Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени

Published: October 19, 2021 doi: 10.3791/62984
* These authors contributed equally

Summary

Метаболическая адаптация имеет основополагающее значение для Т-клеток, поскольку она диктует дифференцировку, персистенцию и цитотоксичность. Здесь представлен оптимизированный протокол мониторинга митохондриального дыхания в ex vivo цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека.

Abstract

Во время активации метаболизм Т-клеток приспосабливается к изменениям, которые влияют на их судьбу. Увеличение митохондриального окислительного фосфорилирования необходимо для активации Т-клеток, а выживание Т-клеток памяти зависит от ремоделирования митохондрий. Следовательно, это влияет на долгосрочный клинический исход иммунотерапии рака. Изменения качества Т-клеток часто изучаются с помощью проточной цитометрии с использованием хорошо известных поверхностных маркеров, а не непосредственно их метаболического состояния. Это оптимизированный протокол для измерения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека в режиме реального времени с использованием анализатора внеклеточного потока и цитокинов IL-2 и IL-15, которые по-разному влияют на метаболизм Т-клеток. Показано, что метаболическое состояние Т-клеток можно четко различить путем измерения потребления кислорода при ингибировании ключевых комплексов в метаболическом пути и что точность этих измерений сильно зависит от оптимальной концентрации ингибитора и стратегии инъекции ингибитора. Этот стандартизированный протокол поможет внедрить митохондриальное дыхание в качестве стандарта для пригодности Т-клеток при мониторинге и изучении иммунотерапии рака.

Introduction

Правильное развитие и функционирование Т-клеток необходимы для способности иммунной системы распознавать и реагировать на антигены. Митохондриальное окислительное фосфорилирование (OxPhos) изменяется в зависимости от состояния Т-клетки. Наивные Т-клетки преимущественно используют OxPhos для производства АТФ, тогда как активированные Т-клетки подвергаются метаболическому переходу, когда гликолиз становится доминирующим1. После эффекторной фазы небольшое оставшееся подмножество Т-клеток памяти возвращается к метаболическому состоянию, в котором доминирует OxPhos2,3. Изменения OxPhos следуют за дифференцировкой Т-клеток до такой степени, что даже подмножества Т-клеток могут быть дифференцированы по их специфическим свойствам OxPhos1. И наоборот, OxPhos важен для функции Т-клеток, и было продемонстрировано, что ингибирование OxPhos блокирует пролиферацию и выработку цитокинов Т-клеток4. Таким образом, способность количественно оценивать свойства Т-клеток OxPhos точным и воспроизводимым образом является мощным инструментом для всех, кто работает с Т-клетками.

В этом протоколе свойства Т-клеток OxPhos измеряются с помощью внеклеточного анализатора потока. Основная функция этого анализатора заключается в непрерывном измерении содержания кислорода в питательных средах анализируемых клеток. Предполагается, что кислород, удаленный из среды роста, поглощается клетками. При обработке клеток различными ингибиторами или модификаторами OxPhos падение поглощения кислорода связано с ингибированной или модулированной функцией. Например, ингибирование АТФ-синтазы приведет к снижению клеточного поглощения кислорода, который в противном случае использовался бы для производства АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другое оборудование, включая электрод Кларка и инструмент Oroboros, предлагает аналогичную функциональность, и каждый инструмент имеет разные преимущества и недостатки. Широкий спектр типов клеток может быть использован для исследований в этих устройствах, но одним из особенно сложных типов клеток являются первичные Т-лимфоциты человека5. Из-за их небольшого размера, плохой выживаемости ex vivo и неадгезивных свойств первичные Т-клетки человека могут быть сложными для изучения.

Это протокол для изучения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека с помощью внеклеточного анализатора. Протокол разделен на оптимизационный прогон, где определяются оптимальные концентрации клеточного числа на лунку, а также оптимальная концентрация олигомицина и FCCP. Кроме того, проводится анализ, в котором используются оптимизированные условия.

Используя полученные из крови человеческие PBMCs и ex vivo первичные Т-клеточные культуры, этот протокол демонстрирует важность оптимальной концентрации ингибиторов и актуальность использования отдельных вместо последовательной инъекции митохондриальных ингибиторов при работе с чувствительными типами клеток. Наконец, показано, что этот анализ может надежно обнаруживать тонкие различия в митохондриальном дыхании при поляризации цитокинами IL-2 и IL-15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами больницы Херлев и столичного региона Дании.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол содержит инструкции как для запуска оптимизации, так и для запуска анализа. Это четко написано в тексте, когда инструкции предназначены для запуска оптимизации или прогона анализа. Выполнение выполнения оптимизации перед продолжением прогонов анализа

1. Выделение мононуклеарной (PBMC) периферической крови человека из пышной шерсти

  1. Изоляция PBMC
    1. Соберите пальто из соответствующего учреждения (собранные в пакеты для сбора крови). Пальто Баффи происходит от здоровых доноров. Исключить доноров, которые недавно использовали обезболивающие препараты.
    2. Распылите мешок для сбора крови, содержащий пушистый слой с 70% этанолом, перед переносом в ламинарный шкаф. Всегда используйте стерильные методы и стерильное оборудование для всех этапов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в получении надлежащих разрешений на обращение с образцами человеческой крови.
    3. Перенесите кровь в стерильную центрифужную трубку объемом 50 мл.
    4. Разбавляют кровь не менее чем на 10% недополняемым RPMI 1640.
    5. Залейте 20 мл предпочтительной среды градиента плотности в центрифужную трубку объемом 50 мл.
    6. Аспират 25 мл разбавленной крови в серологическую пипетку. Установите контроллер электрической пипетки на самую низкую скорость.
    7. Держите трубку с градиентной средой плотности под углом 45° и положите серологический наконечник пипетки на внутреннюю сторону трубы центрифуги объемом 50 мл. Медленно высвобождают 25 мл разбавленной крови из серологической пипетки.
    8. Убедитесь, что разбавленная кровь и среда градиента плотности не смешиваются. Убедитесь, что разбавленная кровь покоится поверх среды градиента плотности.
    9. Повторяйте это с последующим градиентом плотности средних пробирок до тех пор, пока вся разбавленная кровь не будет обработана.
    10. Осторожно переместите трубки в центрифугу и центрифугу при 1000 х г в течение 30 мин в откидном роторе при комнатной температуре (RT). Убедитесь, что ускорение и разрыв сведены к минимуму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования должны быть видны различные слои. Верхний, прозрачный розово-оранжевый слой состоит из плазмы крови и тромбоцитов. Средний белый слой состоит из PBMCs, за которым следует прозрачный слой, который состоит из среды градиента плотности, и, наконец, темно-красный слой внизу с красными кровяными клетками.
    11. Используя стерильную пипетку Пастера, аккуратно аспирируйте белый слой, содержащий PBMC, до трубки центрифуги объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не переносите среду градиента плотности, так как это повлияет на последующую очистку. Избыток плазмы не повлияет на результаты.
    12. Пул всех собранных НБМК в одной 50 мл центрифужной трубке и долив до 50 мл с RPMI 1640.
    13. Центрифугируйте ячейки при 500 х г в течение 5 мин при РТ (выполняйте оставшиеся этапы центрифугирования в этой настройке, если не указано иное).
    14. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 30 мл RPMI 1640. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
    15. Для криоконсервации повторно суспендируйте максимум 30 миллионов клеток на 1 мл морозильной среды.
    16. Перенесите ячейки в криотрубки и заморозьте до -80 °C с помощью морозильного контейнера с контролируемой скоростью (-1 °C в минуту). Для длительного хранения переместите НБК до -140 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничение временных ячеек находится в морозильной среде при RT. При РТ ДМСО очень токсичен для клеток.

2. Культивирование активированных первичных Т-лимфоцитов человека

  1. Оттаивание клеток (День 1)
    1. Предварительно прогрейте 10 мл RPMI 1640 на образец примерно до 37 °C.
    2. Возьмите нужное количество ампул клеток и временно храните их на сухом льду.
    3. Повторно суспендировать замороженные клетки в 10 мл предварительно нагретого RPMI 1640.
    4. Центрифугируйте ячейки в течение 5 мин при 500 х г при РТ.
    5. Выбросьте супернатант и снова промыте клетки путем повторного использования в 10 мл RPMI 1640 и центрифуги, как описано в 2.1.4.
    6. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки при 2 х 106 клетках на мл среды X-VIVO 15 + 5% сыворотки человека (далее: Т-клеточная среда).
    7. Пластина 2 мл клеток на лунку в 24-луночной клеточной культуральной пластине и инкубируют в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.
  2. Активация клеток (День 0)
    1. Промывайте шарики CD3/CD28 путем переноса 12,5 мкл бусин на 1 миллион клеток в микроцентрифужную трубку. Добавьте 12,5 мкл PBS на 12,5 мкл бусин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием важно вихрь флакона с бусинами.
    2. Поместите трубку микроцентрифуги на подходящий магнит на 1 мин.
    3. Отбросьте буфер и повторно суспендируйте шарики в исходном объеме Т-клеточной среды (12,5 мкл Т-клеточной среды на 12,5 мкл исходного объема шариков).
    4. Добавьте 12,5 мкл бусин на миллион клеток, что соответствует соотношению 1:2 (шарики: клетки).
    5. Разделите клетки на два состояния, в каждом из которых будет около 5 миллионов клеток.
    6. Добавьте правильный объем цитокинов к условиям, указанным в таблице 1.
    7. Инкубировать клетки в течение 3 дней при 37 °C и 5% CO2.
  3. Культивирование клеток (День 3 и 5)
    1. Повторно суспендируйте клетки и разделите их, перенеся половину объема из каждой лунки в новую лунку. Добавьте в каждую лунку одинаковый объем свежей Т-клеточной среды.
    2. Добавляйте новые цитокины к каждому состоянию, как указано в таблице 1.

3. Внеклеточный анализ потока

  1. Гидратация картриджа датчика (День 0)
    1. Распакуйте картридж датчика и осторожно извлеките его из вспомогательной пластины.
    2. Поместите картридж датчика вверх ногами, следя за тем, чтобы не коснуться датчиков.
    3. Заполните полезную пластину калибром 200 мкл (подробности см. в Таблице материалов ) и аккуратно замените картридж датчика обратно в полезную пластину.
    4. В качестве альтернативы, чтобы устранить образование пузырьков, инкубируйте картридж датчика в стерильной сверхчистой воде в течение ночи и замените его предварительно нагретым калибрантом утром после анализа.
    5. Инкубируйте пластину картриджа датчика при 37 °C в нагревательном шкафу без регулирования CO2 в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно использовать шкаф, не регулируемый CO2 , так как избыток CO2 будет влиять на картридж датчика. Убедитесь, что анализатор Flux (подробнее см. в Таблице материалов ) включен по крайней мере за сутки до использования, чтобы он мог прогреться до 37 °C.
  2. Клеточное покрытие и получение митохондриальных ингибиторов (День 1)
    1. Готовят раствор для покрытия (см. Таблицу материалов), содержащий NaHCO3 (рН 8,3, 0,1 М, 1128 мкл), Cell-Tak (1 мг/мл, 48 мкл) и NaOH (1,0 М, 24 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для покрытия всегда должен быть изготовлен и использован свежим.
    2. Откройте свежую пластину для культивирования клеток XF и добавьте 12 мкл свежеприготовленного раствора покрытия в каждую лунку. Обеспечьте равномерное распределение раствора покрытия на дне всех скважин.
    3. Инкубируйте пластину в RT с крышкой в течение 30 мин и выбросьте оставшийся жидкий раствор из всех лунок.
    4. Вымойте пластину 200 мкл стерильной воды и выбросьте жидкость.
    5. Вымойте пластину с 200 мкл стерильной PBS клеточной культуры и выбросьте жидкость.
    6. Оставьте пластину на RT и дайте ей высохнуть не менее 30 минут.
  3. Пластинчатые Т-клетки в пластине культуры клеток XF (День 1)
    1. Подготовьте 50 мл пробирной среды путем смешивания подходящей среды XF RPMI с глюкозой, пируватом и глютамином в соответствии с экспериментальной установкой (рекомендуемые уровни: глюкоза 4 мМ, пируват 1 мМ и 3 мМ глутамина).
    2. Нагрейте до 37 °C в инкубаторе, не регулируемом CO2 , и установите pH на уровне 7,4. Убедитесь, что имеется достаточное количество сред для покрытия клеток и приготовления растворов олигомицина и FCCP (раздел 3.4).
    3. Разработайте макет пластины с увеличением количества ячеек на скважину для выполнения оптимизации или анализа. Используйте четыре 4 скважины, заполненные средой и закачанные средой, для фоновых измерений.
    4. Подсчитайте Т-клетки, приготовленные в разделе 2.3 (предпочтительным способом) и пипеткой правильное количество клеток к каждой лунке XF-клеток культуральной пластины, покрытой раствором покрытия, согласно макету пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем каждой скважины может варьироваться, но должен быть достаточным, чтобы покрыть дно скважины.
    5. Центрифугируйте пластину культивирования клеток XF при 1000 х г на RT в течение 10 мин, чтобы приклеить Т-клетку к покрытой поверхности.
    6. Промыть клетки 200 мкл пробирной среды, отбросить среду и добавить 180 мкл пробирной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально осмотрите скважины с помощью инвертированного светового микроскопа, чтобы убедиться, что ячейки прикреплены и равномерно распределены по поверхности скважины.
    7. Инкубируйте пластину для культивирования клеток XF в нагревательном шкафу без регулирования CO2 в течение 30 минут, чтобы температура пластины составляла 37 °C.
  4. Картридж с датчиком загрузки с олигомицином и FCCP для оптимизации пробега (День 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрации олигомицина и FCCP уже были оптимизированы, продолжайте в разделе 3.5.
    1. Подготовка рабочих растворов олигомицина и FCCP в пробирных средах (подготовленных на этапе 3.3.1), как описано на этапах 3.4.2 и 3.4.3.
    2. Рабочие растворы олигомицина: готовят раствор 5 мкМ (2 мл пробирной среды + 10 мкл запаса олигомицина 1 мМ) и 3 мкМ раствора (8 мл пробирной среды + 24 мкл запаса олигомицина 1 мМ).
    3. Рабочий раствор FCCP: Подготовьте раствор 2 мкМ (2 мл пробирной среды + 13,2 мкл запаса FCCP 300 мкМ) и раствор 1,3 мкМ (8 мл пробирной среды + 34,6 мкл запаса FCCP 300 мкМ)
    4. Загрузите рабочие растворы олигомицина или FCCP в отверстия для инъекций картриджа датчика (таблица 2).
      ЗАМЕТКА. Важно, чтобы ни одно инжекционное отверстие не содержало только воздух. Если по какой-либо причине используются не все инжекционные порты, пустые порты должны быть заполнены пробирными носителями.
    5. Аккуратно постучите по краям пластины на столе, чтобы удалить потенциальные пузырьки в отверстиях для инъекций.
  5. Картридж с датчиком загрузки с олигомицином, FCCP и антимицином А для проведения анализа (День 1)
    1. Готовят растворы олигомицина, FCCP в пробирных средах (приготовленных на стадии 3.3.1) в соответствии с оптимальными концентрациями, выявленными в предыдущем оптимизационном цикле. Также приготовьте раствор антимицина А 20 мкМ.
    2. Загрузите 20 мкл олигомицина или FCCP в инъекционный порт A картриджа датчика в соответствии с расположением пластины. Добавьте 22 мкл 20 мкМ антимицина А в инъекционный порт В всех скважин. Результирующая концентрация антимицина А после введения в скважину составит 2 мкМ.
  6. Настройка экспериментального протокола в анализаторе Flux.
    1. Назначьте группы и карту пластин для каждого условия для каждого макета пластины.
    2. Спроектируйте протокол в соответствии со стратегией внедрения (таблица 3 и рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении прогонов анализа инъекции C и D могут быть опущены.
    3. Сохраните настройки анализа, заполните сведения, необходимые для анализа, и нажмите кнопку Пуск.
    4. Анализатор потока запросит картридж датчика, подготовленный в разделе 3.5. Снимите крышку и вставьте картридж датчика в соответствии с указаниями анализатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ будет калибровать и проверять датчики, отмеченные галочками. После успешной калибровки анализатор запросит пластину для культивирования клеток XF, подготовленную в разделе 3.3. Полезная пластина извлекается из анализатора и заменяется пластиной культуры клеток XF для начала анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Правильное определение свойств OxPhos является незаменимым инструментом при изучении Т-клеток. Однако, если условия анализа не были оптимизированы, существует значительный риск введения в заблуждение или ошибочных результатов. В этом протоколе основное внимание уделяется оптимизации количества клеток на лунку и концентраций олигомицина и FCCP, которые будут использоваться. В описанной установке олигомицин и FCCP добавляют постепенно в один и тот же колодец, увеличивая концентрацию митохондриальных модуляторов. Оптимальная концентрация олигомицина и FCCP может быть определена по результирующим кривым OCR скважин как концентрация, в которой достигнуто плато.

В репрезентативном прогоне олигомицин добавляют в возрастающей концентрации и ингибируют АТФ-синтазу (комплекс V цепи переноса электронов), что приводит к снижению митохондриального дыхания. Плато в OCR достигается после того, как аккумулятивная концентрация скважин достигает 1 мкМ. От этой концентрации и увеличения концентраций OCR не снижалась дальше (Рисунок 1А). Для скважин, обработанных инкрементной концентрацией разъединителя FCCP, уровни OCR повышались, как и ожидалось, до достижения плато после добавления 0,2 мкМ FCCP, что указывает на то, что при этой концентрации было получено полное разъединение (рисунок 1B). Оптимизация клеток, покрытых на скважину, важна для правильного и воспроизводимого анализа. Если используемое число клеток слишком низкое, то уровень кислорода, удаляемого клетками из пробирной среды, слишком низок, чтобы его можно было правильно измерить анализатором. С другой стороны, если количество клеток в лунке слишком велико, потребление кислорода клетками может стать настолько высоким, что система не может восполнить уровни кислорода в пробирной среде после каждого измерения, что приводит к все более гипоксической среде и ошибочной характеристике OxPhos.

В репрезентативном прогоне клетки были посеяны при плотности 200 000 и 400 000 клеток на лунку (рисунок 2A-C). Для пробега с 200 000 клеток начальный OCR составляет примерно половину пробега с 400 000 клеток на лунку. Для лечения FCCP максимальный OCR составляет 61,6 пмоль /мин (200 000 клеток) против 190,4 пмоль/мин (400 000 клеток). После лечения олигомицином OCR в беге с 200 000 клеток коллапсирует в однозначный OCR (6,4 пмоль / мин). Это ниже, чем OCR пробега, с 400 000 клеток на хорошо обработанный олигомицином (25,8 пмоль / мин, соответственно).

Таким образом, из оптимизационного запуска ясно, что для будущих анализов требовалось число клеток 400 000 клеток на лунку с использованием 1 мкМ олигомицина и 0,2 мкМ FCCP. В классической установке, рекомендованной производителем, олигомицин и FCCP добавляют последовательно с окончательным добавлением антимицина А. Для Т-клеток это не оптимальный подход, так как лечение олигомицином ограничивает разъединение после лечения FCCP (рисунок 3A, B). В представленном способе рекомендуется запускать каждое состояние в дублирующих лунках и обрабатывать одну скважину олигомицином, а другую FCCP, с окончательным добавлением антимицина А для обеих скважин. Используя этот подход, лечение олигомицином не влияет на OCR после лечения FCCP. Этот подход позволяет определить те же митохондриальные свойства, что и классическая установка, где препараты добавляются последовательно (рисунок 3C).

Наконец, было исследовано, могут ли эффекты цитокинов IL-2 и IL-15 быть дифференцированы на метаболизм ex vivo культивируемых первичных Т-клеток человека. Действительно, культивируемые КЛЕТКИ IL-15 обладали более высоким максимальным дыханием и запасной дыхательной способностью, как было показано ранее1 (рисунок 4A-E). Базальное дыхание и выработка АТФ не пострадали. Взятые вместе, эти данные показывают, что митохондриальное дыхание культивируемых ex vivo первичных Т-клеток человека может быть успешно проанализировано с использованием анализатора внеклеточного потока.

Figure 1
Рисунок 1: Норма потребления кислорода (OCR), измеренная во время титрования ингибиторов олигомицина и FCCP в ex vivo культивируемых первичных Т-клетках человека. (A) OCR во время поэтапного титрования олигомицина от конечной концентрации 0-1,25 мкМ. (B) OCR во время поэтапного титрования FCCP от конечной концентрации 0-0,5 мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние концентрации клеток на измерения OCR в культивируемых ex vivo первичных Т-клетках человека. Измерения OCR культивируемых ex vivo первичных Т-клеток человека с 200 000 или 400 000 клеток на скважину после инъекции (A) FCCP или (B) олигомицина. (C) Базальное дыхание, максимальное дыхание, выработка АТФ и резервная дыхательная способность первичных Т-клеток человека с использованием 200 000 или 400 000 клеток на лунку. Представитель трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Однократная или последовательная инъекция митохондриальных модуляторов. (A) Репрезентативные измерения OCR во время исходного уровня и после инъекции олигомицина и FCCP (a,b) или антимицина A (c) в виде одиночных индивидуальных инъекций или в виде последовательных инъекций. (B) Значения OCR до инъекции (базальное дыхание) или после инъекции олигомицина или FCCP в виде однократных инъекций или последовательных инъекций. (C) Схематическое представление стратегии впрыска и измерения. Представитель одного независимого эксперимента Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Различия в митохондриальном дыхании в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека. (А-Д) Базальное дыхание, максимальное дыхание, выработка АТФ и запасная дыхательная способность первичных Т-клеток человека, культивируемых IL-2 или IL-15 в течение семи дней (n = 3). (E) Репрезентативные участки (A-D) с инъекциями олигомицина или FCCP (a) или антимицина A (b). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Цитокин [Сток] Коэффициент разбавления [Финал]
Условие 1 Ил-2 3 x 106 U/мл 30,000 100 Ед/мл
Условие 2 Ил-15 2 x 105 Уд/мл 2,000 100 Ед/мл

Таблица 1: Получение цитокиновых культур, используемых для руководства метаболическими изменениями в Т-клетках.

Олигомицин ФКИП
Рабочий сол. Окончательный конспект. Вып. Рабочий сол. Окончательный конспект. Вып.
Порт А 5.0 мкМ 0.50 мкМ 20 мкл 2.0 мкМ 0,2 мкМ 20 мкл
Порт B 3.0 мкМ 0.75 мкМ 22 мкл 1.30 мкМ 0,3 мкМ 22 мкл
Порт C 3.0 мкМ 1.0 мкМ 24 мкл 1.30 мкМ 0,4 мкМ 24 мкл
Порт D 3.0 мкМ 1.25 мкМ 27 мкл 1.30 мкМ 0.5 мкМ 27 мкл

Таблица 2: Стратегия получения митохондриальных ингибиторов и модуляторов. Концентрации препарата, рабочие концентрации и стратегии инъекций для оптимизационного запуска.

Действие Подробности Детали измерений
Базис Базовые измерения 3 измерения
Инъекция Впрыск A 3 измерения
Инъекция Впрыск B 3 измерения
Инъекция Впрыск C 3 измерения
Инъекция Впрыск D 3 измерения
Измерять Дополнительные измерения Необязательный

Таблица 3: Разработка протокола оптимизационного запуска с титрованием митохондриальных ингибиторов и модуляторов с использованием 4 инъекций с 3 измерениями в каждой.

Элемент митохондриального окислительного фосфорилирования Объяснение
Базальное дыхание Базальное дыхание является базовой мерой скорости кислорода, потребляемого стимулируемыми Т-клетками до добавления митохондриальных ингибиторов. Это мера потребления кислорода, используемого для удовлетворения клеточной потребности в АТФ в результате утечки митохондриального протона. Таким образом, он предоставляет обзор протонного тока, генерируемого для обеспечения синтеза АТФ и утечки протонов. Тем не менее, это также мера, которая может быть изменена в зависимости от субстратов, присутствующих в среде роста, стимуляции клеток перед анализом и других внешних факторов. Таким образом, базальное дыхание является мерой, используемой для сравнения двух или более различных типов клеток и/или различных методов лечения, которые, как полагают, влияют на клеточное метаболическое состояние клеток.
Базальное дыхание рассчитывается как разница в OCR до добавления любых митохондриальных модуляторов (олигомицин или FCCP) и после добавления антимицина А
Максимальное дыхание Эта мера представляет собой максимальную скорость кислорода, который может быть использован для окислительного фосфорилирования. Скорость кислорода, потребляемого окислительным фосфорилированием, определяется как способностью цепи переноса электронов перекачивать протоны через внутреннюю митохондриальную мембрану, так и способностью АТФ-синтазы использовать протонный градиент для фосфорилирования АТФ из АДФ. Скорость АТФ-синтазы ограничена свободным СУБСТРАТОМ АДФ и тем самым общим энергетическим состоянием клетки. При обработке клеток митохондриальным разъединителем FCCP протоны могут свободно проходить обратно через внутреннюю митохондриальную мембрану. Это имитирует ситуацию, когда клетки испытывают ненасыщенную потребность в энергии, и поэтому максимальное дыхание является мерой максимальной скорости кислорода, который может потребляться цепью переноса электронов.
Максимальное дыхание рассчитывается как разница в OCR клеток, обработанных FCCP, и клеток, обработанных антимицином А
Оборот СПС АТФ-связанное дыхание измеряется как разница в OCR после ингибирования АТФ-синтазы с использованием олигомицина. Кислород, который в противном случае был бы потреблен для фосфорилирования АДФ путем окислительного фосфорилирования, больше не будет использоваться, поскольку этот процесс останавливается. Таким образом, АТФ-связанное дыхание относительно АТФ, образующегося в результате окислительного фосфорилирования. Изменения АТ-связанного дыхания являются реакцией митохондрий на измененную потребность клетки в АТФ
АТФ-связанное дыхание рассчитывается как разница в OCR до добавления любых митохондриальных модуляторов (олигомицин или FCCP) и после добавления олигомицина
Запасная дыхательная способность Запасная дыхательная способность является мерой теоретической дополнительной способности производить АТФ в ответ на повышенную потребность в энергии. Он определяется как разница между базальным дыханием и максимальным дыханием. Изменения в запасной дыхательной способности могут быть показателем митохондриальной и клеточной пригодности и гибкости.

Таблица 4: Объяснение различных компонентов митохондриального дыхания, которые изучаются с помощью анализатора потока

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Детальная и правильная количественная оценка окислительного фосфорилирования является незаменимым инструментом при описании энергетических состояний Т-клеток. Состояние митохондриальной приспособленности может быть напрямую связано с потенциалом активации Т-клеток, выживаемостью и дифференцировкой1,5. С помощью этого протокола можно определить различные свойства окислительного фосфорилирования (подробное объяснение см. в таблице 4). Точная количественная оценка этих свойств окислительного фосфорилирования дает подробное представление об энергетических состояниях Т-клеток. Однако для получения достоверных результатов необходимо проявлять большую осторожность при постановке эксперимента.

В этом протоколе рекомендуются три следующих шага оптимизации: во-первых, оптимизация номеров ячеек. Способность анализатора потока правильно измерять концентрацию кислорода следует сигмовидной кривой; слишком малые или слишком большие изменения в кислороде выпадают за пределы рабочего интервала машины и, следовательно, не будут измеряться правильно. Это требует оптимизации чисел ячеек, которые будут использоваться на протяжении всего эксперимента. Если анализировать слишком мало клеток, изменения в потреблении кислорода слишком низки, чтобы их можно было правильно измерить. Если клеток слишком много, существует риск истощения кислорода в пробирных средах. Поэтому рекомендуется начальный запуск с числом клеток в диапазоне от 100 000 до 400 000 клеток на лунку. При построении числа ячеек по сравнению с базальным дыханием оптимальное количество клеток будет находиться в линейном диапазоне кривой. При оптимизации установки имейте в виду, что может быть экспоненциальная разница в активности митохондрий между покоящимися и активированными клетками, и поэтому должна быть соответствующим образом оптимизирована.

Во-вторых, титрование концентраций ингибиторов. При лечении клеток олигомицином и FCCP важно определить оптимальные концентрации используемых ингибиторов. Слишком низкая концентрация приведет к неоптимальному торможению и неправильному измерению митохондриального дыхания. Обычно люди используют самые высокие рекомендуемые концентрации ингибиторов, чтобы обеспечить полное ингибирование. Это также проблематично, так как слишком высокие концентрации ингибиторов могут иметь плейотропные эффекты. Разъединители, такие как FCCP, также оказывают свое воздействие на мембраны, отличные от митохондриальных, что приводит к ряду нежелательных эффектов, включая деполяризацию плазматической мембраны, ингибирование митохондрий и цитотоксичность. В этом протоколе титрование олигомицина и FCCP выполняется одновременно с оптимизацией количества клеток. Во время оптимизации увеличивают концентрации олигомицина или FCCP с использованием четырех доступных портов подложки. На полученной диаграмме OCR оптимальная концентрация может быть визуально определена как концентрация, при которой OCR достигает устойчивого плато. После титрования концентрации олигомицина и FCCP эти концентрации должны использоваться на протяжении всего эксперимента.

В-третьих, последовательное и однократное индивидуальное добавление ингибиторов. Классические анализы морских коньков обычно проводятся с последовательным добавлением первого олигомицина с последующим добавлением FCCP. В Т-клетках и других чувствительных клетках такое последовательное добавление может привести к ошибочной количественной оценке максимального дыхания. В свою очередь, измеренные уровни запасной дыхательной способности будут ниже, чем они есть. Серьезные примеры этого включают значения запасной дыхательной способности, которые являются отрицательными. Это, конечно, биологически невозможно и вызвано пресенсибилизацией митохондрий лечением олигомицином. В этом протоколе рекомендуется, чтобы клетки обрабатывались только олигомицином или FCCP (см. Рисунок 3C для иллюстративного сравнения).

Наконец, этот оптимизированный протокол используется, чтобы показать, как посевы первичных Т-клеток человека, дополненные IL-15, можно четко отличить от клеток, дополненных IL-2, на основе их митохондриального дыхания. Il-15-культивируемые клетки обладают более высоким максимальным дыханием и запасной дыхательной способностью, метаболическим состоянием, связанным с Т-клетками памяти1,6. Эти наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями, которые связывают IL-15 с подмножествами Т-клеток памяти8. Кроме того, наблюдалась разница в базальном дыхании, но не в продукции АТФ по сравнению с IL-2-культивируемыми клетками. Это указывает на то, что эти клетки используют свою гликолитическую способность для удовлетворения базальных метаболических требований, пути, связанного с более дифференцированными клетками. Взятые вместе, показано, что модель Т-клеток памяти человека может быть установлена in vitro с помощью добавок IL-15. Использование среды, богатой IL-15, для содействия развитию клеток памяти ранее было продемонстрировано и дополнительно подтверждает результаты8.

В этом методе олигомицин, FCCP и антимицин А были использованы для количественной оценки свойств OxPhos. Существуют и другие соединения с аналогичными эффектами, которые потенциально лучше подходят для Т-клеток. Примером может быть использование разъединителя BAM15 вместо FCCP, чтобы уменьшить деполяризацию митохондриальной мембраны и избежать цитотоксичности9. В этом методе эти соединения не рассматривались, так как олигомицин, FCCP и антимицин А были рекомендованными митохондриальными модуляторами для экспериментов Seahorse в течение последнего десятилетия. Поэтому использование этих соединений признается рецензентами и другими исследователями, работающими с OxPhos. Более опытным пользователям анализатора потока Seahorse рекомендуется использовать эти альтернативные соединения, но их использование выходит за рамки данной статьи.

Мониторинг митохондриального OxPhos является важным инструментом для понимания функции Т-клеток и улучшения иммунотерапии рака. Как упоминалось ранее, было показано, что расширенные клетки IL-15 - с менее дифференцированным фенотипом памяти - улучшают ответы на терапию Т-клетками CAR, поскольку они были менее истощены и имели повышенную противоопухолевую активность10. Этот оптимизированный протокол может быть эффективным инструментом для изучения качества Т-клеток как в доклинических, так и в клинических условиях. В заключение, этот протокол реализует шаги по оптимизации количества клеток и концентраций ингибиторов для использования ex vivo культивируемых первичных Т-клеток человека в метаболических анализах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Каспер Мёльгаард и Анне Рахбех получили гранты от Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Каспер Мёльгаард также получил грант от Børnecancerfonden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well tissue culture plate Nunc 142485
Anti-CD3xCD28 beads Gibco 11161D
Antimycin A Merck A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell-Tak Corning 354240 For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D9170
Human Serum Sigma Aldrich H4522 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15 Peprotech 200-02
IL-2 Peprotech 200-15
Lymphoprep Stemcell Technologies 07801
Oligomycin Merck O4876
PBS Thermo Fisher 10010023
RPMI 1640 Gibco-Thermo Fisher 61870036
Seahorse Calibrant Agilent Technologies 102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 Agilent Technologies 103576-100 XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser Agilent Technologies Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates Agilent Technologies 102416-100 XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge Agilent Technologies 102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) Sigma Aldrich 36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) Sigma Aldrich S2770-100ML
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D
Seahorse wave Flux analyzer software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  2. Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
  3. vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
  4. Chang, C. -H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  5. vander Windt, G. J. W., Chang, C. -H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
  6. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  7. Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
  8. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  9. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  10. Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 176
Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, More

Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, Ö., Svane, I. M., thor Straten, P., Desler, C., Peeters, M. J. W. Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells. J. Vis. Exp. (176), e62984, doi:10.3791/62984 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter