Summary
Dieses Protokoll beschreibt das Dissektionsverfahren, den Kulturzustand und die Live-Bildgebung eines Antennen-Hirn-Explantationssystems zur Untersuchung der olfaktorischen Schaltkreisanordnung.
Abstract
~ Neuronen sind präzise miteinander verbunden, um Schaltkreise zu bilden, die für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns unerlässlich sind. Das Drosophila-Geruchssystem bietet ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen, da 50 Arten von olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORNs) aus den Antennen und Oberkieferpalpen ihre Axone auf 50 identifizierbare Glomeruli im Antennenlappen projizieren und synaptische Verbindungen mit Dendriten aus 50 Arten von Projektionsneuronen zweiter Ordnung (PNs) bilden. Frühere Studien konzentrierten sich hauptsächlich auf die Identifizierung wichtiger Moleküle, die das präzise Targeting im Riechkreislauf mit festem Gewebe regulieren. Hier wird ein Antennen-Hirn-Explantationssystem beschrieben, das wichtige Entwicklungsmeilensteine der olfaktorischen Schaltkreismontage in Kultur rekapituliert. Durch das Sezieren der äußeren Kutikula und die Reinigung undurchsichtiger Fettkörper, die das sich entwickelnde Puppengehirn bedecken, können mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder einzelner Neuronen aus lebenden Gehirnen gesammelt werden. Dies ermöglicht die Zeitraffer-Bildgebung einzelner ORN-Axon-Targeting aus lebendem Gewebe. Dieser Ansatz wird dazu beitragen, wichtige zellbiologische Kontexte und Funktionen zuvor identifizierter wichtiger Gene aufzudecken und Mechanismen zu identifizieren, die dem dynamischen Prozess der Schaltungsmontage zugrunde liegen.
Introduction
Neuronen sind präzise miteinander verbunden, um Schaltkreise zu bilden, die für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns unerlässlich sind. Seit über 100 Jahren versuchen Neurowissenschaftler zu verstehen, wie sich Neuriten mit extremer Präzision auf ihre Zwischen- und Endziele ausdehnen. Infolgedessen haben sie wichtige Gene identifiziert, die Leitfäden für die Entwicklung neuronaler Prozessekodieren 1. Das olfaktorische System von Drosophila bietet ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen, da olfaktorische Rezeptorneuronen (ORNs, die primären sensorischen Neuronen) auf 50 identifizierbare Glomeruli mit stereotyper Größe, Form und relativer Position projizieren, wo sie synaptische Verbindungen mit Dendriten aus 50 Arten von Projektionsneuronen zweiter Ordnung (PNs) bilden, von denen jeder Dendriten an einen der 50 Glomeruli2 sendet (Abbildung 1A ). Daher ist es relativ einfach, mutierte Phänotypen bei synaptischer (glomerulärer) Auflösung im olfaktorischen Fliegensystem zu identifizieren. Dies führte zur Entdeckung wichtiger Gene, die die olfaktorische Schaltkreismontageregulieren 3.
Der Aufbau des olfaktorischen Flugkreislaufs beruht auf zeitlich und räumlich koordinierten Entwicklungsprozessen3. ORNs und PNs erwerben unterschiedliche Zellschicksale, die das Programm für ihre Verdrahtungsspezifika einrichten. Als nächstes mustern PN-Dendriten den Antennenlappen vor (Abbildung 1B). Die Axone von ORNs umrunden dann den ipsilateralen Antennenlappen und überqueren die Mittellinie des Gehirns, um den kontralateralen Antennenlappen zu erreichen. Anschließend dringen ORN-Axone sowohl in ipsi- als auch in kontralaterale Antennenlappen ein und bilden Synapsen mit Dendriten ihrer Partner-PNs in spezifischen Glomeruli. Dieses grobe Modell für die olfaktorische Schaltungsmontage wurde auf der Grundlage der Charakterisierung fester Proben aus Zwischenzeitpunkten während der Entwicklung vorgeschlagen. Die schlechte zeitliche Auflösung und die Unfähigkeit, den gleichen neuronalen Prozessen während der gesamten Entwicklung aus festem Gewebe zu folgen, schränken das mechanistische Verständnis des Schaltkreismontageprozesses ein.
Es ist technisch schwierig, ORN- und PN-Prozesse in vivo live abzubilden, da der Verdrahtungsprozess in der ersten Hälfte des Puppenstadiums stattfindet, wenn der Antennenlappen von einem undurchsichtigen Fettkörper im Puppengehäuse umgeben ist. Es ist daher unmöglich, den sich entwickelnden olfaktorischen Kreislauf direkt von intakten Puppen abzubilden. Ex-vivo kultiviertes seziertes Gewebe kann die Opazität des Gewebes umgehen und wurde erfolgreich zur Untersuchung der neuronalen Entwicklungeingesetzt 4,5,6. Die Herausforderung bei der Verwendung einer ähnlichen Ex-vivo-Explantationskulturstrategie zur Untersuchung der neuronalen Verdrahtung im Puppengehirn besteht darin, ob sie das genaue Neuronen-Targeting in einem Kulturzustand rekapituliert. Basierend auf einer zuvor berichteten Ex-vivo-Kulturbedingung für den Fliegenaugehirn-Komplex7 wurde kürzlich ein Explantat entwickelt, das das gesamte Puppengehirn, die Antennen und die verbindenden Antennennerven intakt enthält, das eine präzise Ausrichtung des olfaktorischen Schaltkreises beibehält und einer Zwei-Photonen-Mikroskopie-basierten Live-Bildgebung für bis zu 24 h mit einer Frequenz von jeweils 20 minunterzogen werden kann 8 . Hier wird ein detailliertes Protokoll der Explantierkultur und Bildgebung beschrieben. Das Explant-System bietet eine leistungsstarke Methode, um den Aufbau des olfaktorischen Schaltkreises und möglicherweise anderer Schaltkreise im zentralen Gehirn zu untersuchen.
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Protocol
1. Herstellung von Reagenzien
HINWEIS: Alle Schritte in diesem Protokoll werden bei Raumtemperatur (20-25 °C) durchgeführt, sofern nicht anders erklärt.
- Um die Kulturschale für die Immobilisierung des Explantats während der Zeitrafferbildgebung vorzubereiten, legen Sie 0,5 cm dickes Sylgard (vor Gebrauch zwei flüssige Komponenten im Verhältnis 10:1 gründlich mischen) auf die Unterseite einer 60 mm x 15 mm großen Petrischale und lassen Sie es bei Raumtemperatur 48 h aushärten (Abbildung 2A, im folgenden Text als Sylgard-Platte bezeichnet).
- Um Mikrostifte für die Immobilisierung des Explantats auf dieser Platte vorzubereiten, verwenden Sie eine Pinzette, um mehrere Mikrostifte auf ein Band zu kleben, wobei die scharfen Enden auf einer Seite ausgerichtet sind (Abbildung 2B). Verwenden Sie eine Schere, um ~ 2 mm von den scharfen Enden der Mikrostifte zu schneiden (Abbildung 2B'). Verwenden Sie eine Pinzette, um die geschnittenen Mikrostifte zu halten, und setzen Sie eine vorgefertigte Sylgard-Platte in die Sylgard-Schicht ein (Abbildung 2C). Zwei Mikrostifte werden verwendet, um ein Explantat zu immobilisieren.
- Verwenden Sie einen Pinsel, um weiße Puppen zu sammeln, die innerhalb von 1 h Puparium bilden, von hsFLP, Kieselstein-GAL4 / +; UAS-FRT 100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 Genotyp und Transfer auf neue Fläschchen. Hitzeschock im 37 °C Wasserbad für 40 Minuten, um spärliche ORN-Klone von zufälligen Typen zu induzieren. Nach einem Hitzeschock die Fläschchen 30 h lang auf 25 ° C stellen, was dazu führt, dass die Puppen nach der Pupariumbildung (APF) um 30 h gealtert sind.
- Um das Kulturmedium für die Explantation vorzubereiten, fügen Sie 5 ml Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) zu 500 ml Schneiders Drosophila Medium hinzu. Filtern Sie das Medium und machen Sie 45 mL Aliquots in 50 mL konischen Röhrchen. Das Medium kann 1-2 Monate bei 4 °C gelagert werden.
- Nehmen Sie am Tag der Bildgebung eine Tube mit 45 ml Drosophila-Medium von Schneider und fügen Sie 5 ml fetales Rinderserum (10% v/v), 125 μL 4 mg/ml Humaninsulinstammlösung (10 μg/ml Endkonzentration), 50 μL 1 mg/ml 20-Hydroxyecdyson-Stammlösung, gelöst in Ethanol (1 μg/ml Endkonzentration), hinzu. Mischen Sie gut und übertragen Sie 15 ml volles Medium in ein neues konisches 50-ml-Rohr. Der Rest des gesamten Mediums kann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden. Fetales Rinderserum, humane Insulinstocklösung und 20-Hydroxyecdyson-Stammlösung werden aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
- Oxygenieren Sie das 15 ml volle Medium, indem Sie Sauerstoffblasen aus einer Sauerstoffflasche unter der Flüssigkeitsoberfläche durch eine sterile 5 ml Pipettenspitze mit einer Rate von einer Blase / s für 20-30 min pumpen. Verwenden Sie eine Paraffinfolie, um die Öffnung der Tube während dieses Vorgangs abzudecken.
- Sterilisieren Sie die Oberfläche des Sezierbrunnens und die Sylgard-Platte (mit Mikrostiften, die auf die Sylgard-Schicht eingesetzt und in den Schritten A1 und A2 vorbereitet wurden) mit 70% Ethanol. Vor Gebrauch trocknen lassen.
2. Explantisierung
- Verwenden Sie eine Bürste, um 30 h APF (30 h nach Pupariumbildung) Puppen auf ein Papiertuch zu übertragen und die äußere Oberfläche der Puppen für 5 min zu trocknen.
- Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Glasschieber. Befestigen Sie die getrockneten Puppen vorsichtig auf der klebrigen Oberfläche des Bandes, wobei die Rückenseite nach oben zeigt. Drücken Sie die Puppen vorsichtig mit einem Pinsel, damit die Bauchseite der Puppen gut am Band befestigt werden kann (Abbildung 3A). Beschädigen Sie die Puppe nicht.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um braunes Puppengehäuse zu entfernen, das die dorsale Seite des Kopfes bedeckt (Abbildung 3A, B). Führen Sie eine scharfe Spitze der Pinzette zwischen der braunen Puppenkoffer und der Puppe von der Seitenseite ein und brechen Sie die braune Puppenkoffer vorsichtig durch eine Linie zum hinteren Ende der Puppe (Abbildung 3B, C). Öffnen Sie die braune Puppenhülle. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Puppe vorsichtig zu halten und mit 1 ml sauerstoffreichem Vollmedium auf die Dissektionsschacht zu übertragen. Tauchen Sie schwimmende Puppen auf die mittlere Oberfläche, damit sie auf den Boden des Bohrlochs sinken kann (Abbildung 3D).
HINWEIS: Führen Sie die Pinzettenspitze nicht zu tief in die braune Puppenhülle ein, um zu verhindern, dass die Puppe mit der Pinzette verletzt wird. - Um die Antennen-Hirn-Explantation aus der Puppe zu sezieren, verwenden Sie eine Pinzette, um die Puppe vorsichtig mit einer Hand zu halten, und schneiden Sie mit einer Mikroschere ein kleines Loch von der hinteren Seite der Puppe mit der anderen Hand (Abbildung 3E). Dieses kleine Loch löst den hohen Druck in der Puppe.
- Schneiden Sie mit der Mikroschere die ventrale Mittellinie der Puppe vom Loch bis zum Hals (die schmale Struktur, die den Kopf und den Thorax verbindet) durch (Abbildung 3F). Schneiden Sie dann den Umfang des Halses durch, um den Kopf vom Körper der Puppe zu lösen (Abbildung 3G). Entfernen Sie den Körper und legen Sie ihn in einen anderen Brunnen.
HINWEIS: Schneiden Sie den Hals nicht direkt von der dorsalen/ventralen Seite der Puppe ab, die das Gehirn zusammendrücken kann. - Schneiden Sie die transparente Kutikula ab, die die dorsale Seite des Gehirns bedeckt (Abbildung 3H). Dies wird den fetten Körper auf dem Gehirn freilegen. Bewahren Sie eine Kutikula auf, an der die Netzhaut und die Antennen befestigt sind. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang auf der ventralen Seite des Gehirns.
HINWEIS: Führen Sie die Klinge der Schere nicht zu tief unter die Kutikula ein, da dies zu einer Durchtrennung der Antennennerven führt, die die Antennen und das Gehirn verbinden (Abbildung 3H'). - Verwenden Sie eine P10-Pipette, um den Fettkörper, der das Gehirn und die Antennen bedeckt, sanft auszuwaschen, indem Sie das Medium in Richtung der offenen Regionen auf der dorsalen und ventralen Seite des Kopfes pipettieren (Abbildung 3I).
HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig beim Pipettieren des Mediums, da sich das Gehirn leicht von der Kutikula lösen kann. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Fettkörper während dieses Schritts entfernt wird. Gestoppte Entwicklung von ORN-Axonen wurde beobachtet, wenn der Fettkörper nicht gut gereinigt wurde, wahrscheinlich aufgrund eines schlechten Sauerstoffzugangs aus dem Medium. - Um die Wechselwirkung von bilateralen ORN-Axonen oder ORN-Axonen mit PN-Dendriten-Targeting zu untersuchen, trennen Sie in diesem Stadium8 einen oder zwei Antennennerven mit der Mikroschere (Abbildung 3J). Platzieren Sie vorsichtig die Klingen der Schere zwischen der Nagelhaut und dem Gehirn und durchtrennen Sie interessierte Antennennerven.
- Um das sezierte Explantat auf die Sylgard-Platte zu übertragen, legen Sie einen Tropfen sauerstoffhaltigen Vollmediums (~ 200 μL) auf die Sylgard-Oberfläche. Beschichten Sie die innere Oberfläche einer 200 μL breiten Pipettenspitze mit dem Fettkörper aus dem sezierten Stamm (Schritt 1.6), indem Sie den Fettkörper mehrmals pipettieren, wodurch verhindert wird, dass die Explantate während des Transfers die Pipettenspitze verkleben. Verwenden Sie dann diese breite Pipettenspitze, um das Explantat aus der Dissektionsvertiefung auf das mittlere Tröpfchen auf der Kulturplatte zu übertragen (Abbildung 3K).
- Verwenden Sie eine Pinzette, um das Explantat auf der Sylgard-Schicht in den beiden optischen Lappen zu befestigen (Abbildung 3L). Positionieren Sie die Sylgard-Platte vorsichtig auf der Bildgebungsstation und immobilisieren Sie die Platte mit Bändern. Fügen Sie der Sylgard-Platte langsam 10 ml sauerstoffhaltiges Vollmedium mit P1000-Pipette hinzu.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Explantat zu stören, wenn Sie das Medium zur Sylgard-Platte hinzufügen.
3. Zwei-Photonen-Mikroskopie-basierte Live-Bildgebung
- Um Zeitraffer-Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie ein Zwei-Photonen-Mikroskop, einen Ti: Saphir-Laser, ein 20-faches Wasser-Tauchobjektiv (1,0 NA) und eine Bildgebungssoftware. Verwenden Sie die Anregungswellenlänge bei 920 nm für die Abbildung von GFP-Proteinen. Stellen Sie die Verweildauer des Pixels auf 10 μs ein.
- Stellen Sie die Position der Bildgebungsstation so ein, dass sich die Explantate grob unter dem Objektiv befinden. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Linse vor der Bildgebung zu sterilisieren. Senken Sie das Objektiv langsam unter dem Medium in der Nähe der Explantate ab. Überprüfen Sie, ob sich eine Blase auf der Linse des Objektivs befindet.
- Wenn ja, heben Sie das Objektiv über das Medium und wiederholen Sie dies, bis die Blase verschwunden ist. Finden Sie die Explantate mit dem Okular und zentrieren Sie ein Explantat auf dem Feld.
- Um ein Explantat mit ein paar ORNs zu gewährleisten, die für die Zeitrafferbildgebung spärlich beschriftet sind, sezieren Sie jedes Mal ~ 10 Explantate und richten Sie sie auf der y-Achse auf der Kulturplatte aus. Sieb alle Explantationen, indem Sie das Objektiv entlang der y-Achse bewegen, und wählen Sie ein Explant, bei dem einige einzelne ORN-Axone gerade den Antennenkeule für die Bildgebung erreicht haben (Abbildung 4A).
- Erkennen Sie den Antennenlappen an seiner ovalen Form und den ORN-Axonen, die ihn zu umrunden beginnen. Abbildung eines ~150 μm x 150 μm großen Bereichs in der xy-Ebene (3-facher Zoom mit dem 20-fachen Objektiv). Schätzen Sie die Grenze der beiden Antennenlappen und zentrieren Sie sie im Bildbereich.
- Wählen Sie einen anfänglichen Bildbereich entlang der z-Achse aus, indem Sie den unteren und oberen Abschnitt des Scannens definieren. Richten Sie den Bildgebungsbereich entlang der z-Achse ein. Stellen Sie den tiefsten Abschnitt mit ORN-Axonsignalen als erste Bildgebungssitzung und die Sitzung 100 μm darüber (oberflächlichere Seite) als letzte Bildgebungssitzung ein (Abbildung 4B).
HINWEIS: Dies lässt einige Abschnitte auf der Oberseite (oberflächliche Seite) der ORN-Axone und vermeidet eine Verschiebung der ORN-Axone nach oben außerhalb des Bildgebungsbereichs aufgrund des Wachstums des Gehirns während der Kultur.- Bild in Intervallen von 2 μm. Stellen Sie das automatische Scannen der Bildgebung mit der Häufigkeit alle 20 Minuten mithilfe der Bildgebungssoftware ein.
- Verschieben Sie den Bildgebungsbereich nach der ersten 4-stündigen Bildgebung entlang der z-Achse um 20 μm nach oben und nach 16 h Bildgebung um weitere 20 μm entlang der z-Achse. Dies kann durch das Setzen eines Skripts und verschiedener z-Stacks in der Imaging-Software erreicht werden.
- Kultivieren Sie das Explantat für einen zusätzlichen Zeitraum nach der Bildgebung (bis zu 24 h ex vivo) vor der Fixierung und Färbung mit N-Cadherin, einem Neuropil-Marker, um die genetische Identität jedes einzelnen ORN durch den Glomerulus zu enthüllen, auf den es abzielt.
4. Bildverarbeitung
- Um z-Stack-Bilder aus Abschnittsserien zu verarbeiten, die zu jedem Zeitpunkt mit der Fidschi-Software aufgenommen wurden, öffnen Sie die Bildabschnittsserie und klicken Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt [/].
- Um die seitliche Drift der Probe während der Kultur zu korrigieren, installieren Sie das TurboReg Plugin in Fidschi.
- Öffnen Sie eine z-Stack-Image-Serie und ein einzelnes z-Stack-Image aus der Serie. Plugins | öffnen Registrierung | TurboReg.
- Wählen Sie die z-Stack-Bildserie in der Quelle und das einzelne z-Stack-Bild in der Ziel-| aus Übersetzung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Batch, um alle Bilder aus der geöffneten z-stack-Bildserie zu registrieren.
- Um den Nutzen von abgebildeten Proben zu maximieren, trennen Sie spärlich beschriftete einzelne Axone in der Nähe voneinander von den z-Stack-Bildern, die 3D-Bildschnitten folgen.
- Um einzelne ORN-Axone aus einigen Axonen im selben Bild zu extrahieren, öffnen Sie die Bildabschnittsreihe, klicken Sie auf Plugins | Segmentierung | Segmentierungs-Editor [/]. Wählen Sie das Pinselwerkzeug aus und maskieren Sie das interessierte ORN-Axon im Arbeitsfenster des Segmentierungseditors, indem Sie die Schaltflächen "+" oder "-" für jeden Bildausschnitt auswählen.
- Klicken Sie auf Process | Bildrechner [/]. Wählen Sie "Bild X" in Bild 1, "Multiplizieren" in Betrieb, "Bild X. Beschriftungen" in Bild 2, [/]. Dadurch wird eine neue Bildseriendatei nur mit dem interessierten Axon erzeugt. Führen Sie Schritt 4.1 aus, um das z-Stack-Image zu verarbeiten. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Zeitpunkte, um eine Zeitreihenbilddatei zu generieren.
- Um verschiedene Axone aus demselben Bild zu pseudofärben, führen Sie zunächst Schritt 4.3 aus, um die Zeitreihenbilddatei jedes Axons separat zu generieren. Öffnen Sie die Zeitreihenbilddateien für verschiedene einzelne Axone aus demselben Rohdatenbild. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Kanäle zusammenführen. Wählen Sie verschiedene Zeitreihenbilddateien in verschiedenen Farbkanälen aus und klicken Sie auf OK.
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Representative Results
ORN-Axone kommen zwischen 18 h und 36 h APF am Antennenlappen an. Sie navigieren dann durch den Antennenlappen, überqueren die Mittellinie und innervieren die Glomeruli. Video 1 ist ein repräsentatives Video , das den gesamten Prozess für mehrere einzeln identifizierbare Axone zeigt, aufgenommen mit einer Frequenz von 20 Minuten für 24 Stunden. Vor der Registrierung mit TurboReg zeigen die Axone eine gewisse seitliche Drift, wenn sich das Gehirn entwickelt (erste Hälfte des Videos). Nach der Registrierung wird das Driften korrigiert (zweite Hälfte des Videos).
Um einige ORN-Axone vom gleichen Explantat zu trennen, ist ein Beispiel in Abbildung 5 dargestellt. Nach dem Verfahren in Schritt 4.3 wurden VA1d- und VA1v-Axone aus Explant, wie in Abbildung 5A gezeigt, extrahiert, um ein neues Z-Stack-Bild mit nur diesen beiden Axonen zu erzeugen (Abbildung 5B). In ähnlicher Weise wurden VM2- und VM3-Axone (Abbildung 5B') und DL2-Axon (Abbildung 5B'') extrahiert. Abbildung 5C zeigt eine Zusammenführung von Bildern in Abbildung 5B-B'' mit Pseudofarben. Die genetischen Identitäten jedes ORN-Axons wurden durch Immunfärbung eines Neuropil-Markers N-Cadherin des fixierten Explantons aufgedeckt (Abbildung 5D,E).
Abbildung 1: Struktur des olfaktorischen Fliegenkreislaufs. (A) Ein erwachsener Fliegenkopf ist mit einem ORN aus den rechten Antennen (grün) zu sehen, der sein Axon an beide Antennenlappen (ALs) im Gehirn sendet und eine synaptische Verbindung in einem spezifischen Glomerulus mit Dendriten von PNs (rot) in den ipsilateralen und kontralateralen ALs bildet. Gestrichelte vertikale Linie zeigt die Mittellinie in diesem und nachfolgenden Diagrammen und Bildern an. (B) Diagramm, das die Entwicklung der olfaktorischen Schaltung zeigt. (1) PN-Dendriten innervieren zunächst eine Region im Antennenlappen (rot). ORN-Axone erreichen die Antennenlappen im Gehirn. (2) ORN-Axone nehmen entweder eine dorsolaterale (grüne) oder ventromediale (blaue) Flugbahn, um den Antennenlappen zu umrunden. (3) ORN-Axone überqueren die Mittellinie. (4) ORN-Axone innervieren Glomeruli im Antennenlappen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vorbereitung der Bildgebungskammer für das Explant. (A) Legen Sie eine Schicht Silikonelastomer (~0,5 cm) auf den Boden einer 60 mm Petrischale. (B-B') Richten Sie die Stifte auf einem Band aus und schneiden Sie sie mit einer Schere auf eine Länge von ~ 2 mm. (C) Heften Sie die Mikrostifte auf die Silikonelastomerschicht der Kulturplatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Das Dissektionsverfahren für die Antennen-Hirn-Explantation. (A) Befestigen Sie die ventrale Seite einer papiergewebegetrockneten Puppe auf einem doppelseitigen Klebeband auf einem Glasobjektträger. (B-C) Verwenden Sie eine Pinzette, um die äußere braune Kutikula zu schneiden, um die Puppe im Inneren freizulegen. (D) Die Puppe in eine Dissektionsquelle mit sauerstoffreichem Vollmedium überführen. (E-G) Trennen Sie den Puppenstamm vorsichtig mit einer Mikroschere vom Kopf. (H) Schneiden Sie die Stücke der halbtransparenten Kutikula ab, die die dorsale und ventrale Seite des Gehirns bedeckt. Halten Sie etwas Kutikula auf der vorderen und lateralen Seite des Gehirns, um Verbindungen zwischen der Netzhaut, den Antennen und dem Gehirn aufrechtzuerhalten. (H') Vermeiden Sie es, den Antennennerv während dieses Schritts zu durchtrennen. (I) Reinigen Sie den Fettkörper, der das Gehirn bedeckt, durch sanftes Pipettieren. (J) Durchtrennen Sie in bestimmten Experimenten einen oder zwei Antennennerven mit einer Mikroschere. (K) Geben Sie einen Tröpfchen sauerstoffhaltigen Vollmediums auf die Oberfläche der Kulturplatte. Übertragen Sie das sezierte Explantat mit einer breiten Pipettenspitze. (L) Verwenden Sie eine Pinzette, um die beiden optischen Lappen des Explants auf die Silikonelastomerschicht zu heften. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Zeitraffer-Bildgebung einzelner ORN-Axon-Targeting aus einem Explant . (A) Wählen Sie ein Explantat mit einigen ORN-Axonen, die gerade den Antennenlappen erreichen. Schätzen Sie die Form von zwei Antennenlappen durch die Krümmung der Axone und zentrieren Sie die Antennenlappen im Bildfeld. (B) Legen Sie den Bildbereich entlang der z-Achse fest. Bedenken Sie, dass sich der Antennenlappen nach oben verschiebt, wenn das Gehirn wächst und sich entwickelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Extrahieren Sie einzelne ORNs und zeigen Sie ihre glomerulären Identitäten an. (A) Ein maximales Projektionsbild eines Explantats mit 5-10 einzelnen ORN-Axonen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie mit 20-fachem Objektiv und 3-fachem Zoom. (B-B'') 1-2 einzelne Axone werden aus (A) extrahiert, indem aus den Rohbilddaten manuell Masken in Bildausschnitten erstellt werden. (C) Führen Sie die Bilder von (B-B'') mit jedem Axon zusammen, das anders gefärbt ist. (D-D') Konfokale Bilder mit maximaler Projektion, aufgenommen mit 40-fachem Objektiv und 1,5-fachem Zoom. Das in (A) gezeigte Explantat wurde fixiert, gefolgt von einer Färbung mit Anti-GFP und Anti-N-Cadherin (Neuropil-Marker). Vordere und hintere Hälften der Antennenlappen sind Stapel getrennt in (D) und (D'). (E) Die Antennenlappenkarte zeigt extrahierte ORN-Axone in (B,C). Einige der in dieser Abbildung gezeigten Bilder wurden gegenüber einer früheren Studie8 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Auf Zwei-Photonen-Mikroskopie basierende Zeitrafferbilder zeigen das Targeting von zwei ORN-Axonen vor und nach der Bildregistrierung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Das Drosophila-Antennen-Hirn-Explantat behält das normale Targeting des olfaktorischen Schaltkreises bei. Wir haben festgestellt, dass die Entwicklung ex vivo im Vergleich zu in vivo 2-mal langsamer ist. Es wird darauf hingewiesen, dass das Explantationssystem den Oberkieferpalp, der sechs Arten von ORNs beherbergt, nicht beibehält. Um sicherzustellen, dass die normale Entwicklung ex vivo rekapituliert wird, muss eine Dehnung der Antennennerven während der Explantissektion vermieden werden. Während der Ex-vivo-Kultur verursacht das Wachstum von Bakterien in der Regel eine gestoppte Entwicklung des Riechkreislaufs. Daher ist es wichtig, die Kulturschale und die Stifte vor der Bildgebung gründlich zu sterilisieren und den Bildgebungsraum sauber und isoliert zu halten.
Dieses Explantat unterstützt die Langzeit-Zwei-Photonen-Mikroskopie, die auf Zeitraffer-Bildgebung basiert. In Kombination mit einem neu entwickelten Reporter für die spärliche Beschriftung einzelner ORNs ermöglicht das Explantationssystem eine hochauflösende Bildgebung von einem einzelnen Axonendpunkt. Dieses System ist leistungsfähig, um die zellbiologischen Mechanismen zu untersuchen, die dem dynamischen Prozess der olfaktorischen Schaltkreismontage zugrunde liegen8. Obwohl hier als Beispiel die Entwicklung olfaktorischer Schaltkreise gezeigt wurde, kann dieses System möglicherweise auf Studien anderer Schaltkreise oder anderer Entwicklungsprozesse im sich entwickelnden zentralen Gehirn erweitert werden.
Das Explantat behält die normale Entwicklung in Kultur für mindestens 24 Stunden bei, wodurch der gesamte Prozess des ORN-Targetings erfasst werden kann. Es ermöglicht Forschern, die genetische Identität einzelner ORN-Axone durch Gegenfärbung mit einem Neuropil-Marker nach der Fixierung aufzudecken, da der Antennenlappen bereits am Ende der Kultur eine offensichtliche glomeruläre Struktur entwickelt. Diese Strategie umgeht das Problem, dass spezifische genetische Treiber für viele ORN-Typen in einem frühen Entwicklungsstadium fehlen, um die Bildgebung bestimmter Arten von ORNs mit einem Pan-ORN-Treiber zu erreichen.
Um eine höhere raumzeitliche Auflösung zu erreichen, kann dieses Explantationssystem mit einer fortschrittlicheren Mikroskopie, der adaptiven Optik-Gitter-Lichtblattmikroskopie (AO-LLSM), abgebildet werden. Es hat sich gezeigt, dass der AO-LLSM die Visualisierung von Feinstrukturen von Axonklemmen und der Abtastfrequenz bei jeder 30 Sekunde pro Volumen 8,9,10,11 ermöglicht. Ein Vorteil des Explants ist seine Kompatibilität mit der Markierung des Janelia-Fluorophorfarbstoffs12,13,14, indem das Explant, das den Halo-Tag in bestimmten Neuronen mit Farbstoffen im Medium exprimiert, vor der Bildgebung inkubiert wird. Es wurde festgestellt, dass die Inkubation des Explants mit farbstoffhaltigem Medium zu einer viel stärkeren Markierung führt als die Fütterung der Larven mit dem Farbstoff. Dieser einzigartige Vorteil ermöglichte es uns, Axone in einem frühen Entwicklungsstadium abzubilden, das durch die GFP-Kennzeichnung8 kaum visualisiert wurde.
Neben der Zeitrafferbildgebung hat das Explant-System weitere Vorteile. Beispielsweise ist es möglich, Antennennerven zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten einseitig oder bilateral vom sezierten Explantat zu trennen (Schritt 2.8). Dies ermöglicht es den Forschern, die Anforderung von ORN-Axonen beim Targeting von Neuronentypen im olfaktorischen Schaltkreis bei verschiedenen Entwicklungsschritten zu untersuchen. Insbesondere einseitige Antennennervendurchtrennungsassays, die durch traditionelle genetische Manipulation nicht erreicht werden können, führten zu einer interessanten Entdeckung, dass eine Interaktion zwischen bilateralen ORN-Axonen für ein korrektes kontralaterales Targeting von ORN-Axonenerforderlich ist 8. Darüber hinaus wird das Explantat direkt in Medium kultiviert, anstatt in Agarose eingebettet zu sein, was eine schnelle Abgabe und Auswaschung einiger kleiner Moleküle oder Medikamente ermöglicht. Im Vergleich zur Genmanipulation hat die medikamentöse Behandlung die Vorteile einer schnellen Wirkung und Reversibilität der Manipulation. Es ermöglicht Forschern, einige essentielle Prozesse für Zellen in späteren Entwicklungsstadien zu bewerten, indem sie Zellletalität oder ungesunde Probleme aufgrund von konstitutiven Störungen durch genetische Manipulationen umgehen. Es hilft auch bei der Visualisierung subtiler Veränderungen durch Vergleich vor und nach der medikamentösen Behandlung und nach dem Auswaschen von Medikamenten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken N. Özel und R. Hiesinger für ihre Ratschläge zur Explantationskultur; M. Wagner für die technische Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie; D.J. Luginbuhl zur Erzeugung transgener Fliegen; D. Friedmann für Anregungen zur Fidschi-Softwareanalyse; Y. Ge für Unterstützung bei der Fliegenarbeit; C. McLaughlin und K.K.L. Wong für Kommentare zum Manuskript. L.L. ist ein Ermittler des Howard Hughes Medical Institute. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health 1K99DC01883001 (an T.L.) und R01-DC005982 (an L.L.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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