Evaluatie van aminozuurconsumptie in gekweekte botcellen en geïsoleerde botschachten
Summary
Dit protocol presenteert een radioactief gelabelde aminozuuropnametest, die nuttig is voor het evalueren van aminozuurconsumptie in primaire cellen of in geïsoleerde botten.
Abstract
Botontwikkeling en homeostase is afhankelijk van de differentiatie en activiteit van botvormende osteoblasten. Osteoblastdifferentiatie wordt sequentieel gekenmerkt door proliferatie gevolgd door eiwitsynthese en uiteindelijk botmatrixsecretie. Proliferatie en eiwitsynthese vereisen een constante toevoer van aminozuren. Desondanks is er zeer weinig bekend over aminozuurconsumptie bij osteoblasten. Hier beschrijven we een zeer gevoelig protocol dat is ontworpen om aminozuurconsumptie te meten met behulp van radioactief gelabelde aminozuren. Deze methode is geoptimaliseerd om veranderingen in aminozuuropname te kwantificeren die geassocieerd zijn met osteoblastproliferatie of -differentiatie, medicijn- of groeifactorbehandelingen of verschillende genetische manipulaties. Belangrijk is dat deze methode door elkaar kan worden gebruikt om aminozuurconsumptie in gekweekte cellijnen of primaire cellen in vitro of in geïsoleerde botschachten ex vivo te kwantificeren. Ten slotte kan onze methode eenvoudig worden aangepast om het transport van een van de aminozuren te meten, evenals glucose en andere radioactief gelabelde voedingsstoffen.
Introduction
Aminozuren zijn organische verbindingen die een amino (-NH2) en carboxyl (-COOH) functionele groepen bevatten met een variabele zijketen die specifiek is voor elk aminozuur. Over het algemeen staan aminozuren bekend als het basisbestanddeel van eiwitten. Meer recent zijn nieuwe toepassingen en functies van aminozuren opgehelderd. Individuele aminozuren kunnen bijvoorbeeld worden gemetaboliseerd om intermediaire metabolieten te genereren die bijdragen aan bio-energetica, functioneren als enzymatische cofactoren, reactieve zuurstofsoorten reguleren of worden gebruikt om andere aminozuren te synthetiseren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Veel studies tonen aan dat aminozuurmetabolisme van cruciaal belang is voor celpluripotentie, proliferatie en differentiatie in verschillende contexten 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblasten zijn secretoire cellen die de collageen type 1 rijke extracellulaire botmatrix produceren en afscheiden. Om hoge snelheden van eiwitsynthese tijdens botvorming te ondersteunen, vragen osteoblasten om een constante toevoer van aminozuren. Om aan deze vraag te voldoen, moeten osteoblasten actief aminozuren verwerven. In overeenstemming hiermee onthullen recente studies het belang van aminozuuropname en metabolisme in osteoblastactiviteit en botvorming 15,16,17,18,19,20.
Osteoblasten verwerven cellulaire aminozuren uit drie belangrijke bronnen: extracellulair milieu, intracellulaire eiwitafbraak en de novo aminozuurbiosynthese. Dit protocol zal zich richten op de evaluatie van aminozuuropname uit extracellulaire omgeving. De meest gebruikelijke methoden om de opname van aminozuren te meten, zijn afhankelijk van radioactief gelabelde (bijv. 3H of 14C) of zware isotoop gelabelde (bijv. 13C) aminozuren. Zware isotopomesten kunnen de opname en het metabolisme van aminozuren grondiger en veiliger analyseren, maar zijn tijdrovender en het duurt meerdere dagen om te voltooien, omdat het een dag duurt om monsters voor te bereiden en te derivatiseren en meerdere dagen om te analyseren op de massaspectrometer, afhankelijk van het aantal monsters21,22. Ter vergelijking: radioactief gelabelde aminozuuropnametests zijn niet informatief over het downstream-metabolisme, maar zijn goedkoop en relatief snel, omdat ze binnen 2-3 uur na het begin van het experiment kunnen worden voltooid 23,24. Hier beschrijven we een gemakkelijk te wijzigen basisprotocol dat is ontworpen om de opname van radioactief gelabelde aminozuren in gekweekte primaire cellen of cellijnen in vitro of individuele botschachten ex vivo te evalueren. De toepassing van deze twee protocollen kan worden uitgebreid naar andere radioactief gelabelde aminozuren en andere bot geassocieerde celtypen en weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierin beschreven protocol biedt een snelle en gevoelige benadering om de opname van aminozuren te evalueren als reactie op verschillende experimentele permutaties, hetzij in vitro of ex vivo. In vergelijking met in de handel verkrijgbare kits (bijv. Glutamine en Glutamaat Determination Kit), is deze methode veel gevoeliger, sneller en minder arbeidsintensief 16,17,25. In ons protocol evalueren we de opname…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het Karner-lab wordt ondersteund door R01-subsidies van het National Institute of Health (AR076325 en AR071967) aan C.M.K.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
References
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
