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Bioengineering

Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62978
Automatic Translation
1,2,3, 4, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2,5, 1
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

Summary

Aquí presentamos un método modificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas mediante la adición del inhibidor de Rock, Y-27632, al método tradicional. Este método es más fácil, consume menos tiempo, mejora las propiedades de las células madre y produce un mayor número de células epiteliales de alto potencial tanto para el laboratorio como para aplicaciones clínicas.

Abstract

El tejido gingival es la primera estructura que protege los tejidos periodontales y desempeña un papel significativo en muchas funciones orales. El epitelio gingival es una estructura importante del tejido gingival, especialmente en la reparación y regeneración del tejido periodontal. El estudio de las funciones de las células epiteliales gingivales tiene un valor científico crucial, como la reparación de defectos orales y la detección de la compatibilidad de los biomateriales. Como las células epiteliales gingivales humanas son células queratinizadas altamente diferenciadas, su vida útil es corta y son difíciles de pasar. Hasta ahora, solo hay dos formas de aislar y cultivar células epiteliales gingivales, un método de explante directo y un método enzimático. Sin embargo, el tiempo requerido para obtener células epiteliales utilizando el método de explante directo es más largo, y la tasa de supervivencia celular del método enzimático es menor. Clínicamente, la adquisición de tejido gingival es limitada, por lo que se necesita un sistema de aislamiento y cultivo in vitro estable, eficiente y simple. Mejoramos el método enzimático tradicional agregando Y-27632, un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK), que puede promover selectivamente el crecimiento de las células epiteliales. Nuestro método enzimático modificado simplifica los pasos del método enzimático tradicional y aumenta la eficiencia del cultivo de células epiteliales, lo que tiene ventajas significativas sobre el método de explante directo y el método enzimático.

Introduction

La encía humana, la estructura de defensa de primera línea que protege el tejido periodontal, no solo es una barrera física y química1,sino que también segrega diferentes clases de mediadores inflamatorios que participan en las respuestas inmunes y constituyen una barrera inmune2,3. El epitelio gingival juega un papel importante en la reparación y regeneración del tejido periodontal. Por lo tanto, estudiar la defensa y la inmunidad del epitelio gingival es de gran importancia para comprender la aparición, el diagnóstico y el tratamiento de la periodontitis. El aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales a partir de tejido gingival humano es el primer paso requerido para estudiar el epitelio gingival. Tal procedimiento requiere operaciones básicas como la producción de células de semillas para la ingeniería de tejidos, modelos in vitro de enfermedades periodontales asociadas y materiales para reparar defectos periodontales.

Las células epiteliales gingivales primarias se caracterizan por una baja tasa de división in vitro4,los investigadores han estado buscando un método óptimo de aislamiento y cultivo durante décadas. Hasta la fecha, dos técnicas diferentes, un método de explante directo y un método enzimático, se utilizan comúnmente en los laboratorios para obtener células primarias del epitelio gingival in vitro4,5. El método de explante directo tiene ventajas como el requisito de una menor cantidad de muestras de tejido y un procedimiento de aislamiento simple, pero tiene las desventajas de un mayor tiempo de cultivo y susceptibilidad a lacontaminación 5. Aunque el método enzimático acorta el tiempo de cultivo requerido, la eficiencia es relativamente baja y varía dependiendo de las enzimas y el medio utilizado. Kedjarune et al.6 mostraron que el método de explante directo, que requiere más tiempo antes del subcultivo (2 semanas), pareció ser más exitoso para el cultivo de células epiteliales gingivales en comparación con el método enzimático. Sin embargo, comparando estos dos métodos, Klingbeil et al.7 encontraron que el método enzimático tuvo los mejores resultados para los cultivos primarios de células epiteliales orales, y fue posible obtener el rendimiento celular óptimo en el período de tiempo más corto (11,9 días frente a 14,2 días).

Por lo tanto, era importante desarrollar un método más conveniente y efectivo para el aislamiento y cultivo de células epiteliales orales4. Anteriormente informamos que la adición de Y-27632, un inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK), simplifica el procedimiento de aislamiento de células epidérmicas primarias humanas y queratinocitos de tejidos de piel adultos8,9,10. Desarrollamos G-medium, un nuevo medio de inoculación condicionado que separa espontáneamente las células epidérmicas de las dérmicas y apoya el crecimiento y el rendimiento de las células epidérmicas primarias8,9,10. En el presente estudio, desarrollamos una nueva técnica de aislamiento y cultivo sin suero para células epiteliales gingivales mediante la combinación de G-medium con Y-27632. En esencia, nuestro método se basa en una simplificación del método enzimático tradicional de dos pasos, por lo que comparamos nuestro nuevo método con el método de explante directo. Este método enzimático modificado acorta significativamente el tiempo necesario para separar las células epiteliales gingivales del tejido gingival y aumenta la eficiencia del cultivo de las células epiteliales gingivales.

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Protocol

Los tejidos humanos utilizados en este protocolo son tejidos gingivales adultos frescos descartados de las extracciones de dientes impactados en el Departamento de Cirugía Maxilofacial de acuerdo con las directrices del Comité de Ética en Investigación Humana de la Institución (Protocolo No. GR201711, Fecha: 27-02-2017).

1. Preparativos

  1. Recolectar tejidos gingivales adultos frescos en tubos de 15 ml que contengan 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con penicilina/estreptomicina al 3% (P/S) y mantener los tejidos a 4 °C.
    NOTA: Trate los tejidos como se detalla a continuación dentro de las 24 h posteriores a la escisión.

2. Preparar reactivos y medio de cultivo

  1. Preparar la solución de lavado: 3% P/S. Mezclar 50 mL de PBS con 1,5 mL de penicilina (100 U/mL) y 1,5 mL de estreptomicina (100 mg/L).
  2. Prepare 500 ml de medio que contenga factor de crecimiento (llamado medio G): medio DMEM / F12 (3: 1) que contenga 1% P / S, suplemento de B27 al 2%, 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 40 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y 40 μg / ml de fungizona.
  3. Prepare soluciones de digestión enzimática para el nuevo método: Disuelva 125 mg de polvo de Dispasa y 125 mg de polvo de colagenasa tipo I en 50 ml de DMEM.
    NOTA: Filtrar todas las soluciones enzimáticas a través de un colador de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
  4. Preparar 500 mL del medio para neutralizar la digestión enzimática: 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de P/S en el medio DMEM.

3. Método de explantación directa

  1. Pretratamiento del tejido gingival
    1. Lavar el tejido gingival con 5 mL de etanol al 75% durante 30 s. Luego, enjuague dos veces con 5 ml de la solución de lavado (paso 2.1) durante 5 min.
      NOTA: Realizar todos los lavados en platos de cultivo celular con un diámetro de 50 mm.
  2. Cultivo de células epiteliales gingivales
    1. Cortar el tejido gingival en trozos de 1 mm3 y esparcirlos en una placa de cultivo celular de 100 mm. Use fórceps puntiagudos finos y tijeras oftálmicas para las operaciones de corte.
    2. Agregue el medio G (paso 2.2) al plato de cultivo. Luego, incuba el plato de cultivo en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Use un microscopio invertido (40x) para examinar los tejidos cada 24 h.
    3. Retire las piezas de tejido gingival cuando las células epiteliales se hayan propagado a un diámetro de 2-5 mm alrededor de las piezas de tejido. Cambie el medio G cada 2-4 días.

4. El nuevo método enzimático modificado

  1. Pretratamiento del tejido gingival
    1. Para ello, siga los mismos pasos descritos para el método de explante directo, paso 3.1.1.
  2. Digestión del tejido gingival
    1. Cortar el tejido gingival en trozos diminutos, de aproximadamente <1 mm de tamaño, con dos cuchillas esterilizadas. Repita el proceso de trituración con dos cuchillas quirúrgicas.
    2. Agregue 1 ml de 2,5 mg/ml de dispasa + solución de colagenasa a un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga las piezas de tejido gingival, y luego incube el tubo durante 15-20 min en una incubadora a 37 °C.
    3. Cuando el tejido se vuelva transparente y floculante, agregue 1 ml de la solución de neutralización para terminar la digestión. Mezcle bien la solución mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Pase la solución a través de un filtro de malla de 100 μm.
    4. Centrifugadora a 200 x g durante 5 min.
    5. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el gránulo celular en la parte inferior en 10 ml de medio que contenga factor de crecimiento (paso 2.2). Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 100 mm. Añadir 10 μM de Y-27632 a la placa de cultivo celular.
    6. Culta las células a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%. Reemplace el G-medium antiguo con el G-medium fresco cada 2 días. Observe las celdas el día 1 y el día 3.

5. Paso celular

  1. Saque el plato de la incubadora, retire el medio gastado y lávelo dos veces con PBS. Añadir 2 ml de tripsina al 0,05% por cada plato de 100 mm.
    NOTA: Agite el plato para asegurarse de que haya suficiente contacto entre la solución de tripsina y el fondo del plato.
  2. Deje el plato en una incubadora alrededor de 5 min a 37 ° C para el proceso de digestión.
  3. Use un microscopio (40x) para examinar las células y asegúrese de que la mayoría de las células se hayan separado del fondo del plato.
  4. Agregue 2 ml de la solución de neutralización para detener la digestión y transferir las células a un tubo de 15 ml. Pipeta hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min.
  5. Retire el sobrenadante lentamente. Resuspend las células con 10 mL de G-medio y cuenta el número de células.
  6. Agregue aproximadamente 1 x 106 celdas en 10 ml de G-medium y 10 μM Y-27632 a cada plato de 100 mm.
  7. Renueve el G-medium y el Y-27632 cada 2 días. Vea las celdas en el día 1 y el día 5.

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Representative Results

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del método de explantación directa y el método enzimático modificado. El método de explante directo no necesita ninguna enzima digestiva durante todo el proceso. En contraste, el método enzimático tradicional generalmente necesita dos conjuntos de enzimas digestivas, dispasa y colagenasa, para separar la lámina epitelial de la capa de fibroblastos subyacente, y luego tripsina para liberar las células epiteliales en suspensión. Nuestro nuevo método omite el paso de separación y es un método enzimático simplificado. Además, la adición de Y-27632 al medio G promueve eficazmente el crecimiento de células epiteliales. El método de explante directo generalmente toma alrededor de 2 semanas para que las células epiteliales gingivales crezcan lo suficiente para pasar y se contaminan fácilmente. Sin embargo, el número de células epiteliales gingivales obtenidas por el nuevo método es significativamente mayor que el obtenido por el método de explante directo y tarda solo un promedio de 8 días en cumplir con los requisitos para el paso.

Figure 1
Figura 1: Comparación del método de explantación directa y del nuevo método. (A) Esquema que muestra el proceso del método de explantación directa. Las piezas de tejido gingival se colocan en un plato de cultivo. Las células epiteliales se cultivan en G-medio y crecen a partir de las piezas de tejido. El método de explante directo generalmente toma alrededor de 13 días para que las células epiteliales alcancen el 80% de confluencia. (B) Esquema que muestra el proceso del nuevo método enzimático. Los fragmentos de tejido gingival son digeridos por la dispasa y la colagenasa I, después de lo cual los gránulos celulares se cultivan en G-medium con Y-27632. El nuevo método enzimático suele tardar unos 6 días en alcanzar el 80% de confluencia, lo que es adecuado para el paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las células epiteliales gingivales adultas preparadas por el método de explante directo y por el nuevo método se observaron en un microscopio en el tercer y séptimo día(Figura 2A). Se puede ver que el nuevo método aumentó significativamente la producción de células epiteliales gingivales en el tercer y séptimo día. Las curvas de crecimiento de las células epiteliales gingivales obtenidas por el nuevo método y por el método de explante directo se midieron utilizando un kit de conteo celular (CCK-8) en diferentes puntos temporales (1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d) (Figura 2B). El tiempo de duplicación de las células preparadas con el nuevo método fue de aproximadamente 1-2 días, pero el tiempo de duplicación de las células preparadas utilizando el método de explantación directa fue de aproximadamente 5-6 días. Los rendimientos celulares por los dos métodos se calcularon en el séptimo día(Figura 2C)y mostraron que el número de células producidas por el nuevo método (9 x 106) era más de tres veces mayor que el número de células producidas por el método de explantación directa (3 x 106). La Figura 2D muestra que el nuevo método (6 días) tardó aproximadamente la mitad del tiempo en lograr una confluencia del 80% en comparación con el método de explante directo (13 días).

Figure 2
Figura 2: El nuevo método enzimático aumenta la producción de células epiteliales gingivales primarias. (A) Imágenes de células epiteliales gingivales preparadas por el método de explante directo (fila inferior) y el nuevo método enzimático (fila superior) en el tercer y séptimo día después de la inoculación inicial. Barras de escala = 200 μm. (B) Las células epiteliales gingivales cultivadas por el método directo y el nuevo método enzimático se recolectaron en los días 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y el número de células epiteliales gingivales se analizó utilizando un kit CCK-8. (C) Después de 7 días de cultivo, las células epiteliales gingivales se separaron por tripsina y se recolectaron. Se utilizó una placa de conteo celular para determinar el número de células epiteliales gingivales preparadas por separado por los dos métodos. El número de células se calculó a partir de los dos métodos, que se repitieron tres veces por separado, y los resultados se expresan como el número promedio de células por plato de 100 mm. (D) Se compara el tiempo medio para alcanzar el 80% de confluencia de las células epiteliales gingivales primarias (paso 0) preparadas por el nuevo método enzimático y por el método de explante directo. B, C y D: Se utilizó la prueba tde Student; las barras de error muestran la desviación estándar; n = 4; **p < 0,01, *p < 0,05 al comparar el nuevo método enzimático con el método de explante directo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El análisis de inmunofluorescencia de las células epiteliales gingivales (en el paso 3) obtenido por el nuevo método mostró que la expresión de CK5, CK18 y Pan-CK (CK14, CK15, CK16 y CK19) fue positiva (Figura 3A,C, D)11,12,13,14,15, mientras que la expresión de CK10 y vimentina fue baja ( Figura3B,E)11,16. CK5 y Pan-CK (CK14, CK15, CK16 y CK19) se localizaron principalmente en la capa basal de las células epiteliales, lo que es un signo de su alto potencial de diferenciación11,14,15. CK10 es un marcador de epitelio diferenciado11,y la vimentina es un marcador de fibroblastos gingivales16. La tasa positiva de queratina de las células epiteliales gingivales aisladas por el nuevo método fue mayor, especialmente CK5, CK18 y Pan-CK(Figura 3A,C, D),lo que indicó que las células epiteliales gingivales aisladas podrían mantener una buena función de la membrana basal. La baja expresión del marcador de diferenciación CK10 (Figura 3B) indicó que las células epiteliales gingivales tenían un alto potencial de diferenciación. Los cultivos in vitro mostraron que las células epiteliales gingivales aisladas por el nuevo método podían cultivarse hasta la octava generación, y la baja expresión de vimentina indicó que las células epiteliales gingivales tenían una alta pureza, que ningún fibroblasto gingival las contaminaba y que la eficiencia de aislamiento era alta (Figura 3E).

Figure 3
Figura 3: Marcadores específicos de células epiteliales gingivales (P3) preparados por el nuevo método enzimático. (A-E) muestran CK5 (rojo), CK10 (rojo), CK18 (rojo), Pan-CK (rojo) y vimentina (rojo) células positivas, DAPI (azul) se utilizó para teñir núcleos. (A-C) barras de escala = 100 μm; (D) y (E) barras de escala = 50 μm; el experimento se repitió cuatro veces de forma independiente. (A), (C) y (D) muestran la expresión positiva de CK5, CK18 y pan-ck (CK14, 15, 16 y 19) en células epiteliales gingivales, mientras que (B) y (E) muestran la baja expresión de CK10 y vimentina en células epiteliales gingivales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El nuevo método aumentó la expresión de ki67, p63 y p75NGFR (receptor p75 del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad) en las células epiteliales gingivales primarias. Las células del pasaje 3 fueron seleccionadas para el análisis de inmunofluorescencia, que reveló que la expresión positiva de ki67, p63 y p75NGFR fue mayor que la de las células epiteliales gingivales obtenidas por el método de explante directo(Figura 4A,C, E). Las tasas de expresión positiva de ki67, p63 y p75NGFR fueron de 80%, 98% y 96% en el nuevo método, respectivamente, que fueron significativamente más altas que las de ki67 (35%), p63 (40%) y p75NGFR (47%) obtenidas por el método directo(Figura 4B,D, F). Ki67, p63 y p75NGFR son marcadores de células madre epiteliales orales17. Estos resultados indicaron que las células epiteliales gingivales primarias aisladas y cultivadas utilizando el nuevo método contenían poblaciones de células madre, tenían un alto potencial de proliferación y mantenían las propiedades de células madre de las células epiteliales gingivales.

Figure 4
Figura 4: Características de las células madre de las células epiteliales gingivales (P3) obtenidas por el método de explante directo y el nuevo método enzimático. (A), (C) y (E) muestran imágenes representativas de inmunofluorescencia de células epiteliales gingivales en el pasaje 3 (P3), respectivamente, mostrando células positivas ki67 (rojo), p63 (rojo) y p75NGFR (rojo) obtenidas por el método de explante directo y el nuevo método enzimático. Se utilizó DAPI (azul) para teñir núcleos. Las barras de escala = 50 μm. (B), (D) y (F) muestran un análisis cuantitativo de células ki67-positivas, células p63-positivas y células p75NGFR-positivas, respectivamente, en células epiteliales gingivales (P3) obtenidas por el método de explante directo y por el nuevo método enzimático. Se contaron un total de 400 células para cuantificar cada grupo, y se muestran los números promedio de células positivas ki67, p63 y p75NGFR. B, D y F: Se utilizó la prueba tde Student; las barras de error muestran la desviación estándar; el experimento se repitió cuatro veces de forma independiente (n = 4); **p < 0,01, al comparar el nuevo método enzimático con el método de explante directo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El tejido gingival es una estructura clave que mantiene la integridad periodontal y la salud. Las células epiteliales gingivales tienen un papel importante en la reparación y regeneración del tejido periodontal y se pueden utilizar en la investigación científica y las aplicaciones clínicas y campos relacionados, incluida la biología oral, la farmacología, la toxicología y las deficiencias de la mucosa oral18. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método estable y eficiente para cosechar células epiteliales orales19. Las células epiteliales primarias son un tipo de células totalmente diferenciadas con pocos pasajes y una vida útil corta. El cultivo de células epiteliales ha demostrado ser más complejo que el cultivo de fibroblastos5.

En la actualidad, la literatura publicada muestra que existen varios protocolos para el aislamiento y cultivo de células epiteliales. Sin embargo, dos métodos, el método de explantación directa y el método enzimático, son los más utilizados entre esos protocolos. En 1910, Carrel y Burrows describieron por primera vez un método para obtener células epiteliales gingivales y bucales llamado método de explante directo20. El método de explante directo tiene las ventajas de requisitos de bajo peso para muestras de tejido, procedimientos menos complicados, menos variación y menos participación en los pasos, pero tiene las desventajas de requerir un largo tiempo de cultivo y es altamente susceptible a lacontaminación 5. En 1975, Rheinwald y Green informaron por primera vez del método enzimático utilizando fibroblastos de ratón 3T3 irradiados como capa alimentadora para cultivar células epiteliales orales in vitro21. Aunque ese método mejoró en gran medida el rendimiento de los queratinocitos, la capa de células alimentadoras de ratón irradiada tenía riesgos biológicos potenciales22. Después de eso, se desarrollaron sistemas de cultivo sin células alimentadoras22 y sin suero23,24 que demostraron que las células 3T3 no eran necesarias para los cultivos de células epiteliales. Aunque el método enzimático requiere menos tiempo de cultivo, la eficiencia es relativamente baja y varía dependiendo de las enzimas y el medio utilizado25. Varios laboratorios compararon los dos métodos y Kedjarune et al.6 observaron que la técnica de explante directo era más exitosa que el método enzimático y encontraron una mayor tasa de proliferación celular. Shwetha et al.26 concluyeron que el método de explante directo parece ser una técnica simple y exitosa para el aislamiento de queratinocitos de la mucosa oral. Sin embargo, Klingbeil et al.7 concluyeron justo lo contrario, es decir, el método enzimático mostró los mejores resultados en menos tiempo con una buena esperanza de vida. Una encuesta realizada en el Reino Unido por Daniels et al.19 revisó los métodos de aislamiento y cultivo celular de queratinocitos humanos e informó que 21 de los 34 laboratorios que respondieron utilizaron el método enzimático con algunas variaciones. Aunque el método de explante directo requiere menos tejido y tiene menos pasos de manejo que el método enzimático, se ha sugerido que el método enzimático es más rápido y más fácil de manejar6. Por lo tanto, fue necesario desarrollar un método más conveniente y efectivo para el aislamiento y cultivo de células epiteliales orales4. Nuestro nuevo método, un método enzimático simplificado que utiliza Y-27632, aumentó significativamente la producción de células epiteliales gingivales y acortó el tiempo requerido para separar las células epiteliales gingivales del tejido gingival.

La Figura 2A muestra que el nuevo método aumentó significativamente la producción de células epiteliales gingivales en el tercer y séptimo día. La Figura 2B muestra que el tiempo de duplicación de las células preparadas con el nuevo método enzimático fue de aproximadamente 1-2 días, pero el uso del método de explante directo tomó alrededor de 5-6 días. El número de células producidas utilizando el nuevo método enzimático (9 x 106) fue más de tres veces mayor que el método de explantación directa (3 x 106) en el séptimo día (Figura 2C). Las células preparadas utilizando el nuevo método enzimático tardaron 13 días en convertirse en un 80% confluentes, lo que es consistente con estudios anteriores, mientras que el método de explante directo tardó aproximadamente 2 semanas6,20.25 ± 1.05 días18 y 14.2 ± 2.76 días7 para que las células se volvieran completamente confluentes antes del subcultivo. Sin embargo, el nuevo método enzimático tardó solo 6 días en convertirse en un 80% confluente, que es mucho más corto que el método de explante directo de 13 días en nuestro laboratorio y el método enzimático7 de Klingbeil et al. de 11.9 ± 2.36 días. También encontramos un fenómeno interesante, es decir, las colonias de células epiteliales crecieron en una estructura de múltiples capas en el método de explante directo, mientras que se observó una estructura monocapa uniforme utilizando el nuevo método enzimático. Obviamente, las colonias más gruesas de múltiples capas prolongan el tiempo requerido para convertirse en 80% -100% confluentes. La razón por la que el nuevo método enzimático promueve la proliferación celular es la adición de Y-27632, un inhibidor de ROCK1 y ROCK2. Y-27632 fue reportado inicialmente por sus efectos positivos sobre la proliferación y diferenciación de células epiteliales humanas en 200827. Chapman et al.28 informaron que el tratamiento con Y-27632 aumentó en gran medida la capacidad proliferativa de los queratinocitos y resultó en una inmortalización eficiente sin crisis celular detectable. En nuestros estudios previos, descubrimos que Y-27632 simplifica el procedimiento de aislamiento de células epidérmicas primarias humanas y queratinocitos de tejido cutáneo adulto8,9,10. Strudwick et al.29 informaron que el uso de 10 μM Y-27632 junto con bajo contenido de calcio permitió que los queratinocitos humanos primarios se cultivaran sin una capa alimentadora celular durante períodos de tiempo más largos, conservando la capacidad de diferenciarse y formar un epitelio estratificado. En este estudio, el nuevo método enzimático que utiliza Y-27632 aumentó en gran medida la recolección de células epiteliales al extender su vida útil y promover su capacidad proliferativa.

El método enzimático tradicional contiene dos operaciones de digestión. La primera digestión es separar el tejido epitelial del tejido conectivo utilizando dispasa, que funciona desde el lado estromal4,5. La segunda digestión suele utilizar tripsina para separar las células epiteliales del tejido epitelial4,5. Debido a la destrucción de las células epiteliales por tripsina, la eficiencia del método enzimático se ve afectada4. El nuevo método enzimático descrito aquí es un método simplificado que omite un paso de digestión. Las principales diferencias entre los métodos enzimáticos nuevos y tradicionales se refieren a los protocolos de separación del tejido epitelial del tejido conectivo5. Además, el nuevo método utiliza dispasa y colagenasa en lugar de tripsina en la etapa de digestión, y por lo tanto la integridad de las células epiteliales está bien protegida. Clínicamente, es mucho más difícil obtener la misma cantidad de tejido de la encía humana que de la piel y la mucosa bucal. El método de explante directo requirió solo pequeños trozos de tejido gingival y cultivó un mayor número de células en comparación con el método enzimático18. Tratamos una pequeña cantidad de tejido epitelial gingival utilizando el nuevo método y cosechamos una densidad celular muy satisfactoria. Esto demuestra que el nuevo método no depende de cantidades relativamente grandes de tejido que se proporcionarán inicialmente. Una posible limitación del nuevo método es que podría aparecer una pequeña cantidad (<5%) de contaminación de fibroblastos en el cultivo inicial (paso 0), pero se puede eliminar fácilmente mediante un tratamiento a corto plazo de tripsina al 0,05% como se informó previamente9.

En este estudio, CK5, CK18 y Pan-CK (CK14, CK15, CK16 y CK19) fueronpositivos (Figura 3A,C, D). Esto sugirió que las células epiteliales gingivales aisladas fueron capaces de mantener su función de membrana basal, lo que es consistente con los estudios de Orazizadeh et al.30 y Kedjarune et al.6. CK5 y CK14 se expresan por células indiferenciadas localizadas en la capa epitelial-basal. La CK19 se encuentra típicamente en el epitelio simple y en el epitelio estratificado no queratinizado31. El análisis de inmunofluorescencia de las células epiteliales gingivales (P3) obtenido mediante el nuevo método enzimático mostró que los niveles de expresión de ki67, p63 y p75NGFR fueron mayores que en las células obtenidas mediante el método de explante directo(Figura 4). Este resultado indica que el nuevo método puede mantener las propiedades de las células madre de las células epiteliales gingivales y promueve el potencial de proliferación de las células epiteliales gingivales. Nuestro estudio anterior encontró que Y-27632 mantiene el potencial de células madre epidérmicas de la piel después de la expansión8. Wang et al. encontraron que Y-27632 facilita la proliferación, migración y pluripotencia de las células madre del ligamento periodontal humano32.

En resumen, el nuevo método enzimático modificado proporciona un procedimiento simplificado y eficaz para aislar y cultivar células epiteliales primarias humanas a partir de tejido gingival adulto. Este nuevo método es más fácil, consume menos tiempo y mejora sus propiedades de células madre, y por lo tanto tiene ventajas obvias en comparación con el método de explante directo en muchos parámetros. Este método avanzado es más adecuado para producir un gran número de células epiteliales de alto potencial tanto para aplicaciones de laboratorio como clínicas.

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Disclosures

Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2019ZD36) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2019GSF108107) a X.W.; el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2018GSF118240) a J.G.; Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (2018WS163) a Z.X., y el Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (2019WS045) a J.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Names Abbreviations & Comments
Countess automated cell counter Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. BBA0218AC Automatic cell counting
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubation
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50 ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifugation
1.5 ml microcentrifuge Tubes KIRGEN 190691J For cell digestion
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Gingival epithelial  cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HGGEPCs dissociation
Dilution Medium Life Technologies 50-9701 For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HGGEPCs isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HGGEPCs isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Gene Operation IAD1011 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Dojindo Molecular Technologies CK04 For Cell proliferation assay
Rabbit Anti-Human CK18 Abcam ab82254 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 Abcam ab76318 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts
Rabbit Anti-Human pan-ck BD 550951 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-Ki67 Abcam 15580 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p63 Biolegend 619002 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs
rabbit anti-p75NGFR Abcam ab52987 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs

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References

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Bioingeniería Número 177 células epiteliales gingivales método enzimático método de explante directo aislamiento celular cultivo celular Y-27632 inhibidor de la quinasa asociada a Rho análisis de inmunofluorescencia
Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632
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