تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستزرعة وأعمدة العظام المعزولة
Summary
يقدم هذا البروتوكول مقايسة امتصاص الأحماض الأمينية المشعة ، وهو مفيد لتقييم استهلاك الأحماض الأمينية إما في الخلايا الأولية أو في العظام المعزولة.
Abstract
يعتمد نمو العظام والتوازن على تمايز ونشاط الخلايا العظمية المكونة للعظام. يتميز تمايز Osteoblast بالتتابع عن طريق الانتشار يليه تخليق البروتين وفي النهاية إفراز مصفوفة العظام. يتطلب الانتشار وتخليق البروتين إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. على الرغم من ذلك ، لا يعرف سوى القليل جدا عن استهلاك الأحماض الأمينية في الخلايا العظمية. هنا نصف بروتوكولا حساسا للغاية تم تصميمه لقياس استهلاك الأحماض الأمينية باستخدام الأحماض الأمينية المشعة. تم تحسين هذه الطريقة لتحديد التغيرات في امتصاص الأحماض الأمينية المرتبطة بانتشار الخلايا العظمية العظمية أو التمايز أو علاجات الأدوية أو عوامل النمو أو التلاعب الجيني المختلف. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة بالتبادل لتحديد استهلاك الأحماض الأمينية في خطوط الخلايا المستزرعة أو الخلايا الأولية في المختبر أو في أعمدة العظام المعزولة خارج الجسم الحي. أخيرا ، يمكن تكييف طريقتنا بسهولة لقياس نقل أي من الأحماض الأمينية وكذلك الجلوكوز والمواد المغذية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية.
Introduction
الأحماض الأمينية هي مركبات عضوية تحتوي على مجموعات وظيفية أمينية (-NH2) وكربوكسيل (-COOH) مع سلسلة جانبية متغيرة خاصة بكل حمض أميني. بشكل عام ، تعرف الأحماض الأمينية بأنها المكون الأساسي للبروتين. في الآونة الأخيرة ، تم توضيح الاستخدامات الجديدة ووظائف الأحماض الأمينية. على سبيل المثال ، يمكن استقلاب الأحماض الأمينية الفردية لتوليد مستقلبات وسيطة تساهم في الطاقة الحيوية ، أو تعمل كعوامل مساعدة إنزيمية ، أو تنظم أنواع الأكسجين التفاعلية أو تستخدم لتوليف الأحماض الأمينية الأخرى1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . تظهر العديد من الدراسات أن استقلاب الأحماض الأمينية أمر بالغ الأهمية لتعدد قدرات الخلايا وانتشارها وتمايزها في سياقات مختلفة3،6،11،12،13،14،15،16،17.
الخلايا العظمية هي خلايا إفرازية تنتج وتفرز مصفوفة العظام الغنية خارج الخلية من النوع 1 من الكولاجين. للحفاظ على معدلات عالية من تخليق البروتين أثناء تكوين العظام ، تتطلب الخلايا العظمية إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. لتلبية هذا الطلب ، يجب أن تكتسب الخلايا العظمية بنشاط الأحماض الأمينية. تمشيا مع هذا ، تكشف الدراسات الحديثة عن أهمية امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي في نشاط الخلايا العظمية العظمية وتكوين العظام15،16،17،18،19،20.
تكتسب الخلايا العظمية الأحماض الأمينية الخلوية من ثلاثة مصادر رئيسية: الوسط خارج الخلية ، وتدهور البروتين داخل الخلايا ، والتخليق الحيوي للأحماض الأمينية الجديدة. سيركز هذا البروتوكول على تقييم امتصاص الأحماض الأمينية من البيئة خارج الخلية. تعتمد الطرق الأكثر شيوعا لقياس امتصاص الأحماض الأمينية إما على الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية (على سبيل المثال ، 3H أو 14C) أو النظائر الثقيلة المصنفة (على سبيل المثال ، 13C). يمكن لمقايسات النظائر الثقيلة تحليل امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي بشكل أكثر شمولا وأمانا ولكنها تستغرق وقتا أطول في إكمالها لعدة أيام حيث يستغرق الأمر يوما لإعداد العينات واشتقاقها وعدة أيام للتحليل على مقياس الطيف الكتلي اعتمادا على عدد العينات21,22. وعلى سبيل المقارنة، فإن مقايسات امتصاص الأحماض الأمينية المصنفة إشعاعيا ليست مفيدة حول عملية التمثيل الغذائي في المراحل النهائية ولكنها رخيصة وسريعة نسبيا، حيث يمكن إكمالها في غضون 2-3 ساعات من بداية التجربة23,24. هنا ، نصف بروتوكولا أساسيا قابلا للتعديل بسهولة مصمم لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية المشعة في الخلايا الأولية المستزرعة أو خطوط الخلايا في المختبر أو أعمدة العظام الفردية خارج الجسم الحي. يمكن توسيع نطاق تطبيق هذين البروتوكولين ليشمل الأحماض الأمينية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية وغيرها من أنواع الخلايا والأنسجة المرتبطة بالعظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا سريعا وحساسا لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية استجابة لمختلف التباديل التجريبية إما في المختبر أو خارج الجسم الحي. بالمقارنة مع المجموعات المتاحة تجاريا (على سبيل المثال ، مجموعة تحديد الجلوتامين والغلوتامات) ، فإن هذه الطريقة أكثر حساسية وأسرع ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم مختبر كارنر من خلال منح المعهد الوطني للصحة R01 (AR076325 و AR071967) إلى C.M.K.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
