Summary
A adaptação metabólica é fundamental para as células T, pois dita diferenciação, persistência e citotoxicidade. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para monitorar a respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas ex vivo .
Abstract
Durante a ativação, o metabolismo das células T se adapta a mudanças que impactam seu destino. Um aumento da fosforilação oxidativa mitocondrial é indispensável para a ativação celular T, e a sobrevivência das células T da memória depende da remodelagem mitocondrial. Consequentemente, isso afeta o resultado clínico a longo prazo das imunoterapias contra o câncer. Mudanças na qualidade das células T são frequentemente estudadas pela citometria de fluxo usando marcadores superficiais bem conhecidos e não diretamente pelo seu estado metabólico. Este é um protocolo otimizado para medir a respiração mitocondrial em tempo real de células T humanas primárias usando um Analisador de Fluxo Extracelular e as citocinas IL-2 e IL-15, que afetam de forma diferente o metabolismo das células T. Mostra-se que o estado metabólico das células T pode ser claramente distinguido medindo o consumo de oxigênio ao inibir os principais complexos na via metabólica e que a precisão dessas medidas é altamente dependente da ótima concentração inibidora e estratégia de injeção inibidora. Este protocolo padronizado ajudará a implementar a respiração mitocondrial como um padrão para o condicionamento celular T no monitoramento e estudo de imunoterápicos cancerígenos.
Introduction
O desenvolvimento e a função correta das células T são essenciais para a capacidade do sistema imunológico de reconhecer e responder a antígenos. A fosforilação oxidativa mitocondrial (OxPhos) muda de acordo com o estado da célula T. As células T ingênuas usam predominantemente OxPhos para produzir ATP, enquanto as células T ativadas passam por uma transição metabólica onde a glicólise se torna dominante1. Após a fase do efeito, o pequeno subconjunto remanescente de células T de memória reverte para um estado metabólico dominado por OxPhos2,3. As mudanças de OxPhos seguem a diferenciação das células T a tal ponto que até mesmo subconjuntos de células T podem ser diferenciados por suas propriedades específicas é as propriedades OxPhos1. Por outro lado, o OxPhos é importante para a função das células T, e a inibição do OxPhos tem sido demonstrada para bloquear a proliferação e a citocina das células T4. Portanto, a capacidade de quantificar as propriedades do OxPhos da célula T de forma precisa e reprodutível é uma ferramenta poderosa para quem trabalha com células T.
Neste protocolo, as propriedades dos OxPhos da célula T são medidas usando um analisador de fluxo extracelular. A função central deste analisador é medir continuamente o teor de oxigênio das mídias de crescimento das células a serem analisadas. Acredita-se que o oxigênio removido da mídia de crescimento seja tomado pelas células. Ao tratar as células com uma variedade de inibidores ou modificadores oxphos, uma queda na captação de oxigênio está associada à função inibida ou modulada. Por exemplo, a inibição da synthase ATP levará a uma absorção celular reduzida de oxigênio que de outra forma seria usado para produzir ATP por fosforilação oxidativa. Outros equipamentos, incluindo o eletrodo Clark e o instrumento Oroboros, oferecem funcionalidade semelhante, e cada instrumento tem diferentes vantagens e deficiências. Uma ampla gama de tipos de células pode ser usada para estudos nesses dispositivos, mas um tipo particularmente desafiador de células é o linfócitos T primários humanos5. Devido ao seu pequeno tamanho, má sobrevivência ex vivo e propriedades não aderentes, as células T primárias humanas podem ser desafiadoras para estudar.
Este é um protocolo para estudar a respiração mitocondrial das células T primárias humanas por um analisador extracelular. O protocolo é dividido em uma corrida de otimização, onde são determinadas concentrações ideais de número celular por bem, bem como a concentração ideal de oligomicina e FCCP. Além disso, uma corrida de ensaio, onde as condições otimizadas são usadas.
Usando PBMCs humanos derivados do sangue e culturas primárias de células T ex vivo , este protocolo demonstra a importância da concentração inibidora ideal e a relevância do uso separado em vez de uma injeção sequencial de inibidores mitocondriais ao trabalhar com tipos celulares sensíveis. Finalmente, demonstra-se que este ensaio pode detectar robustamente diferenças sutis na respiração mitocondrial após a polarização com citocinas IL-2 e IL-15.
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Protocol
Os experimentos foram realizados sob as diretrizes do Hospital Herlev e da Região da Capital da Dinamarca.
NOTA: Este protocolo contém instruções tanto para uma execução de otimização quanto para uma execução de ensaios. Está claramente escrito no texto quando as instruções são para uma execução de otimização ou uma execução de ensaio. Execute uma corrida de otimização antes de continuar com as corridas de ensaio
1. Isolamento mononuclear de sangue periférico humano (PBMC) de casacos buffy
- Isolamento do PBMC
- Recolher casacos de polimento da instituição apropriada (coletados em sacos de coleta de sangue). Casacos buffy são originários de doadores saudáveis. Exclua doadores que recentemente usaram analgésicos.
- Pulverize o saco de coleta de sangue contendo o casaco de buffy com 70% de etanol antes de transferir para um armário de fluxo laminar. Use sempre técnicas estéreis e hardware estéril para todas as etapas
NOTA: Certifique-se de que as autorizações corretas para o manuseio de amostras de sangue humano sejam obtidas. - Transfira o sangue para um tubo de centrífuga de 50 mL estéril.
- Diluir o sangue pelo menos 10% com RPMI não suplementado 1640.
- Despeje 20 mL do meio gradiente de densidade preferido em um tubo centrífuga de 50 mL.
- Aspire 25 mL do sangue diluído em uma pipeta sorológica. Coloque o controlador de pipeta elétrica na menor velocidade.
- Segure o tubo com meio gradiente de densidade em um ângulo de 45° e coloque a ponta da pipeta sorológica no lado interno do tubo centrífuga de 50 mL. Solte lentamente 25 mL do sangue diluído da pipeta sorológica.
- Certifique-se de que o sangue diluído e o meio gradiente de densidade não se misturem. Certifique-se de que o sangue diluído repousa sobre o meio gradiente de densidade.
- Repita isso com tubos médios de gradiente de densidade subsequente até que todo o sangue diluído seja processado.
- Mova cuidadosamente os tubos para uma centrífuga e centrífuga a 1000 x g por 30 min em um rotor swing-out à temperatura ambiente (RT). Certifique-se de que a aceleração e a quebra estão no mínimo.
NOTA: Após a centrifugação, várias camadas devem ser visíveis. A camada superior, clara rosa-laranja consiste no plasma de sangue e plaquetas. A camada branca média consiste nos PBMCs seguidos por uma camada clara que consiste no meio de gradiente de densidade, e finalmente uma camada vermelha escura na parte inferior com glóbulos vermelhos. - Usando uma pipeta Pasteur estéril, aspire cuidadosamente a camada branca contendo PBMC a um tubo de centrífuga de 50 mL.
NOTA: Certifique-se de não transferir o meio gradiente de densidade, pois isso afetará a purificação a jusante. O excesso de plasma não afetará os resultados. - Piscina todos os PBMCs coletados no mesmo tubo centrífugo de 50 mL e cubra até 50 mL com RPMI 1640.
- Centrifugar as células a 500 x g por 5 min no RT (execute as etapas restantes de centrifugação nesta configuração, a menos que especificada o contrário).
- Aspire o supernasce e resuspende as células em 30 mL de RPMI 1640. Conte as células usando um hemócito ou contador de células automatizada.
- Para criopreservação, resuspengem um máximo de 30 milhões de células por 1 mL de meio de congelamento.
- Transfira as células para criotubos e congele até -80 °C usando um recipiente de congelamento controlado por taxa (-1 °C por minuto). Para armazenamento a longo prazo, mova os PBMCs para -140 °C.
NOTA: Limite o tempo que as células estão no meio de congelamento em RT. Na RT, o DMSO é altamente tóxico para as células.
2. Culturing de linfócitos T primários humanos ativados
- Descongelamento de células (Dia 1)
- Pré-quente 10 mL de RPMI 1640 por amostra para cerca de 37 °C.
- Pegue o número desejado de ampolas celulares e armazene-as temporariamente em gelo seco.
- Resuspenque as células congeladas em 10 mL de RPMI pré-aquecido 1640.
- Centrifugar as células por 5 min a 500 x g em RT.
- Descarte o supernatante e lave as células novamente, reutilizando em 10 mL de RPMI 1640 e centrífuga como descrito em 2.1.4.
- Descarte o supernasce e resuspenque as células em 2 x 106 células por mL de meio X-VIVO 15 + 5% de soro humano (doravante: meio de célula T).
- Placa 2 mL das células por poço em uma placa de cultura celular de 24 poços e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.
- Ativação de células (Dia 0)
- Lave as contas CD3/CD28 transferindo 12,5 μL de contas por 1 milhão de células para um tubo de microcentrifutura. Adicione 12,5 μL de PBS por 12,5 μL de contas.
NOTA: É importante vórtice o frasco de contas antes de usar. - Coloque o tubo de microcentrifuuge em um ímã adequado por 1 min.
- Descarte o buffer e resuspenque as contas no volume original do meio da célula T (12,5 μL de meio de célula T por 12,5 μL do volume original das contas).
- Adicione 12,5 μL de contas por milhão de células correspondentes a uma razão de 1:2 (contas: células).
- Divida as células em duas condições com cerca de 5 milhões de células em cada.
- Adicione o volume correto de citocinas às condições mencionadas na Tabela 1.
- Incubar as células por 3 dias a 37 °C e 5% de CO2.
- Lave as contas CD3/CD28 transferindo 12,5 μL de contas por 1 milhão de células para um tubo de microcentrifutura. Adicione 12,5 μL de PBS por 12,5 μL de contas.
- Cultivo de células (Dias 3 e 5)
- Resuspend as células e divida-as transferindo metade do volume de cada poço para um novo poço. Adicione o mesmo volume de meio de célula T fresco a cada poço.
- Adicione novas citocinas a cada condição mencionada na Tabela 1.
3. Ensaio de fluxo extracelular
- Hidratação do cartucho do sensor (Dia 0)
- Desempacotar o cartucho do sensor e remover cuidadosamente o cartucho do sensor da placa do utilitário.
- Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo, tomando cuidado para não tocar nas sondas do sensor.
- Encha a placa do utilitário com 200 μL de calibrante (ver Tabela de Materiais para obter detalhes) e substitua cuidadosamente o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade.
- Alternativamente, para eliminar qualquer formação de bolha, incubar o cartucho do sensor em água ultrauso estéril durante a noite e substituí-lo por um calibrante pré-aquecido na manhã do ensaio.
- Incubar a placa do cartucho do sensor a 37 °C em um armário de aquecimento não regulamentado por CO2 durante a noite.
NOTA: É muito importante usar um gabinete não regulamentado para CO2 , uma vez que o excesso de CO2 influenciará o cartucho do sensor. Certifique-se de que o analisador Flux (ver Tabela de Materiais para obter detalhes) esteja ligado pelo menos um dia antes do uso para permitir que ele aqueça até 37 °C.
- Revestimento celular e preparação de inibidores mitocondriais (Dia 1)
- Prepare uma solução de revestimento (ver Tabela de Materiais) contendo NaHCO3 (pH 8.3, 0,1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) e NaOH (1,0 M, 24 μL).
NOTA: A solução de revestimento deve ser sempre feita e usada fresca. - Abra uma placa de cultura celular XF fresca e adicione 12 μL da solução de revestimento recém-preparada para cada poço. Garanta até mesmo a distribuição da solução de revestimento na parte inferior de todos os poços.
- Incubar a placa em RT com a tampa ligada por 30 minutos e descartar a solução líquida restante de todos os poços.
- Lave a placa com 200 μL de água estéril e descarte o líquido.
- Lave a placa com 200 μL de PBS estérei de cultura celular e descarte o líquido.
- Deixe a placa no RT e deixe secar por pelo menos 30 min.
- Prepare uma solução de revestimento (ver Tabela de Materiais) contendo NaHCO3 (pH 8.3, 0,1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) e NaOH (1,0 M, 24 μL).
- Células placa T na placa de cultura celular XF (Dia 1)
- Prepare 50 mL de mídia de ensaio misturando mídia XF RPMI adequada com glicose, piruvato e glutamina de acordo com a configuração experimental (níveis recomendados: 4 mM de glicose, 1 mM piruvato e glutamina de 3 mM).
- Aqueça a 37 °C em uma incubadora não regulamentada de CO2 e coloque o pH em 7,4. Certifique-se de que há mídia suficiente para emplacamento de células e preparação de soluções de oligomicina e FCCP (seção 3.4).
- Projete um layout de placa com um número crescente de células por poço para a execução de otimização ou execução de ensaio. Use quatro poços de 4, cheios de mídia e injetados com mídia, para medições de fundo.
- Conte células T preparadas na seção 2.3 (pelo método preferido) e pipeta o número correto de células para cada poço da placa de cultura de célula XF revestida com a solução de revestimento, de acordo com o layout da placa.
NOTA: O volume final de cada poço pode variar, mas deve ser suficiente para cobrir a parte inferior do poço. - Centrifugar a placa de cultura celular XF a 1000 x g em RT por 10 minutos para aderir a célula T à superfície revestida.
- Lave as células com 200 μL de mídia de ensaio, descarte a mídia e adicione 180 μL de mídia de ensaio.
NOTA: Inspecione visualmente os poços usando um microscópio de luz invertido para garantir que as células estejam conectadas e distribuídas uniformemente pela superfície do poço. - Incubar a placa de cultura celular XF no armário de aquecimento não regulamentado de CO2 por 30 minutos para garantir que a temperatura da placa seja de 37 °C.
- Cartucho de sensor de carregamento com oligomicina e FCCP para operação de otimização (Dia 1)
NOTA: Se as concentrações de oligomicina e FCCP já foram otimizadas, continue na seção 3.5.- Prepare soluções de trabalho de oligomicina e FCCP em mídia de ensaio (preparada na etapa 3.3.1) conforme descrito nas etapas 3.4.2 e 3.4.3.
- Soluções de trabalho de oligomicina: preparem solução de 5 μM (2 mL de mídia de ensaio + 10 μL de 1 mM de estoque de oligomicina) e solução de 3 μM (8 mL de mídia de ensaio + 24 μL de 1 mM de oligomicina).
- Solução de trabalho FCCP: Prepare a solução de 2 μM (2 mL de mídia de ensaio + 13,2 μL de 300 μM de estoque fccp) e uma solução de 1,3 μM (8 ml de mídia de ensaio + 34,6 μL de 300 μM de estoque FCCP)
- Carregue as soluções de trabalho de oligomicina ou FCCP nas portas de injeção do cartucho do sensor (Tabela 2).
NOTA. É importante que nenhuma porta de injeção contenha apenas ar. Se, por qualquer motivo, nem todas as portas de injeção forem usadas, as portas vazias precisam ser preenchidas com mídia de ensaio. - Bata suavemente as bordas da placa sobre a mesa para remover bolhas potenciais nas portas de injeção.
- Cartucho de sensor de carregamento com oligomicina, FCCP e antimicina A para ensaio (dia 1)
- Preparar soluções de oligomicina, FCCP em mídia de ensaio (preparada na etapa 3.3.1) de acordo com as concentrações ideais identificadas em uma execução de Otimização anterior. Além disso, prepare uma solução de antimicina A de 20 μM.
- Carregue 20 μL de oligomicina ou FCCP na porta de injeção A do cartucho do sensor de acordo com o layout da placa. Adicione 22 μL de 20 μM de antimicina A à porta de injeção B de todos os poços. A concentração resultante de antimicina A uma vez injetada no poço será de 2 μM.
- Configuração de protocolo experimental no software do analisador Flux.
- Atribua os grupos e o mapa da placa para cada condição por layout da placa.
- Projete o protocolo de acordo com a estratégia de injeção (Tabela 3 e Figura 1).
NOTA: Ao executar as corridas de ensaio, a injeção C e D pode ser omitida. - Salve o ensaio configurado, preencha as informações necessárias para serem incluídas no ensaio e pressione Iniciar.
- O analisador de fluxo pedirá o cartucho do sensor preparado na seção 3.5. Remova a tampa e insira o cartucho do sensor conforme indicado pelo analisador.
NOTA: O ensaio calibrará e verificará os sensores indicados por marcas de verificação. Após a calibração bem sucedida, o analisador solicitará a placa de cultura celular XF preparada na seção 3.3. A placa de utilidade é ejetada do analisador e substituída pela placa de cultura de célula XF para iniciar o ensaio.
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Representative Results
Uma determinação correta das propriedades OxPhos é uma ferramenta indispensável ao estudar células T. No entanto, se as condições de ensaio não foram otimizadas, há um risco substancial de resultados enganosos ou errôneos. Neste protocolo, há um forte foco na otimização do número celular por poço e concentrações de oligomicina e FCCP a serem utilizadas. Na configuração descrita, a oligomicina e a FCCP são adicionadas incrementalmente ao mesmo poço, aumentando a concentração dos moduladores mitocondriais. A concentração ideal de oligomicina e FCCP pode ser determinada a partir das curvas OCR resultantes dos poços como da concentração onde um platô é atingido.
Na corrida representativa, a oligomicina é adicionada em uma concentração crescente e inibindo a synthase ATP (Complexo V da cadeia de transporte de elétrons), resultando na diminuição da respiração mitocondrial. Um platô em OCR é atingido após a concentração acumulada dos poços atingir 1 μM. A partir dessa concentração e do aumento das concentrações o OCR não foi mais reduzido (Figura 1A). Para poços tratados com uma concentração incremental do desacoplante FCCP, os níveis de OCR aumentaram como esperado até atingir um platô após 0,2 μM de FCCP, indicando que nesta concentração foi obtido o desacoplamento total (Figura 1B). Uma otimização de células banhadas por poço é importante para um ensaio correto e reprodutível. Se o número de células usadas for muito baixo, então o nível de oxigênio removido da mídia de ensaio pelas células é muito baixo para ser medido corretamente pelo analisador. Por outro lado, se o número de células por poço é muito alto, o consumo de oxigênio das células pode se tornar tão alto que o sistema não pode repor os níveis de oxigênio da mídia de ensaio após cada medição, levando a um ambiente cada vez mais hipoxico e caracterização errônea de OxPhos.
Na corrida representativa, as células foram semeadas a uma densidade de 200.000 e 400.000 células por poço (Figura 2A-C). Para uma corrida com 200.000 células, o OCR inicial é aproximadamente metade de uma corrida com 400.000 células por poço. Para o tratamento FCCP, o OCR máximo é de 61,6 pmol/min (200.000 células) contra 190,4 pmol/min (400.000 células). Após o tratamento da oligomiina, o OCR em execução com 200.000 células entra em colapso em OCR de um dígito (6,4 pmol/min). Isso é inferior ao OCR da corrida, com 400.000 células por bem tratada com oligomicina (25,8 pmol/min, respectivamente).
Portanto, a partir da corrida de otimização, é claro que um número celular de 400.000 células por poço era necessário para ensaios futuros, utilizando oligomicina de 1 μM e 0,2 μM FCCP. Na configuração clássica recomendada pelo fabricante, a oligomicina e a FCCP são adicionadas sequencialmente com a adição final de antimicina A. Para as células T, esta não é a abordagem ideal, pois o tratamento da oligomicina pode ser visto para limitar o desacoplamento após o tratamento FCCP (Figura 3A,B). Neste método apresentado, recomenda-se executar cada condição em poços duplicados e tratar um bem com oligomicina e o outro com FCCP, com uma adição final de antimicina A para ambos os poços. Utilizando essa abordagem, o tratamento da oligomicina não afeta o OCR após o tratamento da FCCP. Essa abordagem permite a determinação das mesmas propriedades mitocondriais da configuração clássica, onde as drogas são adicionadas em sequência (Figura 3C)
Finalmente, foi investigado se os efeitos das citocinas IL-2 e IL-15 poderiam ser diferenciados no metabolismo das células T primárias humanas ex vivo. De fato, as células cultivadas do IL-15 possuíam maior respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente, como foi mostrado antes1 (Figura 4A-E). A respiração basal e a produção de ATP não foram afetadas. Juntos, esses dados mostram que a respiração mitocondrial de células T primárias humanas ex vivo cultivadas pode ser analisada com sucesso usando o analisador de fluxo extracelular.
Figura 1: Taxa de consumo de oxigênio (OCR) medida durante a titulação de inibidores oligomicina e FCCP em células T primárias humanas ex vivo . (A) OCR durante a titulação stepwise da oligomicina de 0-1,25 μM concentração final. (B) OCR durante a titulação stepwise de FCCP de 0-0,5 μM concentração final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A influência da concentração celular nas medições de OCR em células T primárias humanas ex vivo . Medições de OCR de células T primárias humanas ex vivo cultivadas com 200.000 ou 400.000 células por poço após a injeção de (A) FCCP ou (B) Oligomicina. (C) Respiração basal, respiração máxima, produção de ATP e capacidade respiratória de reposição de células T primárias humanas usando 200.000 ou 400.000 células por poço. Representante de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Injeção única ou sequencial de moduladores mitocondriais. (A) Medidas representativas de OCR durante a linha de base e após a injeção de oligomicina e FCCP (a,b), ou antimicina A (c) como injeções individuais únicas ou como injeções sequenciais. (B) Valores de OCR antes da injeção (respiração basal) ou após a injeção de oligomicina ou FCCP como injeções únicas ou injeções sequenciais. (C) Representação esquemática da estratégia de injeção e medição. Representante de um experimento independente Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diferenças na respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas. (A-D) Respiração basal, respiração máxima, produção de ATP e capacidade respiratória sobressalente de células T primárias humanas cultivadas com IL-2 ou IL-15 por sete dias (n = 3). (E) Parcelas representativas de (A-D), com injeções de Oligomicina ou FCCP (a) ou antimicina A (b). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Citocina | [Estoque] | Fator de diluição | [Final] | |
| Condição 1 | IL-2 | 3 x 106 U/mL | 30,000 | 100 U/mL |
| Condição 2 | IL-15 | 2 x 105 U/mL | 2,000 | 100 U/mL |
Tabela 1: Preparação de culturas de citocinas utilizadas para orientar mudanças metabólicas nas células T.
| Oligomiina | FCCP | |||||
| Trabalhando sol. | Conc final. | Vol. | Trabalhando sol. | Conc final. | Vol. | |
| Porto A | 5,0 μM | 0,50 μM | 20 μL | 2,0 μM | 0,2 μM | 20 μL |
| Porto B | 3,0 μM | 0,75 μM | 22 μL | 1,30 μM | 0,3 μM | 22 μL |
| Porto C | 3,0 μM | 1,0 μM | 24 μL | 1,30 μM | 0,4 μM | 24 μL |
| Porto D | 3,0 μM | 1,25 μM | 27 μL | 1,30 μM | 0,5 μM | 27 μL |
Tabela 2: Estratégia para preparação de inibidores mitocondriais e moduladores. Concentrações de preparação, concentrações de trabalho e estratégias de injeção para uma corrida de otimização.
| Ação | Detalhes | Detalhes de medição |
| Referência | Medições de linha de base | 3 medidas |
| Injecção | Injeção de porta A | 3 medidas |
| Injecção | Injeção de porta B | 3 medidas |
| Injecção | Injeção de porta C | 3 medidas |
| Injecção | Injeção de porta D | 3 medidas |
| Medir | Medidas adicionais | Opcional |
Tabela 3: Projeto de protocolo de uma execução de otimização com titulação de inibidores mitocondriais e moduladores usando 4 injeções com 3 medidas em cada.
| Elemento de fosforilação oxidativa mitocondrial | Explicação | ||
| Respiração basal | Respiração basal é uma medida de base da taxa de oxigênio consumida pelas células T estimuladas antes da adição de inibidores mitocondriais. É uma medida do consumo de oxigênio usado para atender à demanda celular de ATP resultante do vazamento de prótons mitocondrial. Como tal, fornece uma visão geral da corrente de próton gerada para fornecer síntese ATP e vazamento de prótons. No entanto, é também uma medida que pode ser alterada dependendo dos substratos presentes na mídia de crescimento, estimulação de células antes do ensaio e outros fatores extrínsecos. A respiração basal é, portanto, uma medida usada para comparar dois ou mais tipos celulares diferentes e/ou tratamentos diferentes que se acredita afetar o estado metabólico celular das células. A respiração basal é calculada como a diferença no OCR antes de adicionar quaisquer moduladores mitocondriais (oligomicina ou FCCP) e depois de adicionar antimicina A |
||
| Respiração máxima | Esta medida é a taxa máxima de oxigênio que pode ser consumida para fosforilação oxidativa. A taxa de oxigênio consumida pela fosforilação oxidativa é determinada tanto pela capacidade da cadeia de transporte de elétrons de bombear prótons através da membrana mitocondrial interna, quanto pela capacidade da synthase ATP de usar o gradiente de prótons para fosforoto ATP da ADP. A velocidade do synthase ATP é limitada pelo substrato ADP gratuito e, portanto, pelo estado energético geral da célula. Ao tratar as células com o uncoupler mitocondrial FCCP, os prótons podem atravessar livremente a membrana mitocondrial interna. Isso imita uma situação em que as células experimentam uma demanda energética insaturada, e a respiração máxima é, portanto, uma medida da taxa máxima de oxigênio que pode ser consumida pela cadeia de transporte de elétrons. A respiração máxima é calculada como a diferença no OCR das células tratadas com FCCP e células tratadas com antimicina A |
||
| Volume de negócios da ATP | A respiração ligada ao ATP é medida como a diferença no OCR após a inibição da synthase ATP usando oligomicina. O oxigênio que de outra forma seria consumido para fosforilação de ADP por fosforilação oxidativa não será mais usado à medida que este processo for preso. A respiração ligada ao ATP é, portanto, relativa à ATP produzida por fosforilação oxidativa. Mudanças na respiração at-linked é uma resposta das mitocôndrias a uma demanda ATP alterada da célula A respiração ligada ao ATP é calculada como a diferença no OCR antes de adicionar quaisquer moduladores mitocondriais (oligomicina ou FCCP) e depois de adicionar oligomicina |
||
| Capacidade respiratória de reposição | A capacidade respiratória sobressalente é uma medida de uma capacidade extra teórica para produzir ATP como resposta a uma demanda energética crescente. É definida como a diferença entre respiração basal e respiração máxima. Alterações na capacidade respiratória sobressalente podem ser um indicador de aptidão mitocondrial e celular e flexibilidade. | ||
Tabela 4: Explicação dos vários componentes da respiração mitocondrial que são estudados usando o analisador de fluxo
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Discussion
Quantificação detalhada e correta da fosforilação oxidativa é uma ferramenta indispensável ao descrever os estados energéticos das células T. O estado de aptidão mitocondrial pode estar diretamente relacionado ao potencial de ativação de células T, sobrevivência e diferenciação1,5. Com este protocolo, é possível determinar as várias propriedades da fosforilação oxidativa (ver Tabela 4 para uma explicação detalhada). A quantificação precisa dessas propriedades da fosforilação oxidativa oferece uma visão detalhada dos estados energéticos das células T. No entanto, para obter resultados confiáveis, deve-se tomar muito cuidado ao configurar o experimento.
Neste protocolo, as três etapas seguintes de otimização são aconselhadas primeiro, otimização dos números de células. A capacidade de um analisador de fluxo para medir corretamente as concentrações de oxigênio segue uma curva sigmoide; mudanças no oxigênio que são muito pequenas ou muito grandes cairão fora do intervalo de operação da máquina e, portanto, não serão medidas corretamente. Isso requer uma otimização dos números de células para ser usado durante todo o experimento. Se poucas células forem avaliadas, as mudanças no consumo de oxigênio são muito baixas para serem medidas corretamente. Se muitas células, há risco de esgotamento de oxigênio na mídia de ensaios. Recomenda-se, portanto, uma execução inicial, com números de células variando de 100.000-400.000 células por poço. Ao traçar o número celular versus a respiração basal, a contagem ideal de células estará na faixa linear da curva. Ao otimizar a configuração, esteja ciente de que pode haver uma diferença exponencial na atividade mitocondrial entre células de repouso e ativadas e, portanto, precisa ser otimizada de acordo.
Segundo, titulação de concentrações inibidoras. Ao tratar as células com oligomicina e FCCP, é importante identificar as concentrações ideais dos inibidores a serem utilizados. Uma concentração muito baixa resultará em uma inibição subótima e uma medição incorreta da respiração mitocondrial. É comum que as pessoas usem as concentrações mais recomendadas dos inibidores para garantir que uma inibição completa seja obtida. Isso também é problemático, pois concentrações muito altas dos inibidores podem ter efeitos pleiotrópicos. Desacopladores como a FCCP também exercem seus efeitos em membranas diferentes das mitocondriais, resultando em uma série de efeitos indesejados, incluindo despolarização da membrana plasmática, inibição mitocondrial e citotoxicidade. Neste protocolo, a titulação da oligomicina e da FCCP é feita simultaneamente com otimização do número de células. Durante uma operação de otimização, concentrações crescentes de oligomicina ou FCCP são adicionadas usando as quatro portas de substrato disponíveis. No diagrama de OCR resultante, a concentração ideal pode ser visualmente determinada como a concentração em que o OCR atinge um platô estável. Uma vez que a concentração de oligomicina e FCCP tenham sido tituladas, essas concentrações devem ser usadas durante todo o experimento.
Terceiro, sequencial versus adição individual única de inibidores. Ensaios clássicos de cavalo marinho são tipicamente conduzidos com a adição sequencial da primeira oligomicina seguida pela adição de FCCP. Em células T e outras células sensíveis, tal adição sequencial pode resultar em uma quantificação errônea da respiração máxima. Por sua vez, os níveis medidos de capacidade respiratória sobressalente reportarão menor do que são. Exemplos graves disso incluem valores de capacidade respiratória sobressalente que são negativos. Isso, é claro, não é biologicamente possível e é causado por uma pré-sensibilização das mitocôndrias pelo tratamento da oligomicina. Neste protocolo, recomenda-se, em vez disso, que as células sejam tratadas apenas com oligomicina ou FCCP (ver Figura 3C para comparação ilustrativa).
Finalmente, este protocolo otimizado é usado para mostrar como as culturas primárias primárias T do IL-15 podem ser claramente distinguidas das células complementadas do IL-2 com base em sua respiração mitocondrial. As células cultivadas pelo IL-15 possuem maior respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente, um estado metabólico ligado às células T da memória1,6. Essas observações estão em consonância com estudos anteriores que ligam o IL-15 aos subconjuntos de células T de memória8. Além disso, observou-se uma diferença na respiração basal, mas não na produção de ATP quando comparada às células cultivadas pelo IL-2. Isso indica que essas células usam sua capacidade glicolítica para atender às demandas metabólicas basais, um caminho associado a células mais diferenciadas. Juntos, mostra-se que um modelo de célula T de memória humana pode ser estabelecido in vitro usando suplementação IL-15. O uso de um ambiente rico em IL-15 para promover o desenvolvimento de células de memória já foi demonstrado anteriormente e apoia ainda mais as descobertas8.
Neste método, oligomicina, FCCP e antimicina A têm sido usadas para quantificar as propriedades de OxPhos. Outros compostos existem com efeitos semelhantes, que potencialmente seriam mais adequados para células T. Um exemplo seria usar o desacoplador BAM15 em vez de FCCP para diminuir a despolarização da membrana mitocondrial e evitar a citotoxicidade9. Neste método, esses compostos não foram considerados, pois a oligomicina, a FCCP e a antimicina A têm sido os moduladores mitocondriais recomendados para experimentos de cavalos-marinhos na última década. O uso desses compostos é, portanto, reconhecido por revisores e outros pesquisadores que trabalham com OxPhos. Usuários mais experientes do analisador de fluxo seahorse são encorajados a usar esses compostos alternativos, mas o uso destes está fora do escopo deste artigo.
Monitorar o OxPhos mitocondrial é uma ferramenta essencial para entender a função celular T e melhorar as imunoterapias contra o câncer. Como mencionado anteriormente, as células expandidas il-15 - com um fenótipo de memória menos diferenciado - mostraram-se para melhorar as respostas às terapias de células CAR T, pois estavam menos exaustas e tinham uma atividade antitumoral aumentada10. Este protocolo otimizado pode ser uma ferramenta eficaz para estudar a qualidade das células T em ambientes pré-clínicos e clínicos. Em conclusão, este protocolo implementa etapas para otimizar números de células e concentrações inibidoras para o uso de células T primárias humanas ex vivo cultivadas em ensaios metabólicos.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Kasper Mølgaard e Anne Rahbech receberam subsídios de Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard também recebeu uma bolsa de Børnecancerfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
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