示している。しかしながら、直接外植法と酵素法の2つの方法が、これらのプロトコルの中で最も頻繁に使用される。1910年、キャレルとバローズはまず、直接外植法20と呼ばれる歯肉および頬上皮細胞を得る方法を説明した。直接外植法は、組織標本に対する低体重要件、複雑性の低い手順、変動の少ない、工程への関与が少ない利点を有するが、長い培養時間を要するという欠点があり、汚染に対して非常に脆弱である5。1975年、リンヴァルトとグリーンは、最初に、インビトロ21で経口上皮細胞を培養するフィーダー層として照射された3T3マウス線維芽細胞を使用して酵素法を報告した。その方法はケラチノサイトの収率を大幅に改善したが、照射されたマウスフィーダー細胞層は潜在的な生物学的リスク22を有していた。その後、フィーダー細胞22を含まない培養系23,24が開発され、3T3細胞が上皮細胞培養に必要ないことを証明した。酵素法は培養時間が少ないが、効率は比較的低く、使用する酵素や培地に応じて異なる25。いくつかの実験室は、2つの方法を比較し、Kedjaruneらら6は、酵素法よりも成功する直接外植技術を観察し、より高い細胞増殖率を発見した。Shwethaら26は、直接外植法は口腔粘膜角化細胞の単離のための単純かつ成功した技術であると結論付けた。しかし、クリングベイルら7は正反対、すなわち、酵素法は、良好な寿命を有するより短い時間で最良の結果を示した。ダニエルズらによって英国で行われた調査は、ヒトケラチノサイトの分離および細胞培養方法を検討し、回答した34の実験室のうち21がいくつかのバリエーションを有する酵素法を使用したことを報告した。直接外植法は、より少ない組織を必要とし、酵素法よりも少ない処理ステップを有するが、酵素的方法は、より速く、管理しやすい6であることを示唆されている。したがって、口腔上皮細胞4の単離および培養に対して、より便利で効果的な方法を開発する必要があった。今回の新しい方法は、Y-27632を用いた簡便な酵素法で、歯肉上皮細胞の産生を大幅に増加させ、歯肉上皮細胞と歯肉組織を分離するのに必要な時間を短縮した。
図2Aは、新しい方法が3日目および7日目にギンジバル上皮細胞の産生を有意に増加させたことを示す。図2Bは、新しい酵素法を用いて調製した細胞の倍加時間は約1〜2日であったが、直接外植法を用いて約5〜6日かかったことを示す。新しい酵素法(9 x 106)を用いて産生される細胞の数は、7日目の直接出動法(3 x106)より3倍以上多かった(図2C)。新しい酵素法を用いて調製された細胞は、以前の研究と一致する80%コンフルエントになるまで13日かかり、直接外植法は約2週間6、20.25±1.05日18、14.2±2.76日を要し、細胞はサブカルチャーの前に完全にコンフルエント流になる。しかし、新しい酵素法は、私たちの研究室とクリングベイルらの7つの酵素方法11.9±2.36日の13日間の直接外植法よりもはるかに短い80%コンフルエントになるまでにわずか6日しかかかりませんでした。また、直接的な外植法では多層構造で上皮細胞コロニーが成長し、新しい酵素法を用いて均一な単層構造が観察された興味深い現象も見つかりました。明らかに、より厚い多層コロニーは、80%-100%コンフルエントになるために必要な時間を延長する。新しい酵素法が細胞増殖を促進する理由は、ROCK1とROCK2の阻害剤であるY-27632の添加です。Y-27632は、2008年27年にヒト上皮細胞増殖および分化に対するそのプラスの効果について最初に報告された。チャップマンら28は、Y-27632による治療はケラチノサイトの増殖能力を大幅に増加させ、検出可能な細胞危機のない効率的な不死化をもたらしたと報告した。我々の以前の研究では、Y-27632がヒトの初位表皮細胞およびケラチノサイトの成人皮膚組織8、9、10からの分離手順を単純化することを発見した。Strudwick et al.29は、10μM Y-27632を低カルシウムと共に使用することで、一次ヒトケラチノサイトを細胞フィーダー層なしで長期間培養し、層状エピテリウムを区別して形成する能力を保持することを報告した。本研究では、Y-27632を用いた新しい酵素法により、寿命を延ばし増殖能を促進することで上皮細胞の収穫量を大幅に増加した。
従来の酵素的方法には、2つの消化操作が含まれています。最初の消化は、間質側4,5から働くジスパーゼを用いて上皮組織を結合組織から分離することである。第2の消化は通常、トリプシンを使用して上皮細胞を上皮組織4,5から分離する。トリプシンによる上皮細胞の破壊のために、酵素法の効率が4に影響される。ここで説明する新しい酵素法は、1つの消化ステップを省略した簡便な方法です。新しい酵素的方法と伝統的な酵素的方法の主な違いは、上皮組織を結合組織5から分離するプロトコルを指す。さらに、新しい方法は、消化段階でトリプシンの代わりにディスパーゼとコラゲトー酵素を使用し、したがって上皮細胞の完全性が十分に保護されています。臨床的には、皮膚や頬粘膜からよりヒト歯肉から同量の組織を得ることははるかに困難である。直接外植法は、歯肉組織の小片のみを必要とし、酵素法18と比較してより多くの細胞を培養した。新しい方法を用いて少量の歯肉上皮組織を処理し、非常に満足のいく細胞密度を収穫した。これは、新しい方法が最初に提供される組織の比較的大量に依存しないことを示しています。新しい方法の1つの可能な制限は、初期培養時に線維芽細胞の少量(<5%)の汚染(通過0)が現れる可能性があることであるが、報告された0.05%トリプシンの短期治療によって容易に除去することができる9。
この研究では、CK5、CK18、およびパンCK(CK14、CK15、CK16、およびCK19)が陽性であった(図3A、C、D)。これは、単離された歯肉上皮細胞が、その細胞の膜機能を維持することができ、これはOrazizadehららおよびケジャルーヌらの研究と一致していることを示唆した。CK5およびCK14は、上皮基底層に局在する未分化細胞によって発現される。CK19は、典型的には、単純上皮および非角化層状上皮31中に見られる。新しい酵素法を用いて得られた歯肉上皮細胞(P3)の免疫蛍光分析は、ki67、p63、およびp75NGFRの発現レベルが、直接外植法を用いて得られた細胞よりも高いことを示した(図4)。この結果は、新しい方法が歯肉上皮細胞の幹細胞特性を維持し、歯肉上皮細胞の増殖可能性を促進できることを示している。我々の以前の研究は、Y-27632が拡張後の皮膚表皮幹細胞電位を維持することを発見した 8.Wangらは、Y-27632がヒト歯周靭帯幹細胞32の増殖、移動、および多能性を促進することを発見した。
要約すると、新しい修飾酵素法は、ヒトの初等上皮細胞を成体歯肉組織から単離し培養するための簡便かつ効果的な手順を提供する。この新しい方法は、より簡単で、時間がかかり、幹細胞の特性を高め、多くのパラメータで直接外植法と比較して明らかな利点を有する。この高度な方法は、実験室および臨床用途の両方のために、多数の高電位上皮細胞を製造するのに適しています。
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Disclosures
すべての著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、山東省自然科学財団(ZR2019ZD36)の主要プログラムと山東省の主要研究開発プログラム(2019GSF108107)からX.W.に支援されました。山東省の主要研究開発プログラム(2018GSF118240)からJ.G.へ山東省医療・健康科学技術開発プロジェクト(2018WS163)からZ.Xへ、山東省医療・健康科学技術開発プロジェクト(2019WS045)からJ.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
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