Overvågning i realtid af mitokondriel respiration i cytokindifferentierede humane primære T-celler

Summary

Metabolisk tilpasning er grundlæggende for T-celler, da det dikterer differentiering, persistens og cytotoksicitet. Her præsenteres en optimeret protokol til overvågning af mitokondriel respiration i ex vivo cytokindifferentierede humane primære T-celler.

Abstract

Under aktivering tilpasser metabolismen af T-celler sig til ændringer, der påvirker deres skæbne. En stigning i mitokondriel oxidativ phosphorylering er uundværlig for T-celleaktivering, og overlevelsen af hukommelse T-celler er afhængig af mitokondriel ombygning. Dette påvirker derfor det langsigtede kliniske resultat af kræftimmunterapier. Ændringer i T-cellekvalitet studeres ofte ved flowcytometri ved hjælp af velkendte overflademarkører og ikke direkte ved deres metaboliske tilstand. Dette er en optimeret protokol til måling af mitokondriel respiration i realtid af primære humane T-celler ved hjælp af en ekstracellulær fluxanalysator og cytokinerne IL-2 og IL-15, som forskelligt påvirker T-cellemetabolismen. Det er vist, at T-cellernes metaboliske tilstand klart kan skelnes ved at måle iltforbruget, når de hæmmer nøglekomplekser i den metaboliske vej, og at nøjagtigheden af disse målinger er meget afhængig af optimal inhibitorkoncentration og inhibitorinjektionsstrategi. Denne standardiserede protokol vil hjælpe med at implementere mitokondriel respiration som en standard for T-celle fitness i overvågning og undersøgelse af kræftimmunterapier.

Introduction

Korrekt T-celleudvikling og -funktion er afgørende for immunsystemets evne til at genkende og reagere på antigener. Mitokondriel oxidativ phosphorylering (OxPhos) ændres i henhold til T-cellens tilstand. Naive T-celler bruger overvejende OxPhos til at producere ATP, mens aktiverede T-celler gennemgår en metabolisk overgang, hvor glykolyse bliver ^dominerende1. Efter effektorfasen vender den lille resterende delmængde af hukommelseS-T-celler tilbage til en metabolisk tilstand domineret af ^OxPhos2,3. Ændringerne af OxPhos følger differentieringen af T-celler i en sådan grad, at selv delmængder af T-celler kan differentieres ved deres specifikke er OxPhos ^egenskaber1. Omvendt er OxPhos vigtig for T-cellernes funktion, og hæmning af OxPhos har vist sig at blokere for spredning og cytokinproduktion af T-celler4. Derfor er evnen til at kvantificere egenskaberne af T-celle OxPhos på en præcis og reproducerbar måde et kraftfuldt værktøj for alle, der arbejder med T-celler.

I denne protokol måles egenskaberne af T-celle OxPhos ved hjælp af en ekstracellulær fluxanalysator. Kernefunktionen i denne analysator er kontinuerligt at måle iltindholdet i vækstmediet i de celler, der skal analyseres. Ilt fjernet fra vækstmediet antages at blive optaget af cellerne. Ved at behandle cellerne med en række OxPhos-hæmmere eller modifikatorer er et fald i iltoptagelsen forbundet med den hæmmede eller modulerede funktion. For eksempel vil hæmning af ATP-syntasen føre til en reduceret cellulær optagelse af ilt, som ellers ville blive brugt til at producere ATP ved oxidativ phosphorylering. Andet udstyr, herunder Clark-elektroden og Oroboros-instrumentet, tilbyder lignende funktionalitet, og hvert instrument har forskellige fordele og mangler. En bred vifte af celletyper kan bruges til undersøgelser i disse enheder, men en særlig udfordrende celletype er humane primære T-lymfocytter5. På grund af deres lille størrelse, dårlig overlevelse ex vivo og ikke-klæbende egenskaber kan humane primære T-celler være udfordrende at studere.

Dette er en protokol til undersøgelse af mitokondriel respiration af humane primære T-celler af en ekstracellulær analysator. Protokollen er opdelt i et optimeringsløb, hvor optimale koncentrationer af celletal pr. brønd samt den optimale koncentration af oligomycin og FCCP bestemmes. Desuden et Assay-løb, hvor de optimerede betingelser anvendes.

Ved hjælp af blodafledte humane PBMC'er og ex vivo primære T-cellekulturer demonstrerer denne protokol vigtigheden af optimal inhibitorkoncentration og relevansen af at anvende separat i stedet for en sekventiel injektion af mitokondrielle hæmmere, når man arbejder med følsomme celletyper. Endelig er det påvist, at dette assay robust kan detektere subtile forskelle i mitokondriel respiration ved polarisering med cytokiner IL-2 og IL-15.

Protocol

Forsøgene er gennemført efter retningslinjer fra Herlev Hospital og Region Hovedstaden.

BEMÆRK: Denne protokol indeholder instruktioner til både en optimeringskørsel og en analysekørsel. Det er tydeligt skrevet i teksten, når instruktionerne er til en optimeringskørsel eller en analysekørsel. Kør en optimeringskørsel, før du fortsætter med Assay-kørslerne

1. Mononukleært (PBMC) isolering af humant perifert blod fra buffy coats

1. PBMC isolation
   1. Saml buffyfrakker fra den relevante institution (opsamlet i blodopsamlingsposer). Buffy frakker stammer fra raske donorer. Ekskluder donorer, der for nylig har brugt smertestillende midler.
   2. Sprøjt blodopsamlingsposen, der indeholder buffy coaten, med 70% ethanol, inden den overføres til et laminært flowskab. Brug altid sterile teknikker og steril hardware til alle trin
      BEMÆRK: Sørg for, at der opnås de korrekte tilladelser til håndtering af humane blodprøver.
   3. Overfør blodet til et sterilt 50 ml centrifugerør.
   4. Fortynd blodet mindst 10% med ikke-suppleret RPMI 1640.
   5. Hæld 20 ml af det foretrukne densitetsgradientmedium i et 50 ml centrifugerør.
   6. Aspirat 25 ml af det fortyndede blod i en serologisk pipette. Indstil den elektriske pipetteregulator til den laveste hastighed.
   7. Hold røret med densitetsgradientmedium i en vinkel på 45°, og læg den serologiske pipettespids på indersiden af 50 ml centrifugerøret. Slip langsomt 25 ml af det fortyndede blod fra den serologiske pipette.
   8. Sørg for, at det fortyndede blod og densitetsgradientmediet ikke blandes. Sørg for, at det fortyndede blod hviler oven på densitetsgradientmediet.
   9. Gentag dette med efterfølgende densitetsgradient medium rør, indtil alt fortyndet blod er behandlet.
   10. Flyt forsigtigt rørene til en centrifuge og centrifuge ved 1000 x g i 30 minutter i en udsvingsrotor ved stuetemperatur (RT). Sørg for, at accelerationen og bruddet er på et minimum.
       BEMÆRK: Efter centrifugering skal forskellige lag være synlige. Det øverste, klare lyserøde til orange lag består af blodplasma og blodplader. Det midterste hvide lag består af PBMC'erne efterfulgt af et klart lag, der består af densitetsgradientmediet, og endelig et mørkerødt lag i bunden med røde blodlegemer.
   11. Brug en steril Pasteur-pipette til forsigtigt at aspirere det PBMC-holdige hvide lag til et 50 ml centrifugerør.
       BEMÆRK: Sørg for ikke at overføre densitetsgradientmediet, da dette vil påvirke nedstrøms rensning. Overskydende plasma vil ikke påvirke resultaterne.
   12. Pool alle indsamlede PBMC'er i det samme 50 ml centrifugerør og på op til 50 ml med RPMI 1640.
   13. Centrifugering af cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved RT (udfør de resterende centrifugeringstrin ved denne indstilling, medmindre andet er angivet).
   14. Aspirer supernatanten og resuspend cellerne i 30 ml RPMI 1640. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletæller.
   15. Til kryopræservering skal der genudsættes maksimalt 30 millioner celler pr. 1 ml frysemedium.
   16. Overfør cellerne til kryorør og frys indtil -80 °C ved hjælp af en hastighedsstyret frysebeholder (-1 °C pr. minut). Ved langtidsopbevaring skal PBMC'erne flyttes til -140 °C.
       BEMÆRK: Begræns den tid, cellerne er i frysemediet ved RT. På RT er DMSO meget giftig for celler.

2. Dyrkning af aktiverede humane primære T-lymfocytter

1. Optøning af celler (dag 1)
   1. Forvarm 10 ml RPMI 1640 pr. prøve til ca. 37 °C.
   2. Tag det ønskede antal celleampuler og opbevar dem midlertidigt på tøris.
   3. Resuspend de frosne celler i 10 ml forvarmet RPMI 1640.
   4. Centrifugering af cellerne i 5 min ved 500 x g ved RT.
   5. Supernatanten kasseres, og cellerne vaskes igen ved at genbruge i 10 ml RPMI 1640 og centrifuge som beskrevet i 2.1.4.
   6. Kassér supernatanten, og resuspend cellerne ved 2 x ¹⁰⁶ celler pr. ml X-VIVO 15-medium + 5% humant serum (herefter: T-cellemedium).
   7. Plade 2 ml af cellerne pr. brønd i en cellekulturplade med 24 brønde og inkuberes natten over ved 37 °C og 5 % _CO2.
2. Aktivering af celler (dag 0)
   1. Vask CD3 / CD28 perler ved at overføre 12,5 μL perler pr. 1 million celler til et mikrocentrifugerør. Tilsæt 12,5 μL PBS pr. 12,5 μL perler.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at hvirvle hætteglasset med perler inden brug.
   2. Anbring mikrocentrifugerøret på en passende magnet i 1 min.
   3. Kassér bufferen, og genophænd perlerne i det oprindelige volumen T-cellemedium (12,5 μL T-cellemedium pr. 12,5 μL af det oprindelige volumen perler).
   4. Tilsæt 12,5 μL perler pr. Million celler svarende til et forhold på 1:2 (perler: celler).
   5. Opdel cellerne i to tilstande med omkring 5 millioner celler i hver.
   6. Tilsæt det korrekte volumen cytokiner til betingelserne som nævnt i tabel 1.
   7. Inkuber cellerne i 3 dage ved 37 °C og 5 % _CO2.
3. Dyrkning af celler (dag 3 og 5)
   1. Resuspend cellerne og opdel dem ved at overføre halvdelen af volumenet fra hver brønd til en ny brønd. Tilsæt det samme volumen frisk T-cellemedium til hver brønd.
   2. Tilføj nye cytokiner til hver tilstand som nævnt i tabel 1.

3. Ekstracellulært fluxassay

1. Hydrering af sensorpatronen (dag 0)
   1. Pak sensorpatronen ud, og fjern forsigtigt sensorpatronen fra værktøjspladen.
   2. Placer sensorpatronen på hovedet, og pas på ikke at røre ved sensorproberne.
   3. Fyld værktøjspladen med 200 μL kalibrant (se Materialetabel for detaljer), og sæt forsigtigt sensorpatronen tilbage i værktøjspladen.
   4. Alternativt, for at eliminere enhver bobledannelse, skal du inkubere sensorpatronen i sterilt ultrarent vand natten over og erstatte det med et forvarmet calibrant om morgenen af assayet.
   5. Inkuber sensorpatronpladen ved 37 °C i et ikke-CO2-reguleret varmeskab natten over.
      BEMÆRK: Det er meget vigtigt at bruge et ikke-CO2-reguleret skab, da overskydende _CO2 vil påvirke sensorpatronen. Sørg for, at Fluxanalysatoren (se Materialetabel for detaljer) er tændt mindst en dag før brug, så den kan varme op til 37 °C.
2. Cellebelægning og fremstilling af mitokondrielle hæmmere (dag 1)
   1. Der fremstilles en belægningsopløsning (se materialetabellen) indeholdende _NaHCO3 (pH 8,3, 0,1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/ml, 48 μL) og NaOH (1,0 M, 24 μL).
      BEMÆRK: Belægningsopløsning skal altid fremstilles og bruges frisk.
   2. Åbn en frisk XF-cellekulturplade, og tilsæt 12 μL af den frisklavede belægningsopløsning til hver brønd. Sørg for jævn fordeling af belægningsopløsningen i bunden af alle brøndene.
   3. Inkuber pladen ved RT med låget på i 30 minutter og kassér den resterende flydende opløsning fra alle brøndene.
   4. Vask pladen med 200 μL sterilt vand og kassér væsken.
   5. Vask pladen med 200 μL steril PBS af cellekulturkvalitet og kassér væsken.
   6. Lad pladen stå ved RT og lad den tørre i mindst 30 min.
3. Plade T-celler i XF-cellekulturpladen (dag 1)
   1. Forbered 50 ml assaymedier ved at blande egnede XF RPMI-medier med glucose, pyruvat og glutamin i henhold til eksperimentel opsætning (Anbefalede niveauer: 4 mM glucose, 1 mM pyruvat og 3 mM glutamin).
   2. Opvarm til 37 °C i en ikke-CO2-reguleret inkubator, og sæt pH til 7,4. Sørg for, at der er tilstrækkelige medier til plettering af celler og fremstilling af oligomycin- og FCCP-opløsninger (punkt 3.4).
   3. Design et pladelayout med et stigende antal celler pr. brønd til optimeringskørsel eller analysekørsel. Brug fire 4 brønde, fyldt med medier og injiceret med medier, til baggrundsmålinger.
   4. T-celler fremstillet i punkt 2.3 (ved den foretrukne metode) og pipette det korrekte antal celler til hver brønd i XF-cellekulturpladen belagt med belægningsopløsningen i henhold til pladens layout.
      BEMÆRK: Det endelige volumen af hver brønd kan variere, men skal være nok til at dække bunden af brønden.
   5. Centrifugering af XF-cellekulturpladen ved 1000 x g ved RT i 10 minutter for at klæbe T-cellen til den belagte overflade.
   6. Vask cellerne med 200 μL assaymedier, kassér mediet og tilsæt 180 μL assaymedier.
      BEMÆRK: Kontroller brøndene visuelt ved hjælp af et omvendt lysmikroskop for at sikre, at cellerne er fastgjort og jævnt fordelt over brøndoverfladen.
   7. Inkuber XF-cellekulturpladen i det ikke-CO2-regulerede varmeskab i 30 minutter for at sikre, at pladens temperatur er 37 °C.
4. Ilægning af sensorpatron med oligomycin og FCCP til optimeringskørsel (dag 1)
   BEMÆRK: Hvis oligomycin- og FCCP-koncentrationerne allerede var optimeret, skal du fortsætte i pkt. 3.5.
   1. Arbejdsløsninger af oligomycin og FCCP forberedes i analysemedier (udarbejdet i trin 3.3.1) som beskrevet i trin 3.4.2 og 3.4.3.
   2. Oligomycin-arbejdsløsninger: Forbered 5 μM-opløsning (2 ml assaymedie + 10 μL 1 mM oligomycinstamme) og 3 μM-opløsning (8 ml assaymedie + 24 μL 1 mM oligomycinlager).
   3. FCCP-arbejdsløsning: Forbered 2 μM-opløsning (2 ml assaymedie + 13,2 μL 300 μM FCCP-lager) og en 1,3 μM-opløsning (8 ml assaymedie + 34,6 μL 300 μM FCCP-lager)
   4. Læg arbejdsløsningerne for enten oligomycin eller FCCP i sensorpatronens indsprøjtningsporte (tabel 2).
      SEDDEL. Det er vigtigt, at ingen injektionsporte kun indeholder luft. Hvis der af en eller anden grund ikke anvendes alle injektionsporte, skal tomme porte fyldes med analysemedier.
   5. Bank forsigtigt pladens kanter på bordet for at fjerne potentielle bobler i injektionsportene.
5. Ilægning af sensorpatron med oligomycin, FCCP og antimycin A til analysekørsel (dag 1)
   1. Opløsninger af oligomycin, FCCP i analysemedier (fremstillet i trin 3.3.1) fremstilles i overensstemmelse med de optimale koncentrationer, der er identificeret i en tidligere optimeringskørsel. Forbered også en 20 μM antimycin A-opløsning.
   2. Læg 20 μL enten oligomycin eller FCCP i sensorpatronens indsprøjtningsport A i henhold til pladens layout. Der tilsættes 22 μL 20 μM antimycin A til injektionsport B i alle brønde. Den resulterende koncentration af antimycin A, når den er injiceret i brønden, vil være 2 μM.
6. Opsætning af eksperimentel protokol i Flux-analysatorsoftware.
   1. Tildel grupperne og pladekortet for hver betingelse pr. pladelayout.
   2. Design protokollen i henhold til injektionsstrategien (tabel 3 og figur 1).
      BEMÆRK: Ved kørsel af assaykørsler kan injektion C og D udelades.
   3. Gem analyseopsætningen, udfyld de oplysninger, der kræves for at blive inkluderet til analysen, og tryk på Start.
   4. Fluxanalysatoren beder om den sensorpatron, der er fremstillet i afsnit 3.5. Fjern låget, og isæt sensorpatronen som anvist af analysatoren.
      BEMÆRK: Analysen kalibrerer og kontrollerer sensorer, der er angivet med flueben. Efter en vellykket kalibrering vil analysatoren anmode om XF-cellekulturpladen, der er fremstillet i punkt 3.3. Brugspladen skubbes ud af analysatoren og erstattes med XF-cellekulturpladen for at starte analysen.

Representative Results

En korrekt bestemmelse af OxPhos egenskaber er et uundværligt værktøj, når man studerer T-celler. Men hvis analysebetingelserne ikke er optimeret, er der en betydelig risiko for vildledende eller fejlagtige resultater. I denne protokol er der et stærkt fokus på optimering af celletal pr. brønd og koncentrationer af oligomycin og FCCP, der skal anvendes. I den beskrevne opsætning tilsættes oligomycin og FCCP trinvist til den samme brønd, hvilket øger koncentrationen af mitokondriemodulatorerne. Den optimale koncentration af oligomycin og FCCP kan bestemmes ud fra de resulterende OCR-kurver for brøndene som koncentrationen, hvor et plateau nås.

I det repræsentative løb tilsættes oligomycin i en stigende koncentration og hæmmer ATP-syntase (kompleks V i elektrontransportkæden), hvilket resulterer i nedsat mitokondriel respiration. Et plateau i OCR nås, efter at den akkumulerende koncentration af brøndene nåede 1 μM. Fra denne koncentration og stigende koncentrationer blev OCR ikke reduceret yderligere (figur 1A). For brønde, der blev behandlet med en trinvis koncentration af afkoblings-FCCP, steg OCR-niveauerne som forventet, indtil de nåede et plateau, efter at der var tilsat 0,2 μM FCCP, hvilket indikerer, at der ved denne koncentration blev opnået fuld afkobling (figur 1B). En optimering af celler belagt pr. Brønd er vigtig for et korrekt og reproducerbart assay. Hvis det anvendte celletal er for lavt, er niveauet af ilt, der fjernes fra assaymediet af cellerne, for lavt til at blive målt korrekt af analysatoren. På den anden side, hvis antallet af celler pr. Brønd er for højt, kan cellernes iltforbrug blive så højt, at systemet ikke kan genopfylde iltniveauerne i analysemediet efter hver måling, hvilket fører til et stadig mere hypoxisk miljø og fejlagtig OxPhos-karakterisering.

I det repræsentative løb blev celler podet med en tæthed på 200.000 og 400.000 celler pr. Brønd (figur 2A-C). For et løb med 200.000 celler er den oprindelige OCR cirka halvdelen af et løb med 400.000 celler pr. Brønd. Til FCCP-behandling er maksimal OCR 61,6 pmol / min (200,000 celler) versus 190,4 pmol / min (400,000 celler). Efter oligomycinbehandling kollapser OCR i løbet med 200.000 celler til encifret OCR (6,4 pmol / min). Dette er lavere end OCR i løbet, med 400.000 celler pr. Godt behandlet med oligomycin (henholdsvis 25,8 pmol / min).

Derfor er det klart fra optimeringskørslen, at der kræves et celleantal på 400.000 celler pr. Brønd til fremtidige assays ved hjælp af 1 μM oligomycin og 0,2 μM FCCP. I den klassiske opsætning, der anbefales af producenten, tilsættes oligomycin og FCCP sekventielt med den endelige tilsætning af antimycin A. For T-celler er dette ikke den optimale fremgangsmåde, da oligomycinbehandlingen kan ses at begrænse afkoblingen efter FCCP-behandling (figur 3A,B). I denne præsenterede metode anbefales det at køre hver tilstand i duplikatbrønde og behandle den ene brønd med oligomycin og den anden med FCCP med en endelig tilsætning af antimycin A til begge brønde. Ved at anvende denne fremgangsmåde påvirker oligomycinbehandlingen ikke OCR efter FCCP-behandling. Denne fremgangsmåde gør det muligt at bestemme de samme mitokondrielle egenskaber som den klassiske opsætning, hvor lægemidler tilsættes i rækkefølge (figur 3C)

Endelig blev det undersøgt, om virkningerne af cytokiner IL-2 og IL-15 kunne differentieres på metabolismen af ex vivo-dyrkede humane primære T-celler. Il-15-dyrkede celler havde faktisk højere maksimal respiration og ledig åndedrætskapacitet, som det er blevet vist ^før1 (figur 4A-E). Basal respiration og ATP-produktion blev ikke påvirket. Samlet set viser disse data, at mitokondrieåndedræt af ex vivo-dyrkede humane primære T-celler med succes kan analyseres ved hjælp af den ekstracellulære fluxanalysator.

Figur 1: Oxygenforbrugshastighed (OCR) målt under titrering af hæmmere oligomycin og FCCP i ex vivo-dyrkede humane primære T-celler. (A) OCR under trinvis titrering af oligomycin fra 0-1,25 μM endelig koncentration. B) OCR under trinvis titrering af FCCP fra 0-0,5 μM endelig koncentration. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Cellekoncentrationens indflydelse på OCR-målinger i ex vivo-dyrkede humane primære T-celler. OCR-målinger af ex vivo-dyrkede humane primære T-celler med 200.000 eller 400.000 celler pr. brønd efter injektion af enten (A) FCCP eller (B) Oligomycin. (C) Basal respiration, maksimal respiration, ATP-produktion og ledig åndedrætskapacitet af humane primære T-celler ved hjælp af 200.000 eller 400.000 celler pr. Brønd. Repræsentant for tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Enkelt eller sekventiel injektion af mitokondrielle modulatorer. (A) Repræsentative OCR-målinger under baseline og efter injektion af oligomycin og FCCP (a,b) eller antimycin A (c) som enkelt individuelle injektioner eller som sekventielle injektioner. (B) OCR-værdier før injektion (basal respiration) eller efter injektion af oligomycin eller FCCP som enkeltinjektioner eller sekventielle injektioner. C) Skematisk gengivelse af injektions- og målestrategien. Repræsentant for et uafhængigt eksperiment Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Forskelle i mitokondriel respiration i cytokindifferentierede humane primære T-celler. (A-D) Basal respiration, maksimal åndedræt, ATP-produktion og ledig åndedrætskapacitet af humane primære T-celler dyrket med IL-2 eller IL-15 i syv dage (n = 3). (E) Repræsentative plots af (A-D) med injektioner af Oligomycin eller FCCP (a) eller antimycin A (b). Klik her for at se en større version af denne figur.

	Cytokin	[Lager]	Fortyndingsfaktor	[Endelig]
Betingelse 1	IL-2	3 x 106 U/ml	30,000	100 U/ml
Betingelse 2	IL-15	2 x 105 U/ml	2,000	100 U/ml

Tabel 1: Fremstilling af cytokinkulturer, der anvendes til at styre metaboliske ændringer i T-celler.

	Oligomycin			FCCP
	Arbejder sol.	Endelig konc.	Vol.	Arbejder sol.	Endelig konc.	Vol.
Havn A	5,0 μM	0,50 μM	20 μL	2,0 μM	0,2 μM	20 μL
Havn B	3,0 μM	0,75 μM	22 μL	1,30 μM	0,3 μM	22 μL
Havn C	3,0 μM	1,0 μM	24 μL	1,30 μM	0,4 μM	24 μL
Port D	3,0 μM	1,25 μM	27 μL	1,30 μM	0,5 μM	27 μL

Tabel 2: Strategi for fremstilling af mitokondrielle hæmmere og modulatorer. Forberedelseskoncentrationer, arbejdskoncentrationer og injektionsstrategier til en optimeringskørsel.

Handling	Detaljer	Oplysninger om måling
Grundlinje	Baseline målinger	3 målinger
Injektion	Port A-indsprøjtning	3 målinger
Injektion	Port B-injektion	3 målinger
Injektion	Port C-injektion	3 målinger
Injektion	Port D-injektion	3 målinger
Måle	Yderligere målinger	Valgfri

Tabel 3: Protokoldesign af en optimeringskørsel med titrering af mitokondriehæmmere og modulatorer ved hjælp af 4 injektioner med 3 målinger i hver.

Element af mitokondriel oxidativ phosphorylering	Forklaring
Basal åndedræt	Basal respiration er et basismål for hastigheden af ilt, der forbruges af de stimulerede T-celler før tilsætning af mitokondrielle hæmmere. Det er et mål for iltforbruget, der bruges til at imødekomme cellulær ATP-efterspørgsel som følge af mitokondriel protonlækage. Som sådan giver det et overblik over protonstrømmen, der genereres for at levere ATP-syntese og protonlækage. Det er imidlertid også et mål, der kan ændres afhængigt af de substrater, der er til stede i vækstmediet, stimulering af celler før assay og andre ydre faktorer. Den basale respiration er derfor et mål, der bruges til at sammenligne to eller flere forskellige celletyper og / eller forskellige behandlinger, der menes at påvirke cellernes cellulære metaboliske tilstand. Basal respiration beregnes som forskellen i OCR før tilsætning af mitokondrielle modulatorer (oligomycin eller FCCP) og efter tilsætning af antimycin A
Maksimal åndedræt	Denne foranstaltning er den maksimale ilthastighed, der kan indtages til oxidativ fosforylering. Hastigheden af ilt, der forbruges ved oxidativ phosphorylering, bestemmes både af elektrontransportkædens evne til at pumpe protoner over den indre mitokondriemembran og ATP-syntasens evne til at anvende protongradienten til phosphorylat ATP fra ADP. ATP-syntasens hastighed er begrænset af frit ADP-substrat og dermed af cellens generelle energiske tilstand. Ved behandling af cellerne med den mitokondrielle uncoupler FCCP kan protoner frit krydse tilbage over den indre mitokondriemembran. Dette efterligner en situation, hvor cellerne oplever et umætteligt energibehov, og den maksimale respiration er derfor et mål for den maksimale ilthastighed, der kan forbruges af elektrontransportkæden. Maksimal respiration beregnes som forskellen i OCR for celler behandlet med FCCP og celler behandlet med antimycin A
ATP omsætning	ATP-bundet respiration måles som forskellen i OCR efter hæmning af ATP-syntasen under anvendelse af oligomycin. Det ilt, der ellers ville blive forbrugt til fosforylering af ADP ved oxidativ fosforylering, vil ikke længere blive brugt, da denne proces standses. ATP-bundet respiration er derfor i forhold til ATP produceret ved oxidativ fosforylering. Ændringer i AT-bundet åndedræt er et svar fra mitokondrierne på et ændret ATP-behov i cellen ATP-bundet respiration beregnes som forskellen i OCR før tilsætning af mitokondrielle modulatorer (oligomycin eller FCCP) og efter tilsætning af oligomycin
Ekstra åndedrætskapacitet	Den uudnyttede åndedrætskapacitet er et mål for en teoretisk ekstra kapacitet til at producere ATP som reaktion på en øget energisk efterspørgsel. Det defineres som forskellen mellem basal respiration og maksimal åndedræt. Ændringer i ledig åndedrætskapacitet kan være en indikator for mitokondrie- og cellekondition og fleksibilitet.

Tabel 4: Forklaring af de forskellige komponenter i mitokondriel respiration, der studeres ved hjælp af fluxanalysatoren

Discussion

Detaljeret og korrekt kvantificering af oxidativ phosphorylering er et uundværligt værktøj til beskrivelse af T-cellers energitilstande. Tilstanden af mitokondriel kondition kan være direkte relateret til T-celleaktiveringspotentiale, overlevelse og ^{differentiering1,5}. Med denne protokol er det muligt at bestemme de forskellige egenskaber ved oxidativ phosphorylering (se tabel 4 for en detaljeret forklaring). Præcis kvantificering af disse egenskaber ved oxidativ fosforylering giver et detaljeret indblik i T-cellernes energitilstande. For at opnå pålidelige resultater skal der dog udvises stor forsigtighed ved opsætningen af eksperimentet.

I denne protokol anbefales de tre følgende optimeringstrin først optimering af celletal. En fluxanalysators evne til korrekt at måle iltkoncentrationer følger en sigmoidkurve; Ændringer i ilt, der er for små eller for store, vil falde uden for maskinens driftsinterval og vil derfor ikke blive målt korrekt. Dette nødvendiggør en optimering af cellenumre, der skal bruges gennem hele eksperimentet. Hvis der analyseres for få celler, er ændringerne i iltforbruget for lave til at blive målt korrekt. Hvis der er for mange celler, er der risiko for iltsvind i analysemediet. En indledende kørsel anbefales derfor, med cellenumre fra 100.000-400.000 celler pr. Brønd. Ved plotning af celletal versus basal respiration vil det optimale celletal være i kurvens lineære område. Når du optimerer opsætningen, skal du være opmærksom på, at der kan være en eksponentiel forskel i mitokondrieaktivitet mellem hvilende og aktiverede celler, og derfor skal optimeres i overensstemmelse hermed.

For det andet titrering af inhibitorkoncentrationer. Ved behandling af cellerne med oligomycin og FCCP er det vigtigt at identificere de optimale koncentrationer af de hæmmere, der skal anvendes. En for lav koncentration vil resultere i en suboptimal hæmning og en forkert måling af mitokondriel respiration. Det er almindeligt, at folk bruger de højest anbefalede koncentrationer af hæmmerne for at sikre, at der opnås en fuld hæmning. Dette er også problematisk, da for høje koncentrationer af hæmmerne kan have pleiotrope virkninger. Afkoblinger som FCCP udøver også deres virkninger på andre membraner end mitokondrie, hvilket resulterer i en række uønskede virkninger, herunder plasmamembrandepolarisering, mitokondriehæmning og cytotoksicitet. I denne protokol udføres titrering af oligomycin og FCCP samtidig med cellenummeroptimering. Under en optimeringskørsel tilsættes stigende koncentrationer af oligomycin eller FCCP ved hjælp af de fire tilgængelige substratporte. I det resulterende OCR-diagram kan den optimale koncentration visuelt bestemmes som den koncentration, hvor OCR når et stabilt plateau. Når koncentrationen af oligomycin og FCCP er titreret, skal disse koncentrationer anvendes under hele forsøget.

For det tredje sekventiel versus enkelt individuel tilsætning af hæmmere. Klassiske Seahorse assays udføres typisk med sekventiel tilsætning af den første oligomycin efterfulgt af tilsætning af FCCP. I T-celler og andre følsomme celler kan en sådan sekventiel tilsætning resultere i en fejlagtig kvantificering af maksimal respiration. Til gengæld vil de målte niveauer af ledig åndedrætskapacitet rapportere lavere, end de er. Alvorlige eksempler på dette omfatter værdier af ledig åndedrætskapacitet, der er negative. Dette er naturligvis ikke biologisk muligt og skyldes en præsensibilisering af mitokondrierne ved oligomycinbehandling. I denne protokol anbefales det i stedet, at celler kun behandles med enten oligomycin eller FCCP (se figur 3C for illustrativ sammenligning).

Endelig bruges denne optimerede protokol til at vise, hvordan IL-15-supplerede humane primære T-cellekulturer klart kan skelnes fra IL-2-supplerede celler baseret på deres mitokondrielle respiration. IL-15-dyrkede celler besidder højere maksimal respiration og ledig åndedrætskapacitet, en metabolisk tilstand forbundet med hukommelse ^T-celler1,6. Disse observationer er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der forbinder IL-15 med hukommelse T-celleundergrupper8. Derudover blev der observeret en forskel i basal respiration, men ikke i ATP-produktion sammenlignet med IL-2-dyrkede celler. Dette indikerer, at disse celler bruger deres glykolytiske kapacitet til at overholde basale metaboliske krav, en vej forbundet med mere differentierede celler. Samlet set er det vist, at en human hukommelse T-cellemodel kan etableres in vitro ved hjælp af IL-15 tilskud. Brug af et IL-15-rigt miljø til at fremme udviklingen af hukommelsesceller er tidligere blevet demonstreret og understøtter yderligere ^{resultaterne8}.

I denne metode er oligomycin, FCCP og antimycin A blevet anvendt til at kvantificere egenskaberne af OxPhos. Der findes andre forbindelser med lignende virkninger, som potentielt ville være bedre egnet til T-celler. Et eksempel kunne være at anvende afkoblingsmotoren BAM15 i stedet for FCCP for at mindske depolariseringen af mitokondriemembranen og for at undgå ^{cytotoksicitet9}. I denne metode er disse forbindelser ikke blevet overvejet, da oligomycin, FCCP og antimycin A har været de anbefalede mitokondrielle modulatorer til Seahorse-eksperimenter i det sidste årti. Brugen af disse forbindelser anerkendes derfor af korrekturlæsere og andre forskere, der arbejder med OxPhos. Mere erfarne brugere af Seahorse fluxanalysatoren opfordres til at bruge disse alternative forbindelser, men brugen af disse er uden for dette papirs anvendelsesområde.

Overvågning af mitokondrie OxPhos er et vigtigt redskab til at forstå T-cellefunktion og forbedre kræftimmunterapier. Som tidligere nævnt viste IL-15-ekspanderede celler - med en mindre differentieret hukommelsesfænotype - sig at forbedre responsen på CAR T-celleterapier, da de var mindre udmattede og havde en øget ^{antitumoraktivitet10}. Denne optimerede protokol kan være et effektivt værktøj til at studere kvaliteten af T-celler i både prækliniske og kliniske indstillinger. Afslutningsvis implementerer denne protokol trin til optimering af celletal og inhibitorkoncentrationer til brug af ex vivo-dyrkede humane primære T-celler i metaboliske assays.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well tissue culture plate	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28 beads	Gibco	11161D
Antimycin A	Merck	A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell-Tak	Corning	354240	For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D9170
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522	Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15	Peprotech	200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stemcell Technologies	07801
Oligomycin	Merck	O4876
PBS	Thermo Fisher	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fisher	61870036
Seahorse Calibrant	Agilent Technologies	102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4	Agilent Technologies	103576-100	XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser	Agilent Technologies		Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates	Agilent Technologies	102416-100	XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge	Agilent Technologies	102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)	Sigma Aldrich	36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)	Sigma Aldrich	S2770-100ML
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher	12321D
Seahorse wave			Flux analyzer software