Summary
Questo protocollo presenta le procedure sperimentali per eseguire il test dell'impronta di adesione per visualizzare gli eventi di adesione durante l'adesione a laminazione rapida delle cellule.
Abstract
L'adesione a rotolamento, facilitata da interazioni mediate dalla selectina, è una motilità passiva altamente dinamica nel reclutamento di leucociti nel sito di infiammazione. Questo fenomeno si verifica nelle venule postcapillari, dove il flusso sanguigno spinge i leucociti in un movimento rotolante sulle cellule endoteliali. La laminazione stabile richiede un delicato equilibrio tra la formazione del legame di adesione e la loro dissociazione guidata meccanicamente, consentendo alla cella di rimanere attaccata alla superficie mentre rotola nella direzione del flusso. A differenza di altri processi di adesione che si verificano in ambienti relativamente statici, l'adesione di rotolamento è altamente dinamica poiché le celle di laminazione viaggiano su migliaia di micron a decine di micron al secondo. Di conseguenza, i metodi convenzionali di meccanobiologia come la microscopia della forza di trazione non sono adatti per misurare i singoli eventi di adesione e le forze molecolari associate a causa del breve lasso di tempo e dell'elevata sensibilità richiesta. Qui, descriviamo la nostra ultima implementazione del test dell'impronta di adesione per visualizzare le interazioni P-selectin: PSGL-1 nell'adesione rolling a livello molecolare. Questo metodo utilizza legami irreversibili di tensometro basati sul DNA per produrre una storia permanente di eventi di adesione molecolare sotto forma di tracce di fluorescenza. Queste tracce possono essere fotografate in due modi: (1) cucire insieme migliaia di immagini limitate alla diffrazione per produrre un ampio campo visivo, consentendo l'estrazione dell'impronta di adesione di ogni cellula di rotolamento su migliaia di micron di lunghezza, (2) eseguire DNA-PAINT per ricostruire immagini a super-risoluzione delle tracce di fluorescenza all'interno di un piccolo campo visivo. In questo studio, il test dell'impronta di adesione è stato utilizzato per studiare le cellule HL-60 che rotolano a diverse sollecitazioni di taglio. In tal modo, siamo stati in grado di visualizzare la distribuzione spaziale dell'interazione P-selectina: PSGL-1 e ottenere informazioni sulle loro forze molecolari attraverso l'intensità della fluorescenza. Pertanto, questo metodo fornisce le basi per l'indagine quantitativa delle varie interazioni cellula-superficie coinvolte nell'adesione a rotolamento a livello molecolare.
Introduction
La cascata di adesione a rotolamento descrive come le cellule circolanti si legano e rotolano lungo la parete dei vasi sanguigni1. Il rotolamento passivo è mediato principalmente dalle selectine, una delle principali classi di molecole di adesione cellulare (CAM)1. Sotto il flusso di taglio del sangue, i leucociti che esprimono il ligando-1 della glicoproteina P-selectina (PSGL-1) formano legami altamente transitori con la P-selectina, che possono essere espressi sulla superficie delle cellule endoteliali infiammate. Questo processo è fondamentale affinché i leucociti migrino verso un sito di infiammazione2. Inoltre, PSGL-1 è anche un recettore meccanosensibile in grado di innescare la successiva fase di adesione ferma della cascata di adesione rotolante al momento del suo impegno con P-selectina3.
Le mutazioni genetiche che influenzano la funzione CAM possono influenzare gravemente il sistema immunitario, come nella malattia rara del deficit di adesione leucocitaria (LAD), dove il malfunzionamento delle molecole di adesione che mediano il rolling porta a individui gravemente immunocompromessi4,5,6. Inoltre, è stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti migrano seguendo un processo di rotolamento simile, portando a metastasi7,8. Tuttavia, poiché il rotolamento cellulare è veloce e dinamico, i metodi convenzionali di meccanobiologia sperimentale non sono adatti per studiare le interazioni molecolari durante il rotolamento cellulare. Mentre i metodi di manipolazione a singola cellula e singola molecola come la microscopia a forza atomica e la pinzetta ottica sono stati in grado di studiare le interazioni molecolari come l'interazione forza-dipendente di P-selectina con PSGL-1 a livello di singola molecola9, non sono adatti per studiare eventi di adesione dal vivo durante il rotolamento cellulare. Inoltre, l'interazione caratterizzata in vitro non può rispondere direttamente alla domanda sull'adesione molecolare in vivo. Ad esempio, quale intervallo di tensione molecolare è biologicamente rilevante quando le cellule funzionano nel loro ambiente nativo? Metodi computazionali come la simulazione della dinamica adesiva10 o il semplice modello a stato stazionario11 hanno catturato alcuni dettagli molecolari e il modo in cui influenzano il comportamento di rotolamento, ma dipendono fortemente dall'accuratezza dei parametri e delle ipotesi di modellazione. Altre tecniche come la microscopia a forza di trazione possono rilevare le forze durante la migrazione cellulare, ma non forniscono una risoluzione spaziale sufficiente o informazioni quantitative sulla tensione molecolare. Nessuna di queste tecniche può fornire osservazioni sperimentali dirette delle dinamiche temporali, della distribuzione spaziale e dell'eterogeneità di grandezza delle forze molecolari, che si riferiscono direttamente alla funzione e al comportamento delle cellule nel loro ambiente nativo.
Pertanto, l'implementazione di un sensore di forza molecolare in grado di misurare con precisione le interazioni selectin-mediate è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dell'adesione al rotolamento. Qui descriviamo il protocollo per il test dell'impronta di adesione12 in cui le perle rivestite di PSGL-1 vengono laminate su una superficie che presenta cavi di tensometro funzionalizzati p-selectin (TGT)13. Questi TGT sono sensori di forza irreversibili basati sul DNA che si traducono in una storia permanente di eventi di rottura sotto forma di lettura della fluorescenza. Ciò si ottiene attraverso la rottura del TGT (dsDNA) e quindi la successiva etichettatura del TGT rotto (ssDNA) con un filamento complementare marcato fluorescentemente. Uno dei principali vantaggi di questo sistema è la sua compatibilità sia con l'imaging a diffrazione limitata che con quella a super-risoluzione. Il filamento complementare marcato fluorescentemente può essere legato in modo permanente (>12 bp) per l'imaging limitato alla diffrazione o legato transitoriamente (7-9 bp) per l'imaging a super-risoluzione attraverso DNA PAINT. Questo è un sistema ideale per studiare l'adesione al rotolamento poiché i TGT si rompono durante la laminazione attiva, ma la lettura della fluorescenza viene analizzata dopo la laminazione. I due metodi di imaging offrono inoltre all'utente una maggiore libertà di indagare sull'adesione a rotolamento. In genere, l'imaging a diffrazione limitata è utile per estrarre la forza di rottura molecolare attraverso l'intensità di fluorescenza13, mentre l'imaging a super-risoluzione consente l'analisi quantitativa della densità del recettore. Con la capacità di studiare queste proprietà dell'adesione a rotolamento, questo approccio fornisce una piattaforma promettente per comprendere il meccanismo di regolazione della forza sull'adesione molecolare delle cellule di rotolamento sotto flusso di taglio.
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Protocol
1. Marcatura e ibridazione degli oligonucleotidi
- Riduzione dei legami disolfuro della proteina G
- Sciogliere 10 mg di Proteina G (ProtG) in 1 mL di acqua ultrapura.
NOTA: La proteina G qui è modificata con un singolo residuo di cisteina al C-terminus e un tag di poli-istidina N-terminus. - Scambio tampone ≥20 μL di ProtG (10 mg/mL) in 1x PBS (pH 7,2) con una colonna P6.
- Misurare la concentrazione proteica dopo lo scambio tampone.
NOTA: Concentrazione tipica di 7-8 mg/mL. - Preparare 120 mM di Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) sciogliendo 3 mg di TCEP in 90 μL di 1x PBS (pH 7,2) seguiti da 10 μL di 0,5 M EDTA.
NOTA: TCEP deve essere preparato al momento. - Aggiungere 4 μL di 120 mM TCEP (480 nmol) a 20 μL di ProtG (4-5 nmol).
NOTA: Mirare a un rapporto molare di ~ 100: 1 TCEP alle proteine. - Lasciare procedere la reazione per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere il TCEP in eccesso dal ProtG ridotto con una colonna P6 (tampone scambiato in 1x PBS, pH 7,2).
- Misurare la concentrazione del ProtG ridotto con uno spettrofotometro UV/Vis e salvare gli spettri.
NOTA: Concentrazione tipica di 3,5-4,5 mg/ml.
- Sciogliere 10 mg di Proteina G (ProtG) in 1 mL di acqua ultrapura.
- Reazione ssDNA marcata con ammina con Sulfo-SMCC
- Sciogliere l'ssDNA (amine-ssDNA) etichettato con ammina in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 1 mM. Verificare la concentrazione del filamento con uno spettrofotometro UV/Vis.
- Preparare 11,5 mM di sulfo-SMCC (un reticolante etero-bifunzionale con estere sulfo-NHS e maleimmide) soluzione fresca sciogliendo 2 mg di sulfo-SMCC in 400 μL di acqua ultrapura e vortice da miscelare.
- Aggiungere 6 μL di 1 mM ammina-ssDNA (6 nmol) a 5,2 μL di 11,5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) e 88,8 μL di 1x PBS (pH 7,2). Vortice per 5 s seguito da centrifugazione a 8600 x g per 3 min.
- Lasciare procedere la reazione per 30 minuti a RT.
- Rimuovere l'eccesso di sulfo-SMCC dall'ammina-ssDNA coniugato SMCC (mal-ssDNA) con una colonna P6 (tampone scambiato in 1x PBS, pH 7.2).
- Misurare la concentrazione del mal-ssDNA con uno spettrofotometro UV/Vis e salvare gli spettri.
NOTA: Concentrazione tipica di 35-45 μM.
- Coniugazione ProtG-ssDNA
- Aggiungere 21 μL di ProtG ridotto da 4,5 mg/mL (3 nmol) al mal-ssDNA (~4-5 nmol).
NOTA: volumi e concentrazioni qui sono valori tipici. Regolare in base alla misurazione sperimentale individuale. Assicurarsi sempre una quantità eccessiva di mal-ssDNA rispetto a ProtG con un rapporto di ~ 1,5: 1. - Vortice per 5 s e lasciare che la reazione proceda per 3 ore a RT.
- Aggiungere 21 μL di ProtG ridotto da 4,5 mg/mL (3 nmol) al mal-ssDNA (~4-5 nmol).
- Purificazione e caratterizzazione del ProtG-ssDNA
- Purificare il ProtG-ssDNA coniugato attraverso l'isolamento his-tag con perle magnetiche di acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA).
- Rimuovere l'imidazolo in eccesso (tampone di eluizione Ni-NTA) dal prodotto con una colonna P6 (tampone scambiato in 1x PBS, pH 7,2).
NOTA: Questo passaggio è essenziale per quantificare la coniugazione, poiché l'imidazolo ha un assorbimento significativo a 280 nm. - Utilizzare uno spettrofotometro UV/Vis per registrare gli spettri del prodotto ProtG-ssDNA e il tampone di eluizione Ni-NTA (1x).
NOTA: l'assorbanza tipica di ProtG-ssDNA a 260 nm e 280 nm è rispettivamente 0,8 e 0,6. - Per determinare l'efficienza di coniugazione e il rapporto tra ProtG e ssDNA, utilizzare lo script MATLAB scritto su misura (Supplemental Coding File 1) per scomporre lo spettro di prodotti finali in base ai tre spettri raccolti in precedenza (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer).
NOTA: in breve, il codice funziona come descritto nei passaggi 1.4.5-1.4.8. La concentrazione tipica è di 4 μM di ProtG-ssDNA con ProtG e ssDNA in un rapporto molare ~1:1 (Figura 2A). - Immettere ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead e gli spettri ProtG-ssDNA UV/Vis nello script MATLAB
- Eseguire una minimizzazione non lineare multidimensionale non vincolata per ricostruire gli spettri ProtG-ssDNA dagli spettri sorgente (spettri del buffer di eluizione di perline ProtG, SMCC e Ni-NTA)
NOTA: la funzione di minimizzazione restituisce tre fattori di trasformazione, uno per ogni spettro di origine. - Ricostruire gli spettri ProtG-ssDNA moltiplicando gli spettri per il loro fattore corrispondente e combinando gli spettri sorgente trasformati.
- Moltiplicare la concentrazione iniziale del filamento ProtG e SMCC per i corrispondenti fattori di trasformazione per determinare le concentrazioni di filamento SMCC e ProtG nel prodotto ProtG-ssDNA.
- (FACOLTATIVO) Eseguire PAGE nativo in base alla Figura 2B per garantire che ogni componente e passaggio funzioni come previsto.
- Ibridazione TGT
- Ibridare ProtG-ssDNA (filamento superiore) con filamento inferiore biotinilato ad un rapporto molare di 1,2:1 con concentrazioni rispettivamente di 240 nM e 200 nM in tampone T50M5 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) per ibridare l'intero costrutto TGT. Lascia ibridare a RT ≥1 h.
2. PEGilazione superficiale
- Pulizia delle superfici
- Pulire un pallone Erlenmeyer e due barattoli di colorazione ogni 8 coverslips. Riempire ogni contenitore con 1 M KOH soluzione e sonicare per 1 ora a RT. Lavare accuratamente ogni contenitore con acqua ultrapura e asciugare con N2 o in un forno.
NOTA: riempire il KOH verso l'alto per toccare il coperchio, in modo che vengano puliti. - Risciacquare accuratamente ogni coverslip con acqua ultrapura e metterli in uno dei barattoli di colorazione puliti.
NOTA: Assicurarsi che non siano attaccati l'uno all'altro o alla parete dei barattoli di colorazione. - In una cappa aspirante, preparare al momento una soluzione di piranha aggiungendo 30 ml di perossido di idrogeno (30%) a 90 ml di acido solforico concentrato (95%-98%) in un becher da 250 ml.
ATTENZIONE: l'acido solforico concentrato è altamente corrosivo. Aggiungere il perossido di idrogeno molto lentamente all'acido solforico e ruotare accuratamente per mescolare. - Immergere completamente le coperture nel barattolo di colorazione con la soluzione di piranha. Lasciare le coperture in piranha per 30 minuti nella cappa aspirante.
ATTENZIONE: Raffreddare la soluzione di piranha a non più di 80 °C prima di versarla per evitare di rompere il barattolo di colorazione. - Scartare la soluzione di piranha in un becher da 1000 ml e neutralizzare con 1 M KOH dalla pulizia del vetro.
- (FACOLTATIVO) Ripetere la pulizia del piranha (passaggi 2.1.3-2.1.5) con una soluzione di piranha fresca.
- Risciacquare le coperture con abbondanti quantità di acqua ultrapura per rimuovere tutta la soluzione residua di piranha. Agitare delicatamente il barattolo di colorazione durante ogni salita per facilitare la rimozione (si consigliano 10 risciacqui).
- Risciacquare le coperture con metanolo 3 volte per rimuovere l'acqua dalla superficie del coverslip e mantenere le coverslips immerse nel metanolo.
- Pulire un pallone Erlenmeyer e due barattoli di colorazione ogni 8 coverslips. Riempire ogni contenitore con 1 M KOH soluzione e sonicare per 1 ora a RT. Lavare accuratamente ogni contenitore con acqua ultrapura e asciugare con N2 o in un forno.
- Silanizzazione superficiale
- Preparare una soluzione di aminosilano all'1% mescolando accuratamente 94 mL di metanolo, 1 mL di aminosilano e 5 ml di acido acetico glaciale nel matraccio Erlenmeyer pulito ed essiccato. Versare nel secondo barattolo di colorazione pulito e asciugato14.
- Trasferire le coperture immerse sotto la soluzione di metanolo nel barattolo di colorazione contenente soluzione di aminosilano all'1% e mantenere il barattolo coperto.
NOTA: non lasciare asciugare i coperchi durante il trasferimento ad aminosilane per limitare l'esposizione della superficie del vetro all'aria. - Incubare il barattolo di colorazione contenente coverslips in aminosilane per 1 ora a 70 °C in un forno15.
- Scartare con attenzione la soluzione di aminosilano in un contenitore separato per i rifiuti e risciacquare i coperchi nel barattolo di colorazione con metanolo 5 volte per rimuovere la soluzione di aminosilano.
- Risciacquare le coperture nel barattolo di colorazione con acqua ultrapura 5 volte e asciugarle con N2.
- Cuocere le coperture essiccate nel barattolo di colorazione in forno a 110 °C per 20 minuti. Lasciare raffreddare i coverslip a RT, quindi posizionarli sul rack PEGylation.
NOTA: Coprire il barattolo di colorazione con un coperchio durante la cottura per ridurre al minimo la deposizione particolare e chimica sulla superficie15.
- Preparazione della soluzione PEG
- Scongelare PEG (Polietilenglicole) e PEG-biotina a RT per circa 30 min.
NOTA: questo passaggio riduce al minimo la condensa di umidità che può degradare l'estere NHS su PEG. - Fare tampone PEG aggiungendo 84 mg di bicarbonato di sodio a 10 ml di acqua ultrapura. Questa formulazione dovrebbe fornire un tampone a pH 8,4.
- Per 8 coverslip, ciascuno con un lato PEGilato con 20:1 PEG:PEG-biotina: misurare 100 mg di PEG e 5 mg di PEG-biotina da aggiungere a 400 μL di tampone PEG. Vortice la soluzione per 30 s e centrifuga per 1 min alla velocità massima (≥18000 x g).
NOTA: Questo passaggio è sensibile al tempo, poiché l'idrolisi dell'estere SVA NHS inizia immediatamente e ha un'emivita di 34 minuti a pH 8,0, con un'emivita più breve a pH 8,4.
- Scongelare PEG (Polietilenglicole) e PEG-biotina a RT per circa 30 min.
- Incubazione PEG e stoccaggio coverslip
- Impostare la camera di umidità e posizionare i coperchi all'interno.
- Aggiungere 90 μL di soluzione PEG a un coverslip nella camera di umidità e posizionare un secondo coverslip sopra la soluzione PEG utilizzando una pinzetta coverslip per distribuire uniformemente la soluzione PEG.
- Assicurarsi che non ci siano bolle nella soluzione lasciata cadere sul coperchio. Abbassa un'estremità del secondo coverslip sul primo coverslip e rilascia lentamente l'altra estremità in modo che non ci siano bolle inserite tra le coverslip.
NOTA: le bolle faranno sì che alcune aree siano scarsamente PEGilate. - Ripeti fino a quando tutti i coverslip hanno PEG (cioè 8 coverslips = 4 sandwich PEG). Incubare le soluzioni PEG durante la notte (~12 h) a RT in una camera di umidità al buio16.
- Separare le coppie di coverslip e metterle in un barattolo di colorazione. Notate i lati PEGilati.
- Risciacquare accuratamente le coperture con acqua ultrapura e asciugare con N2.
NOTA: tenere le coperture con una pinzetta e soffiare N2 sulla superficie verso la pinzetta per evitare che i contaminanti si secchino sulla superficie. - Contrassegnare il lato non PEGilato con un punto in un angolo utilizzando un pennarello permanente o una penna diamantata.
- Posizionare 2 coverslip PEGylated in tubi mailer con i lati PEGylated uno di fronte all'altro per aiutare a identificare il lato PEGylated prima dell'uso.
- Aspirare il tubo per 5 minuti e riempire con N2. Sigillare il tubo con parafilm.
- Conservare i coperchi PEGilati a -20 °C nei tubi sigillati per un massimo di 6 mesi.
NOTA: riscaldare i tubi di stoccaggio su RT prima dell'assemblaggio del chip. La condensa sui coperchi durante la sigillatura causerà perdite.
3. Preparazione della camera di flusso
- Assemblaggio chip
- Stendere sottilmente una piccola quantità di resina epossidica su entrambi i lati del nastro biadesivo con una lama di rasoio.
NOTA: troppa resina epossidica può diffondersi nel canale durante l'assemblaggio. - Tagliare al laser il nastro rivestito con resina epossidica per creare 4 canali. Creare il chip di flusso inserendo il nastro epossidico tra una slitta a 4 fori e un coperchio PEG (Figura 1A).
- Utilizzando una punta della pipetta, applicare una leggera pressione lungo la lunghezza dei canali per creare una buona tenuta. Curare la resina epossidica per ≥1 h.
NOTA: Non tranciare il vetro per evitare di scivolare contro la resina epossidica.
- Stendere sottilmente una piccola quantità di resina epossidica su entrambi i lati del nastro biadesivo con una lama di rasoio.
- Assemblaggio da camera
- Allineare il chip in modo che l'apertura di ciascun canale sia posizionata al centro dell'adattatore (Figura 1A). Posizionare due distanziali acrilici trasparenti sulla parte superiore del chip, applicare una pressione decisa al centro del blocco e avvitare due viti 4-40 alle estremità di ciascun distanziatore.
NOTA: non forzare la vite o premere troppo forte sui distanziali, altrimenti il chip potrebbe rompersi. - Dall'altra parte della staffa, avvitare le prese nei fori filettati. Monitorare le condizioni di tenuta attraverso il blocco acrilico trasparente.
- Quando il tubo entra in contatto con l'apertura del chip, sigillare la connessione ruotando delicatamente il tubo in senso orario.
NOTA: le prese d'aria troppo strette possono causare il blocco del flusso, mentre i contatti allentati causeranno perdite.
- Allineare il chip in modo che l'apertura di ciascun canale sia posizionata al centro dell'adattatore (Figura 1A). Posizionare due distanziali acrilici trasparenti sulla parte superiore del chip, applicare una pressione decisa al centro del blocco e avvitare due viti 4-40 alle estremità di ciascun distanziatore.
4. Preparazione della superficie
NOTA: fare riferimento alla Figura 1B per il flusso di lavoro complessivo.
- Agenti bloccanti per impedire il legame non specifico
- Utilizzare una pipetta per far fluire 200 μL di tampone di lavaggio (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 e 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) nella camera per verificare la presenza di perdite. Se si formano bolle nel canale, spingere aggressivamente altri 200 μL per rimuovere le bolle.
NOTA: le bolle d'aria di grandi dimensioni non rimosse in questa fase possono rimuovere e distruggere la funzionalizzazione della superficie in un secondo momento. - Aggiungere 40 μL di BSA (1% p/v) alla camera di flusso per evitare legami non specifici e incubare per 10 minuti.
- Assicurarsi di aggiungere un volume sufficiente durante ogni periodo di incubazione per riempire le camere di flusso e formare goccioline alle entrate e alle uscite. Regolare i volumi di incubazione di conseguenza ed eseguire tutte le incubazioni in una camera di umidità.
- Aggiungere 40 μL di Tween 20 (5% v/v) alla camera di flusso. Incubare per 10 minuti per ridurre ulteriormente il legame non specifico.
- (FACOLTATIVO) Controllare la superficie per un'adeguata passivazione facendo scorrere perline di polistirolo attraverso il canale. Aggiungere 40 μL di perle di polistirene rivestite ProtG (0,01% p/v) e l'immagine utilizzando un microscopio darkfield con obiettivo 10x. Se le perline non aderiscono alla superficie, procedere al passaggio successivo.
- Lavare il canale con 200 μL di tampone di lavaggio per rimuovere tutti gli agenti di passivazione.
- Utilizzare una pipetta per far fluire 200 μL di tampone di lavaggio (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 e 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20) nella camera per verificare la presenza di perdite. Se si formano bolle nel canale, spingere aggressivamente altri 200 μL per rimuovere le bolle.
- Funzionalizzazione della superficie della camera
- Aggiungere 40 μL di streptavidina (100 μg/mL) alla camera di flusso e incubare per 20 min. Quindi, lavare con 200 μL di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 40 μL di ProtG-TGT ibridato (100 nM) alla camera di flusso e incubare per 20 min. Quindi, lavare con tampone di lavaggio da 200 μL.
- Aggiungere 40 μL di filo superiore ProtG-TGT (100 nM) per 20 minuti per completare qualsiasi filamento inferiore TGT non ibridato sulla superficie. Lavare con 200 μL di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 40 μL di P-selectin-Fc (10 μg/mL) alla camera di flusso e incubare per 60 min. Quindi, lavare con 200 μL di tampone di lavaggio.
NOTA: la durata dell'incubazione è fondamentale.
5. Esperimento e imaging
- Configurazione del sistema di flusso
- Riempire una siringa di vetro da 5 mL con il tampone di rotolamento (HBSS con 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa picchiettando i lati della siringa per rimuovere le bolle e spingendole fuori mentre galleggiano verso la punta.
- Inserire un ago sterile (26 G, 5/8 inch length) in un tubo di polietilene da ~200 mm (I.D: 0,38 mm; O.D: 1,09 mm) e collegare l'ago alla siringa di vetro.
NOTA: assicurarsi che l'aria non sia intrappolata in alcun punto del connettore dell'ago. - Fissare la siringa sulla pompa della siringa e inclinare la pompa della siringa in modo che il lato dello stantuffo sia sollevato per evitare che le bolle d'aria entrino nel canale. Inserire l'estremità del tubo nell'ingresso della camera di flusso.
NOTA: Assicurarsi il contatto tra liquido e liquido quando si effettua il collegamento depositando goccioline sulle prese e avendo goccioline all'estremità del tubo della siringa. Assicurarsi che non entrino bolle d'aria nel canale lasciando che si formi una piccola goccia all'estremità del tubo della siringa prima di inserirla nell'ingresso. - Inserire un'estremità di altri 200 mm del tubo di polietilene nell'uscita e l'altra estremità immersa in un becher di scarto.
- Configurazione per la laminazione delle celle
- Coltiva cellule HL-60 in palloni di coltura ventilati da 25 cm2 in mezzi IMDM integrati con il 20% di siero bovino fetale e l'1% di antibiotici a 37 °C con il 5% di CO2. Mantenere le densità cellulari tra 1 x 105-2 × 106 celle / mL.
- (FACOLTATIVO) Differenziare le celle HL-60 in un mezzo IMDM completo contenente l'1,25% di DMSO ad una densità iniziale di 2 x 105 celle/ml. Incubare le cellule per essere più attive per 5-6 giorni.
- Prelevare un campione (1-2 ml) dalla sospensione cellulare e dalla centrifuga (200 x g, 3 min) per pellettare le celle.
- Rimuovere il mezzo e risospese delicatamente le celle in 500 μL del tampone di rotolamento. Ripetere la fase di lavaggio due volte per rimuovere i detriti cellulari.
- Misurare la densità cellulare con un emocitometro. Risospesare i pellet di cella con tampone di rotolamento ad una densità di 2 x 105 celle/ml.
- Scollegare con attenzione il tubo dalle prese/uscite e dalla pipetta a 40 μL della sospensione cellulare nella camera di flusso. Ricollegare il tubo come descritto in precedenza, assicurarsi che non vengano introdotte bolle nel canale di flusso.
- Iniziare l'esperimento di laminazione cellulare avviando la pompa della siringa alle portate desiderate.
NOTA: l'intensità delle tracce fluorescenti dipende dallo sforzo di taglio e lo sforzo di taglio a velocità della cella più bassa/ la velocità della cella produrranno generalmente tracce dimmer (Figura 4A). Evitare un'elevata densità di celle sulla superficie o un'eccessiva durata di rotolamento per garantire tracce monocellulari separabili (Figura 4B,C). - Utilizzare un microscopio a campo scuro con un obiettivo 10x per garantire che si osservi il rotolamento cellulare.
- Una volta completato l'esperimento, rimuovere le celle dal canale infondendo il rolling buffer a 100 ml/h fino a quando la superficie non è priva di cellule.
- Imaging di tracce locali mediante "DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography" (DNA-PAINT)
- Aggiungere 40 μL di filamento imager DNA-PAINT (500 pM) nel buffer DNA-PAINT (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) al canale.
- Eseguire la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) utilizzando una lente tiRF a immersione in olio 100x. Acquisisci oltre 40000 fotogrammi con un tempo di esposizione di 25 ms per fotogramma con un guadagno di moltiplicazione degli elettroni (EM) di 300 utilizzando una fotocamera EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device).
- Utilizzare il pacchetto software Picasso17 per localizzare ed eseguire il rendering delle immagini a super-risoluzione (Figura 4D) seguendo i passaggi 5.3.4-5.3.5.
- Carica il filmato DNA-PAINT nel programma Localize per determinare la localizzazione di ciascun fluoroforo in ogni fotogramma.
NOTA: ottimizzare la lunghezza del lato della scatola e i parametri del gradiente netto minimo fino a quando solo i fluorofori non vengono tracciati con precisione. Il parametro Net Gradient può spesso superare 100000 per ottenere un tracciamento ottimale. Fit setting: MLE, metodo gaussiano integrato produce il miglior risultato. Infine, se il filmato è troppo lungo, dividerlo in pile di 10000 fotogrammi in modo che il tracciamento dell'anteprima in Localize funzioni correttamente prima di ricombinarli in un file hdf5 finale. - Quindi, caricare il file hdf5 risultante nel programma Render per eseguire la correzione della deriva e il rendering.
NOTA: eseguire la correzione della deriva multipla tramite Undrift by RCC per migliorare il risultato finale.
- Imaging di tracce lunghe mediante etichettatura permanente
- Aggiungere il filamento imager permanente e incubare per 120 s nel buffer T50M5. Lavare il canale infondendo 200 μL di tampone di lavaggio.
- Registrare un'immagine con il laser di eccitazione spento per ottenere il rumore di fondo della telecamera. Immagine di una vasta area in un modello a griglia mediante microscopia TIRF.
NOTA: la sovrapposizione frame-over-frame di ≥10% è consigliata per le cuciture successive. - Programmare il microscopio per eseguire la scansione dell'area di 400 x 50 immagini (20000 immagini in totale). Utilizzando il programma FIJI, dividere i dati grezzi in singoli file tiff, ciascuno contenente un massimo di 10000 immagini.
- Appiattire tutte le immagini utilizzando il profilo di illuminazione (Figura 3A-C) seguendo i passaggi 5.4.5-5.4.7.
- Sottraere il rumore di fondo della fotocamera da ogni fotogramma. Ottenete la proiezione media dello stack (profilo di illuminazione) di ogni fotogramma sottratto sullo sfondo.
- Normalizzare il profilo di illuminazione in base al suo valore massimo. Dividere ogni fotogramma sottratto dallo sfondo per il profilo di illuminazione normalizzato.
- Ridimensionare i fotogrammi corretti all'intervallo appropriato per la profondità di bit corrispondente.
- Utilizzare MIST18 per cucire le immagini (Figura 3D,E).
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Representative Results
Il protocollo di cui sopra descrive la procedura sperimentale del test dell'impronta di adesione. Il flusso di lavoro generale dell'esperimento è illustrato nella Figura 1, dall'assemblaggio della camera di flusso (Figura 1A) alla funzionalizzazione della superficie (Figura 1B) e alle fasi di esperimento e imaging (Figura 1C).
La Figura 2 è un risultato rappresentativo per la caratterizzazione della bioconiugazione del ProtG-ssDNA. Gli spettri UV/Vis di tre componenti del prodotto finale, vale a dire ProtG, mal-ssDNA e tampone di eluizione imidazolica, sono stati raccolti prima della coniugazione finale (Figura 2A), ciascuno corrispondente a una concentrazione nota. Questi spettri costituiscono la base ortogonale per adattarsi allo spettro dei prodotti di bioconiugazione, dove i tre parametri sconosciuti sono le loro concentrazioni. Una funzione personalizzata in MATLAB è stata utilizzata per determinare le concentrazioni. I risultati mostrano un rapporto quasi 1:1 tra ProtG e ssDNA (Figura 2A). Questo è come previsto perché l'ssDNA ha solo una modifica dell'ammina e il ProtG ha una singola cisteina ingegnerizzata al suo C-terminus. Questo approccio è più vantaggioso rispetto all'approccio precedentemente riportato19 che utilizza un singolo DNA modificato dal tiolo per indirizzare la moltitudine di ammine primarie su ProtG, dove il rapporto di coniugazione non può essere facilmente mantenuto.
Inoltre, la PAGE nativa è stata utilizzata per confermare la bioconiugazione (Figura 2B). Il DNA è macchiato rispettivamente da GelGreen e dalle proteine da Coomassie blue. Poiché GelGreen macchia il dsDNA più fortemente di ssDNA, si prevede che tutte le bande di ssDNA siano più deboli della concentrazione molare uguale delle bande dsDNA (corsie 3, 4). Poiché il ProtG di riserva contiene un residuo di cisteina C-terminale, una frazione delle proteine forma dimeri attraverso un legame disolfuro, come si vede nella corsia 5 (Figura 2B). Il ProtG ridotto, invece, mostra una sola banda (corsia 6). Quando si utilizza il ProtG di riserva nella coniugazione del DNA direttamente, il ProtG dimerizzato disolfuro non reagisce al DNA e si presenta come una banda senza alcuna colorazione GelGreen (corsie 7, 8). La banda dimero ProtG scompare nel prodotto di coniugazione utilizzando ProtG ridotto (corsie 9, 10). Poiché durante la coniugazione viene utilizzato un eccesso di mal-ssDNA a ProtG (1.5:1), solo le bande TGT sono visibili nel prodotto finale di coniugazione (corsie 8, 10). Le luminose bande GelGreen che coincidono con la banda monomerica ProtG indicano una coniugazione riuscita e una buona resa.
La Figura 3 illustra le immagini rappresentative al microscopio grezzo e il flusso di lavoro per correggerle per la successiva cucitura e analisi delle immagini. Il profilo di illuminazione TIRF introdotto da una fibra monomodale è generalmente più luminoso al centro del campo visivo e dimmer attorno ai bordi (Figura 3A,B). Per compensare l'illuminazione irregolare e appiattire le immagini per l'analisi quantitativa, il profilo di illuminazione è stato determinato facendo una media di migliaia di singoli fotogrammi (Figura 3B). Le immagini appiattite sono state prodotte sottraendo il rumore della fotocamera sia dai profili raw che da quelli di illuminazione e quindi normalizzandolo in base al profilo di illuminazione (Figura 3C). L'effetto dell'appiattimento dell'immagine è chiaramente illustrato quando le immagini vengono cucite per formare un'immagine di grandi dimensioni. L'intensità dell'immagine nelle regioni di sfondo senza tracce di cella mostra modelli periodici chiari corrispondenti alle immagini non corrette (Figura 3D). Lo stesso campo visivo cucito da immagini appiattite produce uno sfondo piatto (Figura 3E). Avere uno sfondo piatto è fondamentale per interpretare le fluttuazioni di intensità lungo una traccia cellulare. Come primo esperimento, un profilo di flusso ramp-up simile a quello illustrato nella Figura 3F viene utilizzato per determinare l'intervallo di sforzo di taglio adatto all'esperimento garantendo sia un rotolamento stabile delle celle che tracce di celle fluorescenti chiare. Una tipica impronta di adesione a cella singola sotto questo profilo di flusso è mostrata nella Figura 3G, dove l'intensità aumenta all'aumentare dello sforzo di taglio fino a quando la cella non può più sostenere il rotolamento ad alto sforzo di taglio e staccarsi dalla superficie, segnando la fine di un singolo binario.
La Figura 4 illustra i potenziali risultati da risultati sperimentali rappresentativi non ottimali a ottimali. La Figura 4A illustra un risultato non ottimale in cui le tracce fluorescenti hanno un basso rapporto segnale-rumore. Ciò è probabilmente causato da una bassa densità superficiale delle sonde completamente coniugate o da una bassa portata. La Figura 4B illustra un altro risultato non ottimale in cui le tracce fluorescenti sono troppo densamente imballate per risolvere e isolare le singole tracce per l'analisi successiva. La Figura 4C è un esempio di un buon risultato in cui le singole tracce sono risolvibili su una lunga distanza e chiare sullo sfondo. La Figura 4D è un esempio dell'immagine TIRF limitata alla diffrazione (metà sinistra) rispetto alla stessa traccia ripresa da DNA-PAINT (metà destra). Il DNA-PAINT in questa configurazione produce una precisione NeNA (nearest-neighbor-based analysis) di 28,8 nm.
Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale del test dell'impronta di adesione. (A) Assemblaggio della cella di flusso e della camera di flusso. (B) Passivazione superficiale e funzionalizzazione. Ogni fase di incubazione è contrassegnata dalla durata, seguita da una fase di lavaggio. (C) Esperimento di laminazione cellulare e imaging. Le cellule che rotolano sulla superficie decomprimono il DNA dove si formano le interazioni di adesione, lasciando ssDNA sulla superficie che segna la posizione di ogni evento di adesione. La superficie è etichettata con l'imager permanente ssDNA per l'imaging di un'ampia area, che richiede una colorazione di 2 minuti prima del lavaggio. Per l'imaging DNA-PAINT a super-risoluzione, il filamento dell'imager viene mantenuto nel buffer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione della bioconiugazione. (A) Assorbanza UV-VIS del prodotto di bioconiugazione purificato Ni-NTA (blu) e del curve fit (rosso) per determinare il rapporto di coniugazione. Gli spettri di assorbimento di ProtG (magenta), mal-ssDNA (verde) e imidazolo (grigio) sono stati utilizzati come componenti per creare la migliore vestibilità (rosso) allo spettro di prodotti (blu). Il residuo della vestibilità è mostrato come la linea tratteggiata nera. Questo ci permette di determinare la concentrazione di ProtG e ssDNA nel prodotto di bioconiugazione purificato e il loro rapporto molare. (B) PAGINA nativa dei componenti nella procedura di bioconiugazione. La prima corsia mostra una scala del DNA a basso peso molecolare (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp). L'immagine del gel è di falso colore, con GelGreen che colora il DNA in verde e la colorazione proteica blu Coomassie (invertita) in magenta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Elaborazione delle immagini e risultati rappresentativi dell'imaging ad ampia area. (A) Migliaia di immagini TIRF grezze che piastrellano un'area estesa. (B) Profilo di illuminazione derivato dalle immagini raw. (C) Immagini corrette appiattindo il profilo di illuminazione. (D) Immagine cucita da riquadri immagine non elaborata. Il profilo di illuminazione irregolare può essere visto come modelli periodici nell'immagine. Le caselle blu e rossa indicano le sezioni dell'immagine in cui vengono proiettati i profili di intensità media (tracce blu e rosse). I valori medi di intensità (unità arbitraria) rappresentano quelli delle immagini a 8 bit (0-255). (E) Stessa area di (D) ma cucita utilizzando immagini appiattite. Le proiezioni non mostrano alcun modello periodico su larga scala. (F) Il profilo di sollecitazione di taglio da utilizzare negli esperimenti per determinare la gamma di sollecitazioni di taglio che provocano tracce di fluorescenza di rotolamento e resa delle celle. (G) Una traccia fluorescente campione da una singola cella sotto il profilo di flusso illustrato alla lettera F). La cellula viaggia da sinistra a destra, l'intensità della fluorescenza aumenta man mano che lo stress di taglio aumenta fino a quando la cellula non può più sostenere il rotolamento e si stacca dalla superficie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi non ottimali e ottimali. (A) Un esempio di tracce fluorescenti con contrasto insufficiente. (B) Un esempio di eccessiva densità di binari fluorescenti. (C) Un esempio di densità e contrasto ottimali della traccia. Tutte e tre le immagini sono state acquisite nella stessa condizione, appiattite e cucite. Le caselle rosse in ogni immagine rappresentano l'area in cui sono state scattate le proiezioni di intensità (a destra). (D) Una traccia fluorescente mostrata nell'imaging a diffrazione limitata (metà sinistra) e DNA-PAINT (metà destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Problema | Possibile ragione | Soluzione | |
| Nastro epossidico non tagliato correttamente | Strato epossidico troppo spesso | Assottigliare il più possibile lo strato epossidico con la lama del rasoio | |
| Potenza e velocità dell'incisore laser non ottimizzate | Ottimizza la potenza e la velocità dell'incisore laser | ||
| Bolle bloccate sui lati della camera di flusso | Introduzione liquida iniziale impropria | Spingere le soluzioni tampone attraverso il canale ad alta portata per lavare le bolle fuori | |
| Le bolle passano attraverso la camera di flusso | Introduzione impropria di liquidi attraverso l'ingresso e l'uscita | Assicurarsi che una goccia di liquido sia sul tubo di ingresso per garantire il contatto liquido-liquido tra la punta della pipetta e l'ingresso | |
| Le bolle della siringa sono entrate nella linea di flusso | Inclinare la pompa della siringa per assicurarsi che le bolle siano intrappolate all'estremità dello stantuffo | ||
| Il liquido non può entrare nei canali | Ingressi avvitati troppo stretti | Regolare per ottimizzare la tenuta. Il tubo di ingresso deve semplicemente toccare l'apertura del canale quando è avvitato correttamente. | |
| Perdita di canale | La resina epossidica non si è completamente polimerizzata | Rifare i canali, assicurarsi di utilizzare 5 minuti di resina epossidica a indurimento rapido e lasciare polimerizzare per almeno 1 ora | |
| Ingressi non sigillati correttamente | Regolare per ottimizzare la tenuta | ||
| Celle bloccate | Scarsa PEGilazione che porta a un legame non specifico | Idealmente, rifare PEG. Inoltre, può provare a incubare ulteriori agenti bloccanti (BSA & Tween-20) e aggiungere agenti bloccanti al tampone di lavaggio. | |
| Passivazione superficiale distrutta da grandi bolle d'aria che passano attraverso il canale | Assicurati che nessuna bolla passi attraverso il canale | ||
| Problema con le cellule | Utilizzare HL-60 2 settimane dopo il riavvio della coltura cellulare da congelato. Confermare il rotolamento della cella sulla superficie di controllo con solo P-selectina. | ||
| Le celle non hanno o hanno interazioni sparse con la superficie | Densità di P-selectina troppo bassa, a causa di scarsa funzionalizzazione superficiale e/o scarsa bioconiugazione | In primo luogo, utilizzare ProtG-biotina invece di ProtG-TGT come controllo per determinare se il problema è dovuto alla bioconiugazione o alla densità della biotina superficiale. Dopo aver garantito la qualità della bioconiugazione e la densità della biotina superficiale, aumentare la concentrazione di TGT-ProtG e P-selectina-Fc e il tempo di incubazione. | |
| Le celle rotolano ma non producono tracce fluorescenti | Interazioni di adesione troppo deboli per rompere TGT | Aumentare la portata durante l'esperimento di rotolamento per aumentare la forza di interazione. Si consiglia un profilo di flusso iniziale di rampa (Figura 3F) per trovare la portata ottimale che produce tracce di laminazione e fluorescenza stabili (Figura 3G) | |
| La superficie di cattiva qualità porta a un'elevata fluorescenza dello sfondo e a un contrasto insufficiente per vedere le tracce | Controllare la passivazione superficiale | ||
Tabella 1: Risoluzione dei problemi. La tabella elenca i possibili motivi e le soluzioni per i problemi che si verificano durante l'esecuzione di questo test
File di codifica supplementare 1: lo script MATLAB scritto su misura per scomporre lo spettro di prodotti finali in base ai tre spettri raccolti in precedenza (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA bead elution buffer) per determinare l'efficienza di coniugazione e il rapporto tra ProtG e ssDNA. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il test dell'impronta di adesione consente la visualizzazione degli eventi di adesione molecolare tra PSGL-1 e P-selectina durante l'adesione al rotolamento cellulare. Questo processo viene avviato mediante cattura mediata da P-selectina seguita da rotolamento sotto sforzo di taglio fluidico. I potenziali problemi durante l'esperimento di solito riguardano un cattivo rotolamento delle cellule o tracce fluorescenti mancanti anche quando le cellule rotolano bene. Questi problemi sono spesso il risultato di controlli di qualità nelle fasi critiche del protocollo, come elencato nella tabella di risoluzione dei problemi (Tabella 1).
Le biomolecole e i tamponi devono essere filtrati e conservati a 4 °C per evitare la contaminazione perché la preparazione della superficie comporta più passaggi. La passivazione superficiale di alta qualità è un requisito per ottenere un'adeguata densità di funzionalizzazione superficiale e ridurre il legame non specifico delle biomolecole. Il legame non specifico delle biomolecole alla superficie può creare uno sfondo ad alta fluorescenza, interferendo con l'imaging a fluorescenza a singola molecola e l'analisi statistica dei dati. Molteplici fattori possono influenzare la passivazione superficiale. L'idrolisi dell'aminosilano e del PEG-NHS produce un'efficienza molto più bassa della PEGilazione. Un sufficiente lavaggio KOH e pulizia dei piranha migliora l'idrofilia generando gruppi ossidrilici liberi sulla superficie del vetro, aumentando la densità del gruppo chimicamente reattivo. Le cellule sarebbero bloccate su superfici scarsamente passivate. La qualità della passivazione superficiale viene controllata misurando l'intensità della fluorescenza di fondo prima e dopo la PEGilazione utilizzando biomolecole fluorescenti.
La densità superficiale dei ligandi è un fattore critico per il rotolamento cellulare, che è controllato dal PEG: rapporto PEG-biotina, ibridazione TGT e legame P-selectina. In questo sistema, un rapporto PEG:PEG-biotina di 20:1 è sufficiente per la funzionalizzazione superficiale con sufficiente P-selectina per il rotolamento cellulare. L'efficiente ibridazione TGT migliora anche la densità superficiale e il rapporto segnale-rumore delle tracce fluorescenti. Questo protocollo include una fase di rifornimento di TGT-ProtG per garantire che qualsiasi filamento inferiore TGT non ibridato sia completato prima degli esperimenti. La coniugazione del DNA al ProtG influisce anche sulla densità superficiale. Il linker Sulfo-SMCC è stato aggiunto al DNA con un eccesso molare di 10 volte in modo che tutto il DNA reagisse con il linker. ProtG con un singolo residuo di cisteina (ProtG-Cys) al C-terminus è stato utilizzato per ottenere un rapporto di coniugazione DNA: ProtG 1:1. Poiché il ProtG-Cys può formare dimeri attraverso legami disolfuro, è necessario un trattamento del TCEP per ridurre il legame disolfuro prima delle reazioni di reticolazione sulfidril-reattive. L'ibridazione di DNA coniugato con proteine e TGT può essere convalidata con l'analisi PAGE nativa, in cui DNA coniugato e DNA duplex mostreranno la mobilità ritardata dovuta all'aumento del peso molecolare. L'efficienza di assemblaggio può anche essere stimata mediante densitometria su gel (Figura 2B). Gli accurati processi di PEGilazione e bioconiugazione sono fondamentali per produrre una superficie consistente. Occasionalmente, lo stato cellulare può influenzare il rotolamento cellulare e la formazione di tracce. Sebbene l'espressione di PSGL-1 sulla densità cellulare non sia stata riportata, la densità cellulare è un potente regolatore del ciclo cellulare e dell'espressione proteica durante la fase di crescita.
Dato che PSGL-1 funziona anche come recettore di trasduzione del segnale e regola la proliferazione cellulare20,21, le condizioni di coltura come la densità cellulare sono mantenute per un livello di espressione costante e la capacità di legame di PSGL-1. L'attaccamento di P-selectin-Fc mediato da ProtG sulla superficie è fondamentale per l'adesione e il rotolamento delle cellule. La cinetica di legame della P-selectina al ProtG dipende dalla concentrazione. Concentrazioni più basse di P-selectina portano ad un aumento del tempo per raggiungere l'equilibrio. Sono necessari almeno 30 minuti per il legame di saturazione per concentrazioni inferiori a 100 nM22. 10 nM di P-selectina sono stati utilizzati per ridurre il legame non specifico alla superficie e aumentare il tempo di incubazione per un'interazione sufficiente con ProtG. Un'incubazione di 1 ora è un tempo sufficiente per indurre l'adesione cellulare e il rotolamento in questo sistema.
Il TGT e la sua corrispondente durata dipendente dalla forza è un fattore importante nei risultati di questo test. Durante l'adesione al rotolamento, la forza sul cavo viene trasmessa sia attraverso l'interazione TGT che P-selectin: PSGL-1. Ognuno di questi singoli componenti ha una durata unica dipendente dalla forza e, a seconda della forza applicata, la probabilità di rottura favorirà l'uno rispetto all'altro. Ad esempio, è stato dimostrato che quando si utilizza il TGT descritto in questo articolo, a forze inferiori a 13,6 pN, P-selectin: PSGL-1 si dissocia principalmente, mentre al di sopra di 13,6 pN, il TGT si dissocia principalmente13. Questo è importante da capire quando si esegue questo test perché se lo stress di taglio è troppo basso o le perline rotolano troppo lentamente, gli eventi di rottura saranno principalmente l'interazione P-selectina: PSGL-1 e ci sarà un segnale di fluorescenza misurabile minimo o nullo dai TGT. Anche la soglia di tensione del TGT influenzerà i risultati. Se il TGT si rompe a una forza troppo elevata, gli eventi di rottura saranno principalmente P-selectina: PSGL-1 e ci sarà un segnale di fluorescenza minimo.
Il metodo qui descritto consente l'analisi delle forze di rottura molecolare, nonché delle posizioni degli eventi di adesione molecolare coinvolti nell'adesione a rotolamento. Invece del rilevamento in tempo reale dell'adesione, il vantaggio più significativo di questo metodo è che consente l'imaging e l'analisi post-esperimento. Una volta che l'impronta di adesione è stata lasciata sulla superficie sotto forma di ssDNA, le tracce possono ancora essere visualizzate dopo 12 ore se i canali di flusso vengono mantenuti in un frigorifero a 4 °C in una camera di umidità buia con ingressi e uscite bloccati per evitare l'essiccazione. L'interpretazione della lettura della fluorescenza per questo test dipende dal metodo di imaging scelto. Attraverso l'imaging a super-risoluzione, questo test raggiunge un'elevata risoluzione spaziale (<50 nm) che consente l'analisi quantitativa della densità dei TGT rotti13. L'analisi della densità del recettore o della densità TGT rotta sarebbe utile per studiare il comportamento di adesione al rotolamento in diverse condizioni. Al contrario, l'imaging limitato alla diffrazione non fornisce un'alta risoluzione spaziale; tuttavia, consente di visualizzare un'ampia superficie per analizzare le tracce di fluorescenza di più perline su centinaia di campi visivi. Ciò è vantaggioso in quanto l'intensità di fluorescenza di una traccia può essere analizzata per un singolo tallone su una grande distanza fornendo informazioni sui cambiamenti nel comportamento di rotolamento nel tempo. Un tale esempio sta cambiando lo sforzo di taglio nel tempo e osservando i corrispondenti cambiamenti nell'intensità della fluorescenza. Recentemente, è stato dimostrato che attraverso un semplice modello, l'intensità di fluorescenza delle tracce può essere utilizzata per stimare la distribuzione della forza molecolare13. Esiste anche una potenziale applicazione di metodi raziometrici per ottenere la quantificazione della forza con questo saggio23.
Poiché il rotolamento cellulare avviene rapidamente (10s di μm/s) e su una distanza estesa (1000s di μm), studiare la loro tensione molecolare è stato difficile con i tradizionali sensori di tensione molecolare in tempo reale. Il test dell'impronta di adesione rompe questo vincolo impegnativo per consentire l'imaging post-evento. Sebbene l'evento di rottura TGT non riporti direttamente l'entità della tensione sperimentata prima della rottura, sono stati fatti sviluppi promettenti nell'analisi delle tracce di fluorescenza per consentire l'indagine quantitativa delle forze molecolari coinvolte nell'adesione al rotolamento13,23,24.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), dal New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), dalla Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) e dall'University of British Columbia Eminence Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
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