Summary
Metabolisk anpassning är grundläggande för T-celler eftersom det dikterar differentiering, persistens och cytotoxicitet. Här presenteras ett optimerat protokoll för övervakning av mitokondriell andning i ex vivo cytokin-differentierade mänskliga primära T-celler.
Abstract
Under aktivering anpassar sig metabolismen av T-celler till förändringar som påverkar deras öde. En ökning av mitokondriell oxidativ fosforylering är oumbärlig för T-cellsaktivering, och överlevnaden av minne T-celler är beroende av mitokondriell ombyggnad. Detta påverkar följaktligen det långsiktiga kliniska resultatet av cancerimmunterapier. Förändringar i T-cellskvalitet studeras ofta av flödescytometri med hjälp av välkända ytmarkörer och inte direkt av deras metaboliska tillstånd. Detta är ett optimerat protokoll för att mäta mitokondriell andning i realtid av primära mänskliga T-celler med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer och cytokinerna IL-2 och IL-15, vilket påverkar T-cellsmetabolismen på olika sätt. Det visas att det metaboliska tillståndet hos T-celler tydligt kan särskiljas genom att mäta syreförbrukningen när man hämmar viktiga komplex i den metaboliska vägen och att noggrannheten i dessa mätningar är mycket beroende av optimal hämmarkoncentration och inhibitorinjektionsstrategi. Detta standardiserade protokoll kommer att hjälpa till att implementera mitokondriell andning som standard för T-cells fitness vid övervakning och studier av cancerimmunterapier.
Introduction
Korrekt T-cellsutveckling och funktion är avgörande för immunsystemets förmåga att känna igen och reagera på antigener. Mitokondriell oxidativ fosforylering (OxPhos) förändras beroende på T-cellens tillstånd. Naiva T-celler använder främst OxPhos för att producera ATP, medan aktiverade T-celler genomgår en metabolisk övergång där glykolys blir dominerande1. Efter effektorfasen återgår den lilla återstående delmängd av minne T-celler till ett metaboliskt tillstånd som domineras av OxPhos2,3. Förändringarna av OxPhos följer differentieringen av T-celler i en sådan grad att även undergrupper av T-celler kan differentieras genom deras specifika är OxPhos egenskaper1. Omvänt är OxPhos viktigt för T-cells funktion, och hämning av OxPhos har visat sig blockera spridning och cytokinproduktion av T-celler4. Därför är förmågan att kvantifiera egenskaperna hos T-cells OxPhos på ett exakt och reproducerbart sätt ett kraftfullt verktyg för alla som arbetar med T-celler.
I detta protokoll mäts egenskaperna hos T-cells OxPhos med hjälp av en extracellulär flödesanalysator. Kärnfunktionen hos denna analysator är att kontinuerligt mäta syrehalten i tillväxtmediet i de celler som ska analyseras. Syre som avlägsnas från tillväxtmediet antas tas upp av cellerna. Genom att behandla cellerna med en mängd olika OxPhos-hämmare eller modifierare är en minskning av syreupptaget förknippat med den hämmade eller modulerade funktionen. Till exempel kommer hämning av ATP-syntasen att leda till ett minskat cellulärt upptag av syre som annars skulle användas för att producera ATP genom oxidativ fosforylering. Annan utrustning, inklusive Clark-elektroden och Oroboros-instrumentet, erbjuder liknande funktionalitet, och varje instrument har olika fördelar och brister. Ett brett spektrum av celltyper kan användas för studier i dessa enheter, men en särskilt utmanande celltyp är mänskliga primära T-lymfocyter5. På grund av deras lilla storlek, dålig överlevnad ex vivo och icke-vidhäftande egenskaper, mänskliga primära T-celler kan vara utmanande att studera.
Detta är ett protokoll för att studera mitokondriell andning av mänskliga primära T-celler av en extracellulär analysator. Protokollet är indelat i en optimeringskörning, där optimala koncentrationer av cellnummer per samt den optimala koncentrationen av oligomycin och FCCP bestäms. Dessutom en analyskörning, där de optimerade förhållandena används.
Med hjälp av blod-härledda mänskliga PBMCs och ex vivo primära T cell kulturer, detta protokoll visar vikten av optimal inhibitor koncentration och relevansen av att använda separat i stället för en sekventiell injektion av mitokondriell hämmare när man arbetar med känsliga celltyper. Slutligen, det visas att denna analys kan robust upptäcka subtila skillnader i mitokondriell andning vid polarisering med cytokiner IL-2 och IL-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment utfördes enligt riktlinjerna från Herlevsjukhuset och Danmarks huvudstadsregion.
Det här protokollet innehåller instruktioner för både en optimeringskörning och en analyskörning. Det är tydligt skrivet i texten när instruktioner är för en optimeringskörning eller en analyskörning. Kör en optimeringskörning innan du fortsätter med analyskörningarna
1. Human perifert blod mononukleär (PBMC) isolering från buffy coats
- PBMC isolering
- Samla buffyrockar från lämplig institution (samlas i bloduppsamlingspåsar). Buffy rockar härstammar från friska donatorer. Exkludera donatorer som nyligen har använt smärtstillande medel.
- Spraya bloduppsamlingspåsen som innehåller den fina kappan med 70% etanol innan du överför till ett laminärt flödesskåp. Använd alltid sterila tekniker och steril hårdvara för alla steg
OBS: Se till att rätt tillstånd för hantering av humana blodprover erhålls. - Överför blodet till ett sterilt 50 ml centrifugrör.
- Späd blodet minst 10% med icke-kompletterad RPMI 1640.
- Häll 20 ml av det föredragna densitetsgradientmediet i ett 50 ml centrifugrör.
- Aspirera 25 ml av det utspädda blodet till en serologisk pipett. Ställ in den elektriska pipettregulatorn på lägsta hastighet.
- Håll röret med densitetsgradientmedium i 45° vinkel och vila den serologiska pipettens spets på insidan av 50 mL centrifugröret. Frigör långsamt 25 ml av det utspädda blodet från den serologiska pipetten.
- Se till att det utspädda blodet och densitetsgradientmediet inte blandas. Se till att det utspädda blodet vilar ovanpå densitetsgradientmediet.
- Upprepa detta med efterföljande densitet gradient medelstora rör tills allt utspädd blod bearbetas.
- Flytta försiktigt rören till en centrifug och centrifugera vid 1000 x g i 30 min i en svängig rotor vid rumstemperatur (RT). Se till att accelerationen och avbrottet är minimalt.
OBS: Efter centrifugering bör olika skikt vara synliga. Det övre, klara rosa till orange skiktet består av blodplasma och trombocyter. Det mellersta vita skiktet består av PBMCs följt av ett tydligt lager som består av densitetsgradientmediet och slutligen ett mörkrött lager längst ner med röda blodkroppar. - Använd en steril Pasteur-pipett och aspirera försiktigt det PBMC-innehållande vita skiktet till ett 50 ml centrifugrör.
OBS: Se till att inte överföra densitetsgradientmediet eftersom detta kommer att påverka nedströmsrening. Överskott av plasma påverkar inte resultaten. - Pool alla insamlade PBMCs i samma 50 mL centrifugrör och fyll på upp till 50 ml med RPMI 1640.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid RT (utför de återstående centrifugeringsstegen vid denna inställning om inget annat anges).
- Aspirera supernatanten och återanvända cellerna i 30 ml RPMI 1640. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.
- För cryopreservation, återanvänd högst 30 miljoner celler per 1 ml frysmedium.
- Överför cellerna till kryorör och frys till -80 °C med hjälp av en hastighetsstyrd frysbehållare (-1 °C per min). För långtidslagring flyttar du PBMCs till -140 °C.
OBS: Begränsa tiden celler är i frysmediet på RT. På RT är DMSO mycket giftigt för celler.
2. Odling av aktiverade mänskliga primära T-lymfocyter
- Upptining av celler (dag 1)
- Förvarma 10 ml RPMI 1640 per prov till cirka 37 °C.
- Ta önskat antal cellampuler och förvara dem tillfälligt på torris.
- Återanvänd de frusna cellerna i 10 ml förvärmd RPMI 1640.
- Centrifugera cellerna i 5 min vid 500 x g vid RT.
- Kassera supernatanten och tvätta cellerna igen genom att återanvända i 10 ml RPMI 1640 och centrifug enligt beskrivningen i 2.1.4.
- Kassera supernatanten och återanvänd cellerna vid 2 x 106 celler per ml X-VIVO 15 medium + 5% humant serum (nedan: T-cellsmedium).
- Platta 2 ml av cellerna per brunn i en 24-brunnscellsodlingsplatta och inkubera över natten vid 37 °C och 5% CO2.
- Aktivering av celler (dag 0)
- Tvätta CD3/CD28 pärlor genom att överföra 12,5 μL pärlor per 1 miljon celler till ett mikrocentrifugerör. Tillsätt 12,5 μL PBS per 12,5 μL pärlor.
OBS: Det är viktigt att virvla i injektionsflaskan av pärlor före användning. - Placera mikrocentrifugeröret på en lämplig magnet i 1 min.
- Kassera bufferten och återanvända pärlorna i den ursprungliga volymen av T-cellsmediet (12,5 μL T-cellmedium per 12,5 μL av den ursprungliga volymen pärlor).
- Tillsätt 12,5 μL pärlor per miljon celler motsvarande ett förhållande på 1:2 (pärlor: celler).
- Dela upp cellerna i två förhållanden med cirka 5 miljoner celler i varje.
- Tillsätt rätt volym cytokiner till de villkor som nämns i tabell 1.
- Inkubera cellerna i 3 dagar vid 37 °C och 5% CO2.
- Tvätta CD3/CD28 pärlor genom att överföra 12,5 μL pärlor per 1 miljon celler till ett mikrocentrifugerör. Tillsätt 12,5 μL PBS per 12,5 μL pärlor.
- Odling av celler (dag 3 och 5)
- Återanvänd cellerna och dela dem genom att överföra hälften av volymen från varje brunn till en ny brunn. Tillsätt samma volym färskT T-cellmedium till varje brunn.
- Tillsätt nya cytokiner till varje tillstånd som nämns i tabell 1.
3. Extracellulär flödesanalys
- Hydrering av sensorpatronen (dag 0)
- Packa upp sensorpatronen och ta försiktigt bort sensorpatronen från verktygsplattan.
- Placera sensorpatronen upp och ner och var försiktig så att du inte rör sensorsonderna.
- Fyll bruksplattan med 200 μL kalibrera (se Materialtabell för mer information) och byt försiktigt tillbaka sensorpatronen i bruksplattan.
- Alternativt, för att eliminera eventuell bubbelbildning, inkubera sensorpatronen i sterilt ultrapure vatten över natten och byt ut den med en förvärmd kalibrant på morgonen för analysen.
- Inkubera sensorpatronplattan vid 37 °C i ett icke-CO2-reglerat värmeskåp över natten.
OBS: Det är mycket viktigt att använda ett icke-CO2-reglerat skåp eftersom överskott av CO2 kommer att påverka sensorpatronen. Se till att Flödesanalysatorn (se Materialtabell för mer information) är påslagen minst en dag före användning så att den kan värmas upp till 37 °C.
- Cellbeläggning och beredning av mitokondriella hämmare (dag 1)
- Förbered en beläggningslösning (se Materialtabell) som innehåller NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/ml, 48 μL) och NaOH (1,0 M, 24 μL).
OBS: Beläggningslösning ska alltid tillverkas och användas färsk. - Öppna en färsk XF-cellodlingsplatta och tillsätt 12 μL av den nyberedda beläggningslösningen till varje brunn. Säkerställ jämn fördelning av beläggningslösningen i botten av alla brunnar.
- Inkubera plattan på RT med locket på i 30 min och kassera den återstående flytande lösningen från alla brunnar.
- Tvätta plattan med 200 μL sterilt vatten och kassera vätskan.
- Tvätta plattan med 200 μL steril PBS av cellodlingskvalitet och kassera vätskan.
- Lämna plattan på RT och låt den torka i minst 30 min.
- Förbered en beläggningslösning (se Materialtabell) som innehåller NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/ml, 48 μL) och NaOH (1,0 M, 24 μL).
- Platta T-celler i XF-cellodlingsplattan (dag 1)
- Förbered 50 ml analysmedium genom att blanda lämpligt XF RPMI-medium med glukos, pyruvat och glutamin enligt experimentell installation (Rekommenderade nivåer: 4 mM glukos, 1 mM pyruvat och 3 mM glutamin).
- Värm till 37 °C i en icke-CO2-reglerad inkubator och sätt pH till 7,4. Se till att det finns tillräckligt med media för plätering av celler och för beredning av oligomycin- och FCCP-lösningar (avsnitt 3.4).
- Designa en plåtlayout med ett ökande antal celler per brunn för optimeringskörning eller analyskörning. Använd fyra 4 brunnar, fyllda med media och injicerade med media, för bakgrundsmätningar.
- Räkna T-celler som bereds i avsnitt 2.3 (enligt den föredragna metoden) och pipetten rätt antal celler till varje brunn på XF-cellodlingsplattan belagd med beläggningslösningen, enligt plattlayouten.
OBS: Den slutliga volymen av varje brunn kan variera men måste vara tillräcklig för att täcka botten av brunnen. - Centrifugera XF-cellodlingsplattan vid 1000 x g vid RT i 10 minuter för att fästa T-cellen på den belagda ytan.
- Tvätta cellerna med 200 μL analysmedel, kassera mediet och tillsätt 180 μL analysmedium.
OBS: Inspektera brunnarna visuellt med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop för att säkerställa att cellerna är fästa och jämnt fördelade över brunnsytan. - Inkubera XF-cellodlingsplattan i det icke-CO2-reglerade värmeskåpet i 30 minuter för att säkerställa att plattans temperatur är 37 °C.
- Laddar sensorpatron med oligomycin och FCCP för optimeringskörning (dag 1)
OBS: Om oligomycin- och FCCP-koncentrationerna redan var optimerade, fortsätt vid avsnitt 3,5.- Utarbeta arbetslösningar för oligomycin och FCCP i analysmedier (beredda i steg 3.3.1) enligt beskrivningen i steg 3.4.2 och 3.4.3.
- Oligomycin arbetslösningar: förbered 5 μM-lösning (2 ml analysmedium + 10 μL 1 mM oligomycinbuljong) och 3 μM-lösning (8 ml analysmedium + 24 μL 1 mM oligomycinlager).
- FCCP arbetslösning: Förbered 2 μM-lösning (2 ml analysmedier + 13,2 μL 300 μM FCCP-lager) och en 1,3 μM-lösning (8 ml analysmedium + 34,6 μL 300 μM FCCP-lager)
- Ladda arbetslösningarna för antingen oligomycin eller FCCP i sensorpatronens insprutningsportar (tabell 2).
NOT. Det är viktigt att inga insprutningsportar endast innehåller luft. Om av någon anledning inte alla insprutningsportar används måste tomma portar fyllas med analysmedier. - Knacka försiktigt kanterna på plattan på bordet för att avlägsna potentiella bubblor i injektionsportarna.
- Laddningssensorpatron med oligomycin, FCCP och antimycin A för analyskörning (dag 1)
- Förbered lösningar av oligomycin, FCCP i analysmedier (beredda i steg 3.3.1) enligt de optimala koncentrationerna som identifierats i en tidigare optimeringskörning. Förbered också en 20 μM antimycin A-lösning.
- Lasta 20 μL av antingen oligomycin eller FCCP i insprutningsport A på sensorpatronen enligt plattans layout. Tillsätt 22 μL 20 μM antimycin A till injektionsport B av alla brunnar. Den resulterande koncentrationen av antimycin A som injicerats i brunnen kommer att vara 2 μM.
- Ställa in experimentellt protokoll i Flux analyzer programvara.
- Tilldela grupper och plåtkarta för varje villkor per plåtlayout.
- Utforma protokollet enligt injektionsstrategin (tabell 3 och figur 1).
OBS: När du kör analyskörningar kan injektion C och D utelämnas. - Spara analysen, fyll i den information som krävs för att inkluderas för analysen och tryck på Start.
- Flödesanalysatorn kommer att be om sensorpatronen som är förberedd i avsnitt 3.5. Ta bort locket och sätt i sensorpatronen enligt analysatorns anvisningar.
OBS: Analysen kalibrerar och kontrollerar sensorer som indikeras av bockar. Efter lyckad kalibrering kommer analysatorn att begära XF-cellodlingsplattan som bereds i avsnitt 3.3. Verktygsplattan matas ut från analysatorn och ersätts med XF-cellodlingsplattan för att starta analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En korrekt bestämning av OxPhos egenskaper är ett oumbärligt verktyg när man studerar T-celler. Om analysvillkoren inte har optimerats finns det dock en betydande risk för vilseledande eller felaktiga resultat. I detta protokoll finns ett starkt fokus på optimering av cellnummer per brunn och koncentrationer av oligomycin och FCCP som ska användas. I den beskrivna installationen läggs oligomycin och FCCP stegvis till samma brunn, vilket ökar koncentrationen av mitokondriella modulatorer. Den optimala koncentrationen av oligomycin och FCCP kan bestämmas utifrån de resulterande OCR-kurvorna i brunnarna och koncentrationen där en platå uppnås.
I den representativa körningen tillsätts oligomycin i en ökande koncentration och hämmar ATP-syntas (komplex V i elektrontransportkedjan), vilket resulterar i minskad mitokondriell andning. En platå i OCR uppnås efter att den ackumulerade koncentrationen av brunnarna nått 1 μM. Från denna koncentration och ökande koncentrationer minskades inte OCR ytterligare (figur 1A). För brunnar som behandlats med en inkrementell koncentration av icke-frikopplaren FCCP ökade OCR-nivåerna som förväntat tills en platå efter 0,2 μM FCCP tillsattes, vilket indikerar att full frikoppling erhölls vid denna koncentration (figur 1B). En optimering av celler pläterade per brunn är viktigt för en korrekt och reproducerbar analys. Om det använda cellnumret är för lågt är den syrenivå som avlägsnas från analysmediet av cellerna för låg för att mätas korrekt av analysatorn. Å andra sidan, om antalet celler per brunn är för högt, kan cellernas syreförbrukning bli så hög att systemet inte kan fylla på syrenivåerna i analysmediet efter varje mätning, vilket leder till en alltmer hypoxisk miljö och felaktig OxPhos-karakterisering.
I den representativa körningen såddes cellerna med en densitet av 200 000 och 400 000 celler per brunn (figur 2A-C). För en körning med 200 000 celler är den ursprungliga OCR ungefär hälften av en körning med 400 000 celler per brunn. För FCCP-behandling är maximal OCR 61,6 pmol/min (200 000 celler) jämfört med 190,4 pmol/min (400 000 celler). Efter oligomycinbehandling kollapsar OCR i körning med 200 000 celler till ensiffrig OCR (6,4 pmol/min). Detta är lägre än OCR i körningen, med 400 000 celler per väl behandlad med oligomycin (25, 8 pmol/min).
Därför är det tydligt att ett cellnummer på 400 000 celler per brunn krävdes för framtida analyser, med hjälp av 1 μM oligomycin och 0,2 μM FCCP. I den klassiska installationen som rekommenderas av tillverkaren tillsätts oligomycin och FCCP sekventiellt med det slutliga tillägget av antimycin A. För T-celler är detta inte det optimala tillvägagångssättet eftersom oligomycinbehandlingen kan ses för att begränsa frikopplingen efter FCCP-behandling (figur 3A, B). I denna presenterade metod rekommenderas att köra varje villkor i dubbla brunnar och behandla en bra med oligomycin och den andra med FCCP, med ett slutligt tillägg av antimycin A för båda brunnarna. Genom att använda detta tillvägagångssätt påverkar oligomycinbehandlingen inte OCR efter FCCP- behandling. Detta tillvägagångssätt möjliggör bestämning av samma mitokondriella egenskaper som den klassiska inställningen, där droger tillsätts i följd (figur 3C)
Slutligen undersöktes det om effekterna av cytokiner IL-2 och IL-15 kunde differentieras på metabolismen av ex vivo odlade mänskliga primära T-celler. Il-15 odlade celler hade högre maximal andning och outnyttjad andningskapacitet, vilket har visats tidigare (figur 4A-E). Basal andning och ATP produktion påverkades inte. Sammantaget visar dessa data att mitokondriell andning av ex vivo odlade mänskliga primära T-celler kan framgångsrikt analyseras med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn.
Figur 1: Syreförbrukningshastighet (OCR) mätt under titrering av inhibitorer oligomycin och FCCP i ex vivo odlade mänskliga primära T-celler. (A) OCR under stegvis titrering av oligomycin från 0-1,25 μM slutlig koncentration. B) OCR under stegvis titrering av FCCP från 0–0,5 μM slutlig koncentration. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Cellkoncentrationens påverkan på OCR-mätningar i ex vivo odlade mänskliga primära T-celler. OCR-mätningar av ex vivo odlade mänskliga primära T-celler med 200 000 eller 400 000 celler per brunn efter injektion av antingen (A) FCCP eller (B) Oligomycin. (C) Basal andning, maximal andning, ATP-produktion och outnyttjad andningskapacitet hos mänskliga primära T-celler med hjälp av 200 000 eller 400 000 celler per brunn. Representant för tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Enstaka eller sekventiell injektion av mitokondriella modulatorer. (A) Representativa OCR-mätningar under baslinjen och efter injektion av oligomycin och FCCP (a,b) eller antimycin A (c) som enstaka individuella injektioner eller som sekventiella injektioner. (B) OCR-värden före injektion (basal andning) eller efter injektion av oligomycin eller FCCP som enstaka injektioner eller sekventiella injektioner. C) Schematisk representation av injektions- och mätstrategi. Representant för ett oberoende experiment Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Skillnader i mitokondriell andning i cytokin-differentierade mänskliga primära T-celler. (A-D) Basal andning, maximal andning, ATP-produktion och outnyttjad andningsförmåga hos mänskliga primära T-celler odlade med IL-2 eller IL-15 i sju dagar (n = 3). E) Representativa intriger av (A-D), med injektioner av Oligomycin eller FCCP a eller antimycin A b. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Cytokin | [Lager] | Utspädningsfaktorn | [Slutlig] | |
| Villkor 1 | IL-2 | 3 x 106 U/mL | 30,000 | 100 U/ml |
| Villkor 2 | IL-15 | 2 x 105 U/mL | 2,000 | 100 U/ml |
Tabell 1: Beredning av cytokinkulturer som används för att vägleda metaboliska förändringar i T-celler.
| Oligomycin | FCCP | |||||
| Arbetar sol. | Sista insläpp. | Vol. | Arbetar sol. | Sista insläpp. | Vol. | |
| Port A | 5.0 μM | 0.50 μM | 20 μL | 2.0 μM | 0.2 μM | 20 μL |
| Port B | 3.0 μM | 0.75 μM | 22 μL | 1.30 μM | 0.3 μM | 22 μL |
| Port C | 3.0 μM | 1.0 μM | 24 μL | 1.30 μM | 0.4 μM | 24 μL |
| Port D | 3.0 μM | 1.25 μM | 27 μL | 1.30 μM | 0,5 μM | 27 μL |
Tabell 2: Strategi för beredning av mitokondriella hämmare och modulatorer. Beredningskoncentrationer, arbetskoncentrationer och injektionsstrategier för en optimeringskörning.
| Handling | Detaljer | Mätinformation |
| Baslinje | Baslinjemätningar | 3 mätningar |
| Injektion | Port A injektion | 3 mätningar |
| Injektion | Port B injektion | 3 mätningar |
| Injektion | Port C injektion | 3 mätningar |
| Injektion | Port D injektion | 3 mätningar |
| Mått | Ytterligare mätningar | Valfri |
Tabell 3: Protokolldesign av en optimeringskörning med titrering av mitokondriella hämmare och modulatorer med 4 injektioner med 3 mätningar i varje.
| Element av mitokondriell oxidativ fosforylering | Förklaring | ||
| Basal andning | Basal andning är ett baslinjemått på den syrehastighet som förbrukas av de stimulerade T-cellerna före tillsats av mitokondriella hämmare. Det är ett mått på syreförbrukningen som används för att möta cellulär ATP-efterfrågan till följd av mitokondriell protonläckage. Som sådan ger det en översikt över protonströmmen som genereras för att leverera ATP-syntes och protonläckage. Men det är också ett mått som kan ändras beroende på de substrat som finns i tillväxtmediet, stimulering av celler före analys och andra extrinsiska faktorer. Den basala andningen är därför ett mått som används för att jämföra två eller flera olika celltyper och/eller olika behandlingar som tros påverka cellernas cellulära metaboliska tillstånd. Basal andning beräknas som skillnaden i OCR innan du lägger till några mitokondriella modulatorer (oligomycin eller FCCP) och efter tillsats av antimycin A |
||
| Maximal andning | Detta mått är den maximala syrehastigheten som kan konsumeras för oxidativ fosforylering. Den syrehastighet som förbrukas av oxidativ fosforylering bestäms både av elektrontransportkedjans förmåga att pumpa protoner över det inre mitokondriella membranet och ATP-syntasens förmåga att använda protongradienten för att fosforytera ATP från ADP. Hastigheten på ATP-syntasen begränsas av fritt ADP-substrat och därmed av cellens allmänna energiska tillstånd. Vid behandling av cellerna med mitokondriellt frikopplingsdjur FCCP kan protoner fritt korsa tillbaka över det inre mitokondriella membranet. Detta efterliknar en situation där cellerna upplever ett omättligt energibehov, och den maximala andningen är därför ett mått på den maximala syrehastigheten som kan konsumeras av elektrontransportkedjan. Maximal andning beräknas som skillnaden i OCR av celler som behandlats med FCCP och celler som behandlats med antimycin A |
||
| ATP-omsättning | ATP-länkad andning mäts som skillnaden i OCR efter hämning av ATP-syntasen med oligomycin. Det syre som annars skulle konsumeras för fosforylering av ADP genom oxidativ fosforylering kommer inte längre att användas eftersom denna process arresteras. ATP-länkad andning är därför relativ till ATP som produceras genom oxidativ fosforylering. Förändringar i AT-länkad andning är ett svar från mitokondrierna på ett förändrat ATP-krav på cellen ATP-länkad andning beräknas som skillnaden i OCR innan du lägger till några mitokondriella modulatorer (oligomycin eller FCCP) och efter tillsats av oligomycin |
||
| Extra andningskapacitet | Den extra andningskapaciteten är ett mått på en teoretisk extra kapacitet att producera ATP som ett svar på en ökad energisk efterfrågan. Det definieras som skillnaden mellan basal andning och maximal andning. Förändringar i extra andningskapacitet kan vara en indikator på mitokondriell och cellkondition och flexibilitet. | ||
Tabell 4: Förklaring av de olika komponenterna i mitokondriell andning som studeras med hjälp av flödesanalysatorn
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detaljerad och korrekt kvantifiering av oxidativ fosforylering är ett oumbärligt verktyg när man beskriver T-cellernas energitillstånd. Tillståndet för mitokondriell kondition kan vara direkt relaterat till T-cellsaktiveringspotential, överlevnad och differentiering1,5. Med detta protokoll är det möjligt att bestämma de olika egenskaperna hos oxidativ fosforylering (se tabell 4 för en detaljerad förklaring). Exakt kvantifiering av dessa egenskaper hos oxidativ fosforylering ger en detaljerad inblick i T-cellernas energitillstånd. Men för att få tillförlitliga resultat måste stor försiktighet iakttas när experimentet ställs in.
I det här protokollet rekommenderas de tre följande optimeringsstegen först, optimering av cellnummer. Förmågan hos en flödesanalysator att korrekt mäta syrekoncentrationer följer en sigmoidkurva; förändringar i syre som är för små eller för stora kommer att falla utanför maskinens driftsintervall och kommer därför inte att mätas korrekt. Detta kräver en optimering av cellnummer som ska användas under hela experimentet. Om för få celler analyseras är förändringarna i syreförbrukningen för låga för att mätas korrekt. Om för många celler finns det risk för syrebrist i analysmediet. En första körning rekommenderas därför, med cellnummer från 100 000-400 000 celler per brunn. Vid plottning av cellnummer kontra basal andning kommer det optimala cellantalet att vara i kurvans linjära intervall. När du optimerar installationen, var medveten om att det kan finnas en exponentiell skillnad i mitokondriell aktivitet mellan vilande och aktiverade celler, och måste därför optimeras i enlighet därmed.
För det andra, titrering av inhibitorkoncentrationer. Vid behandling av cellerna med oligomycin och FCCP är det viktigt att identifiera de optimala koncentrationerna av de inhibitorer som ska användas. En för låg koncentration resulterar i en suboptimal hämning och en felaktig mätning av mitokondriell andning. Det är vanligt att människor använder de högsta rekommenderade koncentrationerna av inhibitorerna för att säkerställa att en fullständig hämning erhålls. Detta är också problematiskt eftersom för höga koncentrationer av inhibitorerna kan ha pleiotropiska effekter. Uncouplers som FCCP utövar också sina effekter på andra membran än mitokondriell, vilket resulterar i en rad oönskade effekter, inklusive plasmamembran depolarisering, mitokondriell hämning, och cytotoxicitet. I detta protokoll görs titrering av oligomycin och FCCP samtidigt med cellnummeroptimering. Under en optimeringskörning tillsätts ökande koncentrationer av oligomycin eller FCCP med hjälp av de fyra tillgängliga substratportarna. I det resulterande OCR-diagrammet kan den optimala koncentrationen visuellt bestämmas som den koncentration vid vilken OCR når en stadig platå. När koncentrationen av oligomycin och FCCP har titrerats ska dessa koncentrationer användas under hela försöket.
För det tredje, sekventiell kontra enskilt individuellt tillägg av inhibitorer. Klassiska seahorse analyser utförs vanligtvis med sekventiell tillsats av den första oligomycin följt av tillsats av FCCP. I T-celler och andra känsliga celler kan ett sådant sekventiellt tillägg resultera i en felaktig kvantifiering av maximal andning. I sin tur kommer de uppmätta nivåerna av extra andningskapacitet att rapportera lägre än de är. Allvarliga exempel på detta inkluderar värden för extra andningskapacitet som är negativa. Detta är naturligtvis inte biologiskt möjligt och orsakas av en presensibilisering av mitokondrierna genom oligomycinbehandling. I detta protokoll rekommenderas istället att celler endast behandlas med antingen oligomycin eller FCCP (se figur 3C för illustrativ jämförelse).
Slutligen används detta optimerade protokoll för att visa hur IL-15-kompletterade mänskliga primära T-cellkulturer tydligt kan skiljas från IL-2-kompletterade celler baserat på deras mitokondriella andning. IL-15-odlade celler har högre maximal andning och extra andningskapacitet, ett metaboliskt tillstånd kopplat till minne T-celler1,6. Dessa observationer är i linje med tidigare studier som länkar IL-15 till minne T cell subsets8. Dessutom observerades en skillnad i basal andning men inte i ATP produktion jämfört med IL-2-odlade celler. Detta indikerar att dessa celler använder sin glykolytiska kapacitet för att uppfylla basala metaboliska krav, en väg som är associerad med mer differentierade celler. Sammantaget, Det visas att en mänskligt minne T cell modell kan fastställas in vitro med hjälp av IL-15 tillskott. Att använda en IL-15-rik miljö för att främja utvecklingen av minnesceller har tidigare visats och stöder ytterligare resultaten8.
I denna metod, oligomycin, FCCP, och antimycin A har använts för att kvantifiera egenskaperna hos OxPhos. Andra föreningar finns med liknande effekter, som potentiellt skulle vara bättre lämpade för T-celler. Ett exempel skulle vara att använda uncoupler BAM15 istället för FCCP för att minska depolariseringen av mitokondriellt membran och för att undvika cytotoxicitet9. I denna metod, dessa föreningar har inte övervägts, som oligomycin, FCCP, och antimycin A har varit de rekommenderade mitokondriella modulatorerna för Seahorse experiment under det senaste decenniet. Användningen av dessa föreningar är därför erkänd av granskare och andra forskare som arbetar med OxPhos. Mer erfarna användare av Seahorse flux analysator uppmuntras att använda dessa alternativa föreningar, men användningen av dessa ligger utanför ramen för detta papper.
Övervakning av mitokondriella OxPhos är ett viktigt verktyg för att förstå T-cellsfunktionen och förbättra cancerimmunterapier. Som tidigare nämnts visades IL-15 expanderade celler - med en mindre differentierad minnesfenotyp - förbättra svaren på CAR T-cellterapier, eftersom de var mindre uttömda och hade en ökad antitumöraktivitet10. Detta optimerade protokoll kan vara ett effektivt verktyg för att studera kvaliteten på T-celler i både prekliniska och kliniska miljöer. Sammanfattningsvis implementerar detta protokoll steg för att optimera celltal och inhibitorkoncentrationer för användning av ex vivo odlade mänskliga primära T-celler i metaboliska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Kasper Mølgaard och Anne Rahbech fick bidrag från Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaardalso fick ett stipendium från Børnecancerfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
