Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Published: September 27, 2021 doi: 10.3791/63013
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Abstract

Selelin aracılı etkileşimlerle kolaylaştırılan yuvarlanan yapışıklık, lökositlerin iltihaplanma bölgesine alınmasında son derece dinamik, pasif bir hareketliliktir. Bu fenomen, kan akışının endotel hücreleri üzerinde yuvarlanan bir hareketle lökositleri ittiği postkapsiller venülelerde ortaya çıkar. Kararlı haddeleme, yapışma bağı oluşumu ile mekanik olarak tahrik edilen ayrışmaları arasında hassas bir denge gerektirir ve hücrenin akış yönünde yuvarlanırken yüzeye bağlı kalmasını sağlar. Nispeten statik ortamlarda meydana gelen diğer yapışma işlemlerinin aksine, yuvarlanan hücreler saniyede onlarca mikronda binlerce mikronun üzerinde hareket ettiği için yuvarlanan yapışma son derece dinamiktir. Sonuç olarak, çekiş kuvveti mikroskopisi gibi geleneksel mekanobiyoloji yöntemleri, gerekli kısa zaman ölçeği ve yüksek hassasiyet nedeniyle bireysel yapışma olaylarını ve ilişkili moleküler kuvvetleri ölçmek için uygun değildir. Burada, P-selectin: PSGL-1 etkileşimlerini moleküler düzeyde yuvarlanma yapışmasında görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testinin en son uygulamasını açıklıyoruz. Bu yöntem, floresan izleri şeklinde moleküler yapışma olaylarının kalıcı bir geçmişini üretmek için geri dönüşü olmayan DNA tabanlı gerilim ölçer tethers kullanır. Bu izler iki şekilde görüntülenebilir: (1) geniş bir görüş alanı oluşturmak için kırınım sınırlı binlerce görüntüyü bir araya getirmek, her yuvarlanan hücrenin binlerce mikron uzunluğundaki yapışma ayak izinin çıkarılmasını sağlamak, (2) floresan izlerinin süper çözünürlüklü görüntülerini küçük bir görüş alanı içinde yeniden oluşturmak için DNA-PAINT gerçekleştirmek. Bu çalışmada, farklı kesme gerilmelerinde yuvarlanan HL-60 hücrelerini incelemek için yapışkan ayak izi tahlili kullanılmıştır. Bunu yaparken, P-selectin: PSGL-1 etkileşiminin mekansal dağılımını görüntüleyebildik ve floresan yoğunluğu ile moleküler güçleri hakkında fikir edindik. Bu nedenle, bu yöntem moleküler düzeyde yuvarlanan yapışmada yer alan çeşitli hücre-yüzey etkileşimlerinin nicel olarak araştırılması için zemin hazırlar.

Introduction

Yuvarlanan yapışma kaskadı, dolaşımdaki hücrelerin kan damarı duvarına nasıl bağlı olduğunu ve yuvarlanmasını açıklar1. Pasif haddeleme öncelikle hücresel yapışma moleküllerinin (CAM)1 ana sınıfı olan selectinler tarafından aracılık edilir. Kanın kesme akışı altında, P-selectin glikoprotein ligand-1'i (PSGL-1) ifade eden lökositler, iltihaplı endotel hücrelerinin yüzeyinde ifade edilebilecek P-selectin ile oldukça geçici bağlar oluşturur. Bu işlem lökositlerin iltihaplanma bölgesine göç etmesi için kritik öneme sahiptir2. Buna ek olarak, PSGL-1 aynı zamanda P-selectin3 ile etkileşimi üzerine yuvarlanan yapışma basamaklamanın sonraki sıkı yapışma aşamasını tetikleyebilen bir mekanosensitive reseptördür.

CAM fonksiyonunu etkileyen genetik mutasyonlar, lökosit yapışma eksikliğinin (LAD) nadir görülen hastalığı gibi bağışıklık sistemini ciddi şekilde etkileyebilir, burada yuvarlanmaya aracılık eden yapışma moleküllerinin arızalanması ciddi şekilde bağışıklık sistemi baskılanmış bireylere yol açar4,5,6. Ek olarak, dolaşımdaki tümör hücrelerinin benzer bir yuvarlanma sürecini takiben göç ettiği ve metastaz7,8'e yol açtığına gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücre haddeleme hızlı ve dinamik olduğundan, geleneksel deneysel mekanobiyoloji yöntemleri hücre yuvarlanması sırasında moleküler etkileşimleri incelemek için uygun değildir. Atomik kuvvet mikroskopisi ve optik cımbız gibi tek hücreli ve tek moleküllü manipülasyon yöntemleri, P-selectin'in PSGL-1 ile tek molekül seviyesinde kuvvete bağımlı etkileşimi9 gibi moleküler etkileşimleri inceleyebilebilirken, hücre yuvarlanması sırasında canlı yapışma olaylarını araştırmak için uygun değildir. Ek olarak, in vitro karakterize etkileşim, moleküler yapışma in vivo hakkındaki soruyu doğrudan cevaplayamaz. Örneğin, hücreler kendi ortamlarında çalışırken hangi moleküler gerilim aralığı biyolojik olarak ilgilidir? Yapışkan dinamiği simülasyonu10 veya basit sabit durum modeli11 gibi hesaplama yöntemleri, belirli moleküler ayrıntıları ve yuvarlanma davranışını nasıl etkilediklerini yakalamış, ancak modelleme parametrelerinin ve varsayımlarının doğruluğuna son derece bağlıdır. Çekme kuvveti mikroskopisi gibi diğer teknikler hücre göçü sırasında kuvvetleri tespit edebilir, ancak moleküler gerilim hakkında yeterli mekansal çözünürlük veya nicel bilgi sağlamaz. Bu tekniklerin hiçbiri, kendi ortamlarındaki hücre fonksiyonu ve davranışıyla doğrudan ilişkili olan moleküler kuvvetlerin zamansal dinamikleri, mekansal dağılımı ve büyüklük heterojenliği hakkında doğrudan deneysel gözlemler sağlayamaz.

Bu nedenle, selep aracılı etkileşimleri doğru bir şekilde ölçebilen bir moleküler kuvvet sensörü uygulamak, yuvarlanma yapışma anlayışımızı geliştirmek için çok önemlidir. Burada, PSGL-1 kaplamalı boncukların p-selectin fonksiyonelleştirilmiş gerilim ölçer tethers (TGTs)13 sunan bir yüzeye yuvarlandığı yapışkan ayak izi tahlil12 protokolünü açıklıyoruz. Bu TGT'ler, floresan okuma şeklinde kalıcı yırtılma olaylarının geçmişine neden olan geri dönüşü olmayan DNA tabanlı kuvvet sensörleridir. Bu, TGT'nin (dsDNA) yırtılması ve daha sonra yırtılan TGT'nin (ssDNA) floresan etiketli tamamlayıcı iplikçikle etiketlenerek elde edilir. Bu sistemin en büyük avantajlarından biri, hem kırınım sınırlı hem de süper çözünürlüklü görüntüleme ile uyumluluğudur. Floresan etiketli tamamlayıcı iplikçik, kırınım sınırlı görüntüleme için kalıcı olarak (>12 bp) veya DNA PAINT aracılığıyla süper çözünürlüklü görüntüleme için geçici olarak bağlanabilir (7-9 bp). Bu, TGT'ler aktif haddeleme sırasında yırtıldığı için yuvarlanma yapışıklıklarını incelemek için ideal bir sistemdir, ancak floresan okuma yuvarlanma sonrası analiz edilir. İki görüntüleme yöntemi ayrıca kullanıcıya yuvarlanan yapışıklıkları araştırmak için daha fazla özgürlük sağlar. Tipik olarak, kırınım sınırlı görüntüleme floresan yoğunluğu üzerinden moleküler yırtılma kuvveti çıkarmak için yararlıdır13, süper çözünürlüklü görüntüleme ise reseptör yoğunluğunun nicel analizine izin verir. Haddeleme yapışmasının bu özelliklerini araştırma yeteneği ile bu yaklaşım, yuvarlanan hücrelerin kesme akışı altında moleküler yapışması üzerindeki kuvvet düzenleme mekanizmasını anlamak için umut verici bir platform sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oligonükleotid etiketleme ve hibridizasyon

  1. Protein G disülfid bağlarının azaltılması
    1. 10 mg Protein G'yi (ProtG) 1 mL ultra saf suda çözün.
      NOT: Buradaki Protein G, C-terminusta tek bir sistein kalıntısı ve N-terminus poli-histidin etiketi ile modifiye edilir.
    2. Tampon değişimi ≥20 μL ProtG (10 mg/mL) ile P6 sütunu ile 1x PBS (pH 7.2) içine.
    3. Tampon değişiminden sonra protein konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: Tipik konsantrasyon 7-8 mg/mL.
    4. 3 mg TCEP'i 90 μL 1x PBS (pH 7.2) ve ardından 10 μL 0.5 M EDTA'ya eriterek 120 mM Tris (2-karboksit)fosfin (TCEP) hazırlayın.
      NOT: TCEP yeni hazırlanmalıdır.
    5. 20 μL ProtG'ye (4-5 nmol) 4 μL 120 mM TCEP (480 nmol) ekleyin.
      NOT: Proteine ~100:1 TCEP molar oranını hedefleyin.
    6. Reaksiyonun oda sıcaklığında (RT) 30 dakika devam etmesine izin verin.
    7. Bir P6 sütunu ile azaltılmış ProtG'den fazla TCEP çıkarın (tampon 1x PBS, pH 7.2 ile değiştirildi).
    8. Azaltılmış ProtG konsantrasyonunu bir UV/Vis spektrofotometre ile ölçün ve spektrumu kaydedin.
      NOT: Tipik konsantrasyon 3.5-4.5 mg/mL.
  2. Sulfo-SMCC ile amin etiketli ssDNA reaksiyon
    1. Amin etiketli ssDNA'yı (amin-ssDNA) nükleoz içermeyen suda 1 mM konsantrasyonda çözün. Uv/Vis spektrofotometre ile iplikçik konsantrasyonunu doğrulayın.
    2. Karıştırmak için 400 μL ultra saf su ve girdapta 2 mg sülfo-SMCC çözerek 11,5 mM sülfo-SMCC (sulfo-NHS ester ve maleimid ile hetero-bifunctional crosslinker) çözeltisini taze hazırlayın.
    3. 1 mM amin-ssDNA'nın (6 nmol) 6 μL'sini 11,5 mM sülfo-SMCC'nin (60 nmol) 5,2 μL'sine ve 88,8 μL'si 1x PBS'ye (pH 7,2) ekleyin. 5 sn için girdap ve ardından 3 dakika boyunca 8600 x g'da santrifüjleme.
    4. Tepkinin RT'de 30 dakika devam etmesine izin verin.
    5. P6 sütunu (tampon 1x PBS, pH 7.2 ile değiştirilir) ile SMCC konjuge amin-ssDNA'dan (mal-ssDNA) fazla sülfo-SMCC çıkarın.
    6. Mal-ssDNA konsantrasyonunu bir UV/Vis spektrofotometre ile ölçün ve spektrumu kaydedin.
      NOT: Tipik 35-45 μM konsantrasyon.
  3. ProtG-ssDNA konjugasyonu
    1. Mal-ssDNA'ya (~4-5 nmol) 21 μL 4,5 mg/mL azaltılmış ProtG (3 nmol) ekleyin.
      NOT: Buradaki hacimler ve konsantrasyonlar tipik değerlerdir. Bireysel deneysel ölçüme göre ayarlayın. Her zaman ~1,5:1 oranında ProtG üzerinde fazla miktarda mal-ssDNA sağlayın.
    2. 5 sn için girdap ve reaksiyonun RT'de 3 saat boyunca devam etmesine izin verin.
  4. ProtG-ssDNA saflaştırma ve karakterizasyon
    1. Konjuge ProtG-ssDNA'yı manyetik nikel-nitrilotrisetik asit (Ni-NTA) boncukları ile etiket izolasyonu yoluyla arındırın.
    2. P6 sütunu (tampon 1x PBS, pH 7.2 ile değiştirilir) ile üründen fazla imidazol (Ni-NTA elution tampon) çıkarın.
      NOT: Bu adım, imidazol 280 nm'de önemli emilime sahip olduğundan, konjugasyonu ölçmek için gereklidir.
    3. ProtG-ssDNA ürününün spektrumunu ve Ni-NTA elution tamponunu (1x) kaydetmek için bir UV/Vis spektrofotometre kullanın.
      NOT: Tipik ProtG-ssDNA absorbansı 260 nm ve 280 nm sırasıyla 0.8 ve 0.6'dır.
    4. ProtG'nin konjugasyon verimliliğini ve ssDNA'ya oranını belirlemek için, daha önce toplanan üç spektruma (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA boncuk elüasyon tamponu) dayanarak nihai ürün spektrumunu ayrıştırmak için özel yazılmış MATLAB komut dosyasını (Ek Kodlama Dosyası 1) kullanın.
      NOT: Kısaca, kod 1.4.5-1.4.8 adımlarında açıklandığı gibi çalışır. Tipik konsantrasyon ~ 1:1 molar oranında ProtG ve ssDNA ile 4 μM ProtG-ssDNA'dır (Şekil 2A).
    5. MATLAB komut dosyasına ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA boncuk elution tamponu ve ProtG-ssDNA UV/Vis spektrumu girin
    6. ProtG-ssDNA spektrumunu kaynak spektrumdan (ProtG, SMCC-strand ve Ni-NTA boncuk elüasyon tampon spektrumu) yeniden oluşturmak için çok boyutlu sınırlandırılmamış doğrusal olmayan en aza indirme gerçekleştirin
      NOT: En aza indirme işlevi, her kaynak spektrumu için bir tane olmak üzere üç dönüştürme faktörü çıkışıdır.
    7. ProtG-ssDNA spektrumunu, spektrumu karşılık gelen faktörleriyle çarparak ve dönüştürülmüş kaynak spektrumunu birleştirerek yeniden yapılandırın.
    8. ProtG-ssDNA ürünündeki SMCC-strand ve ProtG konsantrasyonlarını belirlemek için ProtG ve SMCC-strand'ın ilk konsantrasyonlarını karşılık gelen dönüşüm faktörleriyle çarpın.
    9. (İsteğE BAĞLI) Her bileşenin ve adımın beklendiği gibi çalıştığından emin olmak için Şekil 2B'ye göre yerel PAGE'i çalıştırın.
  5. TGT hibridizasyonu
    1. Tam TGT konstrüktörlerini melezlemek için ProtG-ssDNA'yı (üst iplikçik) 1.2:1 molar oranında biyotinillenmiş alt iplikçikle, T50M5 tamponunda (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) sırasıyla 240 nM ve 200 nM konsantrasyonlarında hibridize edin. RT ≥1 h'de melezleme izin verin.

2. Yüzey Pegylation

  1. Yüzey temizliği
    1. Her 8 kapak için bir Erlenmeyer şişesi ve iki boyama kavanozu temizleyin. Her kabı 1 M KOH çözeltisi ile doldurun ve RT'de 1 saat boyunca sonicate yapın.
      NOT: Kapağına dokunmak için KOH'u en üste doldurun, böylece onlar da temizlenir.
    2. Her kapak kapağını ultra saf suyla iyice durulayın ve temizlenmiş boyama kavanozlarından birine yerleştirin.
      NOT: Birbirlerine veya boyama kavanozlarının duvarına yapışmadıklarından emin olun.
    3. Duman kaputunda, 250 mL'lik bir kabın içine 90 mL konsantre (%95-%98) sülfürik aside 30 mL hidrojen peroksit (%30) ekleyerek bir piranha çözeltisi hazırlayın.
      DİkKAT: Konsantre sülfürik asit oldukça aşındırıcıdır. Hidrojen peroksiti sülfürik aside çok yavaşça ekleyin ve karıştırmak için dikkatlice döndürün.
    4. Kapakları piranha çözeltisi ile boyama kavanozuna tamamen batırın. Piranha'da kapakları duman kaputunda 30 dakika bekletin.
      DİkKAT: Lekelenme kavanozu çatlamayı önlemek için dökmeden önce piranha çözeltisini en fazla 80 °C'ye soğutun.
    5. Piranha çözeltisini 1000 mL'lik bir kabın içine atın ve cam temizliğinden 1 M KOH ile nötralize edin.
    6. (İsteğE BAĞLI) Piranha temizliğini (adım 2.1.3-2.1.5) taze bir piranha çözeltisi ile tekrarlayın.
    7. Tüm artık piranha çözeltisini çıkarmak için kapakları bol miktarda ultra saf su ile durulayın. Çıkarılmasını kolaylaştırmak için her yükseliş sırasında boyama kavanozu hafifçe sallayın (10 durulama önerilir).
    8. Kapakları metanol ile 3 kez durulayın ve kapak altlarını metanolün içine batırın.
  2. Yüzey silanizasyonu
    1. Temizlenmiş ve kurutulmuş Erlenmeyer şişesinde 94 mL metanol, 1 mL aminosilane ve 5 mL buzul asetik asetik asidi iyice karıştırarak% 1 aminosilane çözelti hazırlayın. İkinci temizlenmiş ve kurutulmuş boyama kavanozuna dökün14.
    2. Metanol çözeltisi altında batırılmış kapakları% 1 aminosilane çözelti içeren boyama kavanozuna aktarın ve kavanozu kapalı tutun.
      NOT: Cam yüzeyinin havaya maruz kalmasını sınırlamak için aminosilane aktarırken kapakların kurumasına izin vermeyin.
    3. Aminosilane kapaklar içeren boyama kavanozunu bir fırında 70 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın15.
    4. Aminosilane çözeltisini ayrı bir atık kabına dikkatlice atın ve aminosilane çözeltisini çıkarmak için kapakları lekeleme kavanozunda metanol ile 5 kez durulayın.
    5. Kapakları boyama kavanozunda ultra saf suyla 5 kez durulayın ve N2 ile kurutun.
    6. Kurutulmuş örtüleri boyama kavanozunda 110 °C'de bir fırında 20 dakika pişirin. Kapakların RT'ye soğumasını bekleyin, ardından PEGylation rafı üzerine yerleştirin.
      NOT: Yüzeydeki belirli ve kimyasal birikimi en aza indirmek için boyama kavanozunu fırın sırasında bir kapakla örtün15.
  3. PEG çözeltisi hazırlama
    1. YAKLAŞıK 30 dakika boyunca RT'ye PEG (Polietilen glikol) ve PEG-biotin çözün.
      NOT: Bu adım, PEG'deki NHS esterini bozabilecek nem yoğuşması en aza indirir.
    2. 10 mL ultra saf suya 84 mg sodyum bikarbonat ekleyerek PEG tamponu yapın. Bu formülasyon pH 8.4'te bir arabellek sağlamalıdır.
    3. Her biri 20:1 PEG:PEG-biotin ile bir PEGylated tarafı olan 8 kapak için: 400 μL PEG tamponu eklemek için 100 mg PEG ve 5 mg PEG-biotin ölçün. Vortex 30 s için çözüm ve maksimum hızda 1 dakika santrifüj (≥18000 x g).
      NOT: SVA NHS-ester hidrolizi hemen başladığı ve pH 8.0'da 34 dk yarı ömrüne sahip olduğu ve pH 8.4'te daha kısa bir yarı ömrü olduğu için bu adım zamana duyarlıdır.
  4. PEG inkübasyon ve kapak muhafazası
    1. Nem odasını kurun ve kapakları içine yerleştirin.
    2. Nem odasındaki bir kapakçığa 90 μL PEG çözeltisi ekleyin ve PEG çözeltisini eşit bir şekilde yaymak için kapak tutma cımbızı kullanarak PEG çözeltisinin üzerine ikinci bir kapak parçası yerleştirin.
    3. Kapak kılıfına bırakılan çözeltide kabarcık olmadığından emin olun. İlk kapak kapağındaki ikinci kapak kapağının bir ucunu indirin ve diğer ucunu yavaşça bırakın, böylece kapaklar arasında kabarcıklar sandviç olmaz.
      NOT: Kabarcıklar belirli alanların kötü bir şekilde PEGylated olmasına neden olur.
    4. Tüm kapaklar PEG olana kadar tekrarlayın (yani, 8 kapak = 4 PEG sandviç). PEG çözümlerini rt'de bir gecede (~12 h) karanlıkta bir nem odasında kuluçkaya yatırın16.
    5. Kapak çiftlerini ayırın ve bir boyama kavanozuna yerleştirin. PEGylated taraflarını not edin.
    6. Kapakları ultra saf suyla iyice durulayın ve N2 ile kurulayın.
      NOT: Kapakları cımbızla tutun ve kirleticilerin yüzeye kurumasını önlemek için N2'yi yüzey boyunca cımbıza doğru üfleyin.
    7. Pegylated olmayan tarafı kalıcı bir işaretleyici veya elmas kalem kullanarak köşedeki bir nokta ile işaretleyin.
    8. Pegylated tarafını kullanmadan önce tanımlamaya yardımcı olmak için pegylated yanları birbirine dönük posta tüplerine 2 PEGylated coverlips yerleştirin.
    9. Tüpü 5 dakika vakumlayın ve N2 ile doldurun. Tüpü parafilm ile kapatın.
    10. PEGylated kapakları -20 °C'de kapalı posta tüplerinde 6 aya kadar saklayın.
      NOT: Talaş montajından önce depolama tüplerini RT'ye ısıtın. Sızdırmazlık sırasında kapaklardaki yoğuşma sızıntıya neden olacaktır.

3. Akış odası hazırlığı

  1. Talaş montajı
    1. Jiletle çift taraflı bandın her iki tarafına da az miktarda epoksiyi ince bir şekilde yayın.
      NOT: Montaj sırasında kanala çok fazla epoksi yayılabilir.
    2. 4 kanal oluşturmak için epoksi kaplı bandı lazerle kesin. Epoksi bandı 4 delikli bir slayt ve PEG kapak kilip arasına sıkıştırarak akış çipini oluşturun (Şekil 1A).
    3. Pipet ucu kullanarak, iyi bir conta oluşturmak için kanalların uzunluğu boyunca hafif basınç uygulayın. Epoksiyi ≥1 saat boyunca tedavi edin.
      NOT: Epoksiye karşı kaymayı önlemek için camı kesmeyin.
  2. Oda montajı
    1. Çipi, her kanalın açıklığı adaptörün merkezlerine yer olacak şekilde hizalayın (Şekil 1A). Talaşın üzerine iki şeffaf akrilik ara parça yerleştirin, bloğun ortasına sıkı bir basınç uygulayın ve her ara parçanın uçlarına iki adet 4-40 vida vidayı vidalayın.
      NOT: Vidayı zorlamayın veya ara parçalara çok sert basmayın, aksi taktir çatlayabilir.
    2. Braketin diğer tarafında, girişleri dişli deliklere vidaleyin. Sızdırmazlık durumunu şeffaf akrilik blok üzerinden izleyin.
    3. Boru talaşın açıklığıyla temas ettikçe, boruyu saat yönünde hafifçe bükerek bağlantıyı kapatın.
      NOT: Aşırı iyileştirilmiş girişler akış tıkanmasına neden olabilirken, gevşek kontaklar sızıntıya neden olur.

4. Yüzey hazırlığı

NOT: Genel iş akışı için Şekil 1B'ye bakın.

  1. Özel olmayan bağlamayı önlemek için aracıları engelleme
    1. Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için odaya 200 μL yıkama tamponu (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 ve 2 mM CaCl2, % 0,05 Ara 20) akmak için bir pipet kullanın. Kanalda kabarcıklar oluşursa, kabarcıkları çıkarmak için agresif bir şekilde ek bir 200 μL itin.
      NOT: Bu adımda çıkarılmayan büyük hava kabarcıkları daha sonra yüzey fonksiyonelleştirmeyi yerinden çıkarıp yok edebilir.
    2. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek ve 10 dakika kuluçkaya yatmak için akış odasına 40 μL BSA (%1 w/v) ekleyin.
    3. Her kuluçka döneminde akış odalarını dolduracak ve giriş ve çıkışlarda damlacıklar oluşturacak kadar hacim eklediğinizden emin olun. Kuluçka hacimlerini buna göre ayarlayın ve tüm inkübasyonları bir nem odasında gerçekleştirin.
    4. Akış odasına 40 μL Ara 20 (%5 v/v) ekleyin. Spesifik olmayan bağlamayı daha da azaltmak için 10 dakika kuluçkaya yatır.
    5. (İsteğE BAĞLI) Kanal üzerinden polistiren boncuklar akarak yüzeyde yeterli pasivasyon olup olmadığını kontrol edin. 40 μL ProtG kaplı polistiren boncuk (%0,01 w/v) ve 10x hedefe sahip bir karanlık alan mikroskobu kullanarak görüntü ekleyin. Boncuklar yüzeye yapışmazsa, bir sonraki adıma geçin.
    6. Tüm pasivasyon maddelerini çıkarmak için kanalı 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
  2. Oda yüzeyi fonksiyonelleştirme
    1. Akış odasına 40 μL streptavidin (100 μg/mL) ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
    2. Akış odasına 40 μL hibrit ProtG-TGT (100 nM) ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
    3. Yüzeydeki herhangi bir yibritsiz TGT alt telini tamamlamak için 20 dakika boyunca 40 μL ProtG-TGT üst tel (100 nM) ekleyin. 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
    4. Akış odasına 40 μL P-selectin-Fc (10 μg/mL) ekleyin ve 60 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
      NOT: Kuluçka süresi kritiktir.

5. Deney ve görüntüleme

  1. Akış sistemi kurulumu
    1. 5 mL'lik bir cam şırınnayı haddeleme tamponu ile doldurun (2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, % 0,1 BSA ile HBSS). Kabarcıkları yerinden çıkarmak için şırınganın kenarlarına dokunarak ve uğulda doğru yüzerken dışarı iterek şırıngada hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
    2. Steril bir iğne (26 G, 5/8 İnç Uzunluğunda) ~200 mm polietilen boruya (I.D: 0,38 mm) yerleştirin; O.D: 1.09 mm) ve iğneyi cam şırıngaya bağlayın.
      NOT: İğne konnektöründe herhangi bir yere hava sıkışmamasını sağlayın.
    3. Şırınd'ı şırındıcı pompaya sabitleyin ve şırınna pompasını, hava kabarcıklarının kanala girmesini önlemek için piston tarafı yükselecek şekilde eğin. Tüpün ucını akış odası girişine yerleştirin.
      NOT: Damlacıkları girişlere biriktirerek ve şırınna borunun ucunda damlacıklar bulunarak bağlantıyı kurarken sıvı temastan sıvıya emin olun. Şırınna borunun ucunda küçük bir damla oluşmasına izin vererek kanala hava kabarcıklarının girmemesini sağlayın.
    4. Diğer 200 mm polietilen borunun bir ucunu prize, diğer ucunu ise atık bir kabın içine yerleştirin.
  2. Hücre çalışırken ayarlama
    1. HL-60 hücrelerini 25 cm2 havalandırmalı kültür şişelerinde IMDM ortamlarında %20 fetal sığır serumu ve %1 antibiyotik ile 37 °C'de %5 CO2 ile destekleyin. 1 x 105-2 × 106 hücre/mL arasında hücre yoğunluklarını koruyun.
    2. (İsteğE BAĞLI) HL-60 hücrelerini 2 x 105 hücre/mL başlangıç yoğunluğunda %1,25 DMSO içeren eksiksiz bir IMDM ortamında ayırt edin. Hücreleri 5-6 gün boyunca en aktif olacak şekilde kuluçkaya yatır.
    3. Hücreleri peletmek için hücre süspansiyonundan ve santrifüjden (200 x g, 3 dk) bir örnek (1-2 mL) alın.
    4. Ortamı çıkarın ve hücreleri yuvarlanan tamponun 500 μL'sinde hafifçe yeniden biriktirin. Hücresel kalıntıları gidermek için yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
    5. Hemositometre ile hücre yoğunluğunu ölçün. Hücre peletlerini haddeleme tamponu ile 2 x 105 hücre/mL yoğunluğa yeniden biriktirin.
    6. Boruyu hücre süspansiyonunun giriş/çıkış ve pipet 40 μL'sinden akış odasına dikkatlice çıkarın. Boruyu daha önce açıklandığı gibi yeniden bağlayın, akış kanalına kabarcık sokulmamasını sağlayın.
    7. Şırınd pompasını istediğiniz akış hızlarında başlatarak hücre haddeleme deneyine başlayın.
      NOT: Floresan izlerin yoğunluğu kesme stresine bağlıdır ve daha düşük hücre hızı kesme stresi / hücre hızı genellikle daha düşük parçalar üretecektir (Şekil 4A). Ayrılabilir tek hücreli izler sağlamak için yüzeydeki yüksek hücre yoğunluğundan veya aşırı yuvarlanma süresinden kaçının (Şekil 4B,C).
    8. Hücre yuvarlanmasının gözlendiğine emin olmak için 10x hedefli bir karanlık alan mikroskobu kullanın.
    9. Deneme tamamlandıktan sonra, yüzey hücresiz olana kadar yuvarlanan arabelleği 100 mL/s'ye infüze ederek hücreleri kanaldan çıkarın.
  3. "Nanoscale Topografyada Görüntüleme için DNA Tabanlı Nokta Birikimi" (DNA-PAINT) ile yerel parçaları görüntüleme
    1. Kanala DNA-PAINT tamponunda (%0,05 Ara-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) 40 μL DNA-PAINT görüntüleyicı iplikçik (500 pM) ekleyin.
    2. 100x yağ daldırma TIRF objektif lens kullanarak Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisi gerçekleştirin. Elektron çarpan yük bağlantılı cihaz (EMCCD) kamera kullanarak 300 elektron çarpma (EM) kazancıyla kare başına 25 ms pozlama süresine sahip 40000' den fazla kare elde edin.
    3. 5.3.4-5.3.5 adımlarını izleyerek süper çözünürlüklü görüntüleri (Şekil 4D) yerelleştirmek ve işlemek için Picasso yazılım paketi17'yi kullanın.
    4. Her karedeki her floroforun yerelleştirilmesini belirlemek için DNA-PAINT filmini Localize programına yükleyin.
      NOT: Yalnızca floroforlar doğru bir şekilde izlenene kadar kutu yan uzunluğunu ve Min. Net Degrade parametrelerini optimize edin. Min. Net Gradyan parametresi, optimum izleme elde etmek için genellikle 100000'in üzerine çıkabilir. Uyum ayarı: MLE, entegre Gauss yöntemi en iyi sonucu üretir. Son olarak, film çok uzunsa, Localize'deki önizleme izlemenin son bir HDF5 dosyasında yeniden birleştirmeden önce düzgün çalışması için 10000 karelik yığınlara bölün.
    5. Ardından, sürüklenme düzeltmesi ve işleme gerçekleştirmek için elde ettiği hdf5 dosyasını Render programına yükleyin.
      NOT: Nihai sonucu iyileştirmek için RCC tarafından Undrift aracılığıyla birden fazla sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin.
  4. Kalıcı etiketleme ile uzun parçaları görüntüleme
    1. Kalıcı görüntüleyicİ telini ekleyin ve T50M5 tamponunda 120 sn kuluçkaya yatırın. Kanalı 200 μL yıkama tamponu aşılayarak yıkayın.
    2. Arka plan kamerası gürültüsü elde etmek için heyecan lazeri kapalıyken bir görüntü kaydedin. TIRF mikroskopisi ile ızgara deseninde geniş bir alanı görüntüleyin.
      NOT: Sonraki dikiş için kare üstü %≥10 çakışma önerilir.
    3. Mikroskobu 400 x 50 görüntü (toplamda 20000 görüntü) alanı üzerinde taramak üzere programla. FIJI programını kullanarak, ham verileri her biri en fazla 10000 görüntü içeren ayrı tiff dosyalarına bölün.
    4. 5.4.5-5.4.7 adımlarını izleyerek aydınlatma profilini (Şekil 3A-C) kullanarak tüm görüntüleri düzleştirin.
    5. Arka plan kamerası gürültüsünü her kareden çıkarın. Arka planda çıkarılan her çerçevenin ortalama yığın projeksiyonunu (aydınlatma profili) elde edin.
    6. Aydınlatma profilini maksimum değerine göre normalleştirin. Arka planda çıkarılan her kareyi normalleştirilmiş aydınlatma profiline bölün.
    7. Düzeltilen kareleri karşılık gelen bit derinliği için uygun aralığa yeniden ölçeklendirin.
    8. Görüntüleri dikmek için MIST18 kullanın (Şekil 3D,E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıdaki protokol, yapışkan ayak izi testinin deneysel prosedürünü açıklar. Genel deney iş akışı Şekil 1'de, akış odası montajından (Şekil 1A) yüzey fonksiyonelleştirmesine (Şekil 1B) ve deney ve görüntüleme adımlarına (Şekil 1C) kadar gösterilmiştir.

Şekil 2 , ProtG-ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için temsili bir sonuçtur. Nihai üründeki üç bileşenin UV/Vis spektrumu, yani ProtG, mal-ssDNA ve imidazol elution tamponu, her biri bilinen bir konsantrasyona karşılık gelen son konjugasyondan (Şekil 2A) önce toplanarak toplandırıldı. Bu spektrumlar, bilinmeyen üç parametrenin konsantrasyonları olduğu biyokonjugasyon ürün spektrumuna uyum sağlamak için ortogonal temeli oluşturur. Konsantrasyonları belirlemek için MATLAB'da özel bir işlev kullanılmıştır. Sonuçlar protg'un ssDNA'ya oranının yaklaşık 1:1 olduğunu göstermektedir (Şekil 2A). Bu beklendiği gibidir, çünkü ssDNA'nın sadece bir amin modifikasyonu vardır ve ProtG'nin C-terminus'larında tasarlanmış tek bir sistein vardır. Bu yaklaşım, konjugasyon oranının kolayca korunamadığı ProtG'deki birincil aminlerin çokluğunu hedeflemek için tek bir tiyol modifiye DNA kullanarak daha önce bildirilen yaklaşım19 için daha avantajlıdır.

Ayrıca, biyokonjugasyonu doğrulamak için yerel PAGE kullanılmıştır (Şekil 2B). DNA sırasıyla GelGreen ve proteinler Coomassie mavisi tarafından lekelenir. GelGreen dsDNA'yı ssDNA'dan daha güçlü bir şekilde lekeledikçe, herhangi bir ssDNA bandının dsDNA bantlarının eşit azı dişi konsantrasyonuna göre daha azıcı olması beklenir (şerit 3, 4). ProtG stoku bir C-terminal sistein kalıntısı içerdiğinden, proteinlerin bir kısmı şerit 5'te görüldüğü gibi disülfid bir bağdan dimer oluşturur (Şekil 2B). Azaltılmış ProtG ise tek bir bant gösterir (şerit 6). Dna konjugasyonunda doğrudan protG stokunu kullanırken, disülfid küçültülmüş ProtG DNA'ya tepki vermez ve herhangi bir GelGreen lekesi olmadan bir bant olarak gösterir (şerit 7, 8). ProtG dimer bandı, azaltılmış ProtG (şerit 9, 10) kullanılarak konjugasyon ürününde kaybolur. Konjugasyon sırasında ProtG'ye (1.5:1) fazla mal-ssDNA kullanıldığından, son konjugasyon ürününde (şerit 8, 10) yalnızca TGT bantları görülebilir. Monomerik ProtG bandına denk gelen parlak GelGreen bantları başarılı konjugasyon ve iyi verim gösterir.

Şekil 3, temsili ham mikroskopi görüntülerini ve bunları sonraki görüntü dikişi ve analizi için düzeltmek için iş akışını göstermektedir. Tek modlu bir fiberden sunulan TIRF aydınlatma profili genellikle görüş alanının ortasında daha parlaktır ve kenarların etrafında kararmaktadır (Şekil 3A,B). Düzensiz aydınlatmayı telafi etmek ve nicel analiz için görüntüleri düz hale getirmek için, aydınlatma profili ortalama binlerce ayrı çerçeve ile belirlenmiştir (Şekil 3B). Düzleştirilmiş görüntüler, kamera gürültüsünün hem ham hem de aydınlatma profillerinden çıkarılması ve daha sonra aydınlatma profili ile normalleştirilmesiyle üretilmiştir (Şekil 3C). Görüntüler büyük bir görüntü oluşturacak şekilde dikildiğinde görüntünün düzleştirmesinin etkisi açıkça gösterilmiştir. Herhangi bir hücre izi olmayan arka plan bölgelerindeki görüntü yoğunluğu, düzeltilmemiş görüntülere karşılık gelen net periyodik desenler gösterir (Şekil 3D). Düzleştirilmiş görüntülerden dikilen aynı görüş alanı düz bir arka plan oluşturur (Şekil 3E). Düz bir arka plana sahip olmak, bir hücre izi boyunca yoğunluk dalgalanmalarını yorumlamak için kritik öneme sahiptir. İlk deney olarak, şekil 3F'de gösterilene benzer bir rampa akış profili, hem kararlı hücre yuvarlanmasını hem de berrak floresan hücre izlerini sağlamak için deneye uygun kesme stresi aralığını belirlemek için kullanılır. Bu akış profilinin altındaki tipik bir tek hücreli yapışıklık ayak izi Şekil 3G'de gösterilmiştir, hücre artık yüksek kesme stresinde yuvarlanmaya devam edinceye ve yüzeyden ayrılarak tek bir parçanın sonunu işaretleyene kadar kesme stresi arttıkça yoğunluk artar.

Şekil 4 , yetersizden optimal temsili deneysel sonuçlara kadar potansiyel sonuçları göstermektedir. Şekil 4A , floresan izlerin düşük sinyal-gürültü oranına sahip olduğu düşük bir sonucu göstermektedir. Bu büyük olasılıkla tamamen konjuge probların düşük yüzey yoğunluğundan veya düşük bir akış hızından kaynaklanır. Şekil 4B , floresan izlerin sonraki analizler için tek tek parçaları çözmek ve izole etmek için çok yoğun bir şekilde paketlendiği başka bir yetersiz sonucu göstermektedir. Şekil 4C , tek tek parçaların uzun bir mesafeden çözülebilir ve arka plana karşı net olduğu iyi bir sonuç örneğidir. Şekil 4D , DNA-PAINT (sağ yarım) tarafından görüntülenen aynı parçaya kıyasla kırınım sınırlı TIRF görüntüsünün (sol yarısı) bir örneğidir. Bu kurulumdaki DNA-PAINT, 28,8 nm'lik bir NeNA (en yakın komşu tabanlı analiz) hassasiyeti üretir.

Figure 1
Şekil 1: Yapışkan ayak izi testinin deneme iş akışı. (A) Akış hücresi ve akış odasının montajı. (B) Yüzey pasivasyonu ve fonksiyonelleştirme. Her kuluçka adımı süreye göre işaretlenir ve ardından bir yıkama adımı. (C) Hücre sarma deneyi ve görüntüleme. Yüzeyde yuvarlanan hücreler, yapıştırma etkileşimlerinin oluştuğu DNA'nın fermini çözecek ve her yapıştırma olayının yerini gösteren yüzeyde ssDNA bırakacaktır. Yüzey, geniş alan görüntüleme için kalıcı görüntüleyicİ ssDNA ile etiketlenmiştir ve yıkanmadan önce 2 dakika boyama gerektirir. Süper çözünürlüklü DNA-PAINT görüntüleme için görüntüleyiç teli tamponda tutulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Biyokonjugasyon karakterizasyonu. (A) Ni-NTA saflaştırılmış biyokonjugasyon ürününün (mavi) UV-VIS emiciliği ve konjugasyon oranını belirlemek için eğri sığar (kırmızı). ProtG (macenta), mal-ssDNA (yeşil) ve imidazol (gri) emilim spektrumu, ürün spektrumu (mavi) için en uygun (kırmızı) oluşturmak için bileşenler olarak kullanılmıştır. Uyumun kalıntısı siyah kesikli çizgi olarak gösterilir. Bu, saflaştırılmış biyokonjugasyon ürününde ProtG ve ssDNA konsantrasyonunu ve azı oranımızı belirlememizi sağlar. (B) Biyokonjugasyon prosedüründeki bileşenlerin Yerel SAYFASI. İlk şeritte düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 bp) gösterilir. Jel görüntüsü yanlış renklidir, yeşil dna lekeli GelGreen ve macenta'da Coomassie mavi protein lekesi (ters). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Geniş alan görüntülemeden görüntü işleme ve temsili sonuçlar. (A) Geniş bir alana döşeme binlerce ham TIRF görüntüsü. (B) Ham görüntülerden türetilen aydınlatma profili. (C) Aydınlatma profili düzleştirilerek düzeltilmiş görüntüler. (D) Ham görüntü fayans dikişli görüntü. Düzensiz aydınlatma profili görüntüde periyodik desenler olarak görülebilir. Mavi ve kırmızı kutular, ortalama yoğunluk profillerinin yansıtıldığı görüntü bölümlerini gösterir (mavi ve kırmızı izler). Ortalama yoğunluk değerleri (rasgele birim) 8 bit görüntülerin (0-255) değerlerini temsil eder. (E) (D) ile aynı alandır, ancak düzleştirilmiş görüntüler kullanılarak dikilir. Projeksiyonlarda büyük ölçekli periyodik desenler gösterilmez. (F) Hücre yuvarlanması ve floresan izleri ile sonuçlanan kesme gerilmelerinin aralığını belirlemek için deneylerde kullanılacak kesme gerilme profili. (G) (F) ile gösterilen akış profilinin altındaki tek bir hücreden örnek bir floresan izi. Hücre soldan sağa doğru hareket eder, kesme stresi arttıkça floresan yoğunluğu artar, hücre artık yuvarlanmaya devam edelim ve yüzeyden ayrılamaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Temsili yetersiz ve optimum sonuçlar. (A) Kontrastı yetersiz floresan izlere bir örnek. (B) Aşırı floresan iz yoğunluğu örneği. (C) Optimum parça yoğunluğu ve kontrast örneği. Her üç görüntü de aynı koşulda elde edildi, düzleştirilmiş ve dikilmişti. Her görüntüdeki kırmızı kutular, yoğunluk projeksiyonlarının (sağda) çekildiği alanı temsil eder. (D) Kırınım sınırlı (sol yarım) ve DNA-PAINT (sağ yarım) görüntülemede gösterilen floresan bir iz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sorun Olası Neden Çözüm
Epoksi bant düzgün kesilmedi Epoksi tabakası çok kalın Razer bıçağı ile epoksi tabakasını mümkün olduğunca inceltin
Lazer gravür gücü ve hızı optimize değil Lazer oyma gücünü ve hızını optimize edin
Akış odasının kenarlarına sıkışmış kabarcıklar Yanlış ilk sıvı girişi Kabarcıkları yıkamak için tampon çözeltilerini yüksek akış hızında kanaldan itin
Kabarcıklar akış odasından geçer Giriş ve çıkış yoluyla yanlış sıvı girişi Pipet ucu ile giriş arasında sıvıdan sıvıya temas sağlamak için giriş borusunda sıvı damlacığı olduğundan emin olun
Şırınnadan gelen kabarcıklar akış hattına girdi Kabarcıkların piston ucunda sıkışmasını sağlamak için şırınna pompasını eğin
Sıvı kanallara giremiyor Çok sıkı vidalanmış girişler Mührü optimize etmek için ayarlayın. Giriş borusu düzgün bir şekilde vidalandığında kanal açıklığına dokunmalıdır.
Kanal sızıntısı Epoksi tam olarak iyileşmedi. Kanalları yeniden yapın, 5 dakika hızlı kürleme epoksisi kullandığınızdan emin olun ve en az 1 saat boyunca kürleyin
Girişler düzgün kapatılmadı Mührü optimize etmek için ayarlayın
Sıkışmış hücreler Spesifik olmayan bağlamaya yol açan zayıf PEGylation İdeal olarak, PEG'i yeniden çevrim. Ayrıca, ek engelleme aracılarını (BSA & Tween-20) kuluçkaya yatırmayı deneyebilir ve arabelleği yıkamak için engelleme aracıları ekleyebilir.
Kanaldan geçen büyük hava kabarcıkları tarafından tahrip edilen yüzey geçişi Hiçbir baloncuğun kanaldan geçmemesini sağlayın
Hücrelerle ilgili sorun Hücre kültürünü donmuş olarak yeniden başlattıktan 2 hafta sonra HL-60 kullanın. Kontrol yüzeyindeki hücre yuvarlanma işlemini yalnızca P-selectin ile onaylayın.
Hücreler yüzeyle seyrek etkileşime girmez veya sahip değildir P-selectin yoğunluğu çok düşük, zayıf yüzey fonksiyonelleştirme ve / veya zayıf biyokonjugasyon sonucu İlk olarak, sorunun biyokonjugasyon veya yüzey biyotin yoğunluğundan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için kontrol olarak ProtG-TGT yerine ProtG-biotin kullanın. Biyokonjugasyon kalitesi ve yüzey biotin yoğunluğunu sağladıktan sonra, TGT-ProtG ve P-selectin-Fc konsantrasyonunu ve kuluçka süresini artırın.
Hücreler yuvarlanır, ancak floresan izler üretmez Yapışıklık etkileşimleri TGT'yi yırtamayacak kadar zayıf Etkileşim kuvvetini artırmak için yuvarlanma deneyi sırasında akış hızını artırın. Hem istikrarlı yuvarlanma hem de floresan paletleri üreten en uygun akış hızını bulmak için ilk rampa yukarı akış profilini (Şekil 3F) öneririz (Şekil 3G)
Kötü kaliteli yüzey, yüksek arka plan floresanlarına ve izleri görmek için yetersiz kontrasta yol açar Yüzey geçişini denetleme

Tablo 1: Sorun giderme. Tablo, bu tahlil yapılırken meydana gelen sorunların olası nedenlerini ve çözümlerini listeler

Ek Kodlama Dosyası 1: ProtG'nin konjugasyon verimliliğini ve ssDNA'ya oranını belirlemek için daha önce toplanan üç spektruma (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA boncuk elütion tamponu) dayanarak nihai ürün spektrumunu ayrıştırmak için özel olarak yazılmış MATLAB komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yapışma ayak izi tahlili, hücre yuvarlama yapışması sırasında PSGL-1 ve P-selectin arasındaki moleküler yapışma olaylarının görselleştirilmesini sağlar. Bu işlem P-selectin aracılı yakalama ve ardından akışkan kesme stresi altında yuvarlanma ile başlatılır. Deney sırasındaki potansiyel sorunlar genellikle hücreler iyi yuvarlandığında bile zayıf hücre yuvarlanmasını veya floresan izlerinin eksik olduğunu içerir. Bu sorunlar genellikle sorun giderme tablosunda listelendiği gibi protokoldeki kritik adımlardaki kalite kontrollerinden kaynaklanmaktadır (Tablo 1).

Yüzey hazırlığı birden fazla adım içerdiğinden, kirlenmeyi önlemek için biyomoleküllerin ve tamponların filtre edilmesi ve 4 °C'de saklanması gerekir. Yüksek kaliteli yüzey pasivasyonu, uygun yüzey fonksiyonelleştirme yoğunluğunu elde etmek ve biyomoleküllerin spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için bir gerekliliktir. Biyomoleküllerin yüzeye spesifik olmayan bağlanması, tek moleküllü floresan görüntüleme ve istatistiksel veri analizine müdahale ederek yüksek bir floresan arka plan oluşturabilir. Birden fazla faktör yüzey geçişini etkileyebilir. Aminosilane ve PEG-NHS hidrolizi PEGilasyon çok daha düşük verimlilik verir. Yeterli KOH yıkama ve piranha temizliği, cam yüzeyinde serbest hidroksil grupları oluşturarak hidrofilizliği arttırır ve kimyasal olarak reaktif grubun yoğunluğunu arttırır. Hücreler kötü pasifleştirilmiş yüzeylere sıkışmış olurdu. Yüzey pasivasyonunun kalitesi, floresan biyomoleküller kullanılarak PEGylation öncesi ve sonrası arka plan floresan yoğunluğu ölçülerek kontrol edilir.

Ligandların yüzey yoğunluğu, PEG tarafından kontrol edilen hücre haddeleme için kritik bir faktördür: PEG-biotin oranı, TGT hibridizasyonu ve P-selectin bağlama. Bu sistemde, hücre haddeleme için yeterli P-selectin ile yüzey fonksiyonelleştirme için 20:1 PEG: PEG-biotin oranı yeterlidir. Verimli TGT hibridizasyonu, floresan paletlerin yüzey yoğunluğunu ve sinyal-gürültü oranını da artırır. Bu protokol, herhangi bir yibritsiz TGT alt telinin deneylerden önce tamamlanmasını sağlamak için üst iplikçik-TGT-ProtG'nin bir ikmal adımını içerir. DNA'nın ProtG'ye konjugasyonu da yüzey yoğunluğunu etkiler. Sulfo-SMCC bağlayıcı, DNA'ya 10 kat azı dişi fazlalığında eklendi, böylece tüm DNA bağlayıcı ile reaksiyona alındı. C-terminusta tek sistein kalıntısı (ProtG-Cys) bulunan ProtG, 1:1 DNA elde etmek için kullanıldı: ProtG konjugasyon oranı. ProtG-Cys disülfit bağları yoluyla dimer oluşturabildiğinden, sülfit-reaktif çapraz bağlama reaksiyonlarından önce disülfit bağını azaltmak için TCEP tedavisine ihtiyaç vardır. Protein konjuge DNA ve TGT hibridizasyonu, konjuge DNA ve DNA dubleksinin moleküler ağırlığın artması nedeniyle geri zekalı hareketliliği göstereceği yerel PAGE analizi ile doğrulanabilir. Montaj verimliliği jel densitometrisi ile de tahmin edilebilir (Şekil 2B). Dikkatli PEGylation ve biyokonjugasyon süreçleri tutarlı bir yüzey üretmek için çok önemlidir. Bazen, hücre durumu hücre yuvarlanma ve izleme oluşumunu etkileyebilir. Hücre yoğunluğu üzerinden PSGL-1 ekspresyözü bildirilmemiş olsa da, hücre yoğunluğu büyüme aşamasında hücre döngüsünün ve protein ekspresyonunun güçlü bir düzenleyicisidir.

PSGL-1'in aynı zamanda bir sinyal transdüksiyon reseptörü olarak işlev aldığı ve hücre çoğalmasını düzenlediği göz önüne alındığında20,21, PSGL-1'in tutarlı ifade seviyesi ve bağlama yeteneği için hücre yoğunluğu gibi kültür koşulları korunur. ProtG tarafından aracılık edilen P-selectin-Fc'nin yüzeye bağlanması, hücrelerin yapışması ve yuvarlanması için çok önemlidir. P-selectin'in ProtG'ye bağlanması konsantrasyona bağlıdır. Daha düşük P-selectin konsantrasyonları dengeye ulaşmak için zaman artışına yol açar. 100 nM22'den düşük konsantrasyonlar için doygunluk bağlama için en az 30 dakika gereklidir. ProtG ile yeterli etkileşim için yüzeye spesifik olmayan bağlamayı ve daha fazla inkübasyon süresini azaltmak için 10 nM P-selectin kullanıldı. 1 saat inkübasyon, bu sistemde hücre yapıştırılmasını ve yuvarlanmasını sağlamak için yeterli bir zamandır.

TGT ve buna karşılık gelen kuvvete bağlı ömür, bu tahlil sonuçlarında önemli bir faktördür. Yuvarlanma yapışıklığı sırasında, bağlamadaki kuvvet hem TGT hem de P-selectin: PSGL-1 etkileşimi yoluyla iletilir. Bu bileşenlerin her biri benzersiz bir kuvvete bağımlı ömrlüğe sahiptir ve uygulanan kuvvete bağlı olarak, kopma olasılığı birini diğerine tercih edecektir. Örneğin, bu makalede açıklanan TGT'yi kullanırken, 13,6 pN'nin altındaki kuvvetlerde, P-selectin: PSGL-1'in öncelikle ayrıştığı, 13,6 pN'nin üzerinde ise TGT'nin öncelikle ayrıştığı gösterilmiştir13. Bu tahlil yapılırken bunu anlamak önemlidir, çünkü kesme stresi çok düşükse veya boncuklar çok yavaş yuvarlanıyorsa, yırtılma olayları öncelikle P-selectin: PSGL-1 etkileşimi olacaktır ve TGT'lerden minimum veya ölçülebilir floresan sinyali olmayacaktır. TGT'nin gerilim eşiği de sonuçları etkileyecektir. TGT çok yüksek bir kuvvette yırtılırsa, kopma olayları öncelikle P-selectin: PSGL-1 olacaktır ve minimum floresan sinyali olacaktır.

Burada açıklanan yöntem, moleküler kopma kuvvetlerinin analizine ve yuvarlanan yapışmada rol oynayan moleküler yapışma olaylarının yerlerine izin verir. Yapışıklıkların gerçek zamanlı tespiti yerine, bu yöntemin en önemli avantajı deney sonrası görüntüleme ve analize izin veriyor olmasıdır. Yapışma ayak izi yüzeyde ssDNA şeklinde bırakıldıktan sonra, akış kanalları kurumasını önlemek için hem girişler hem de çıkışlar tıkanmış karanlık bir nem odasında 4 °C'lik bir buzdolabında tutulursa, izler 12 saat sonra görüntülenebilir. Bu test için floresan okumanın yorumlanması seçilen görüntüleme yöntemine bağlıdır. Süper çözünürlüklü görüntüleme sayesinde, bu test yırtılmış TGTs13 yoğunluğunun nicel analizini sağlayan yüksek uzamsal çözünürlük (<50 nm) elde eder. Reseptör yoğunluğunun veya yırtılmış TGT yoğunluğunun analizi, farklı koşullar altında yuvarlanan yapışıklık davranışının araştırılmasında yararlı olacaktır. Aksine, kırınım sınırlı görüntüleme yüksek bir mekansal çözünürlük sağlamaz; bununla birlikte, yüzlerce görüş alanı üzerinde birden fazla boncukun floresan izlerini analiz etmek için geniş bir yüzey alanının görüntülenmesini sağlar. Bu avantajlıdır, çünkü bir parçanın floresan yoğunluğu, zaman içinde yuvarlanma davranışındaki değişiklikler hakkında bilgi sağlayan büyük bir mesafeden tek bir boncuk için analiz edilebilir. Böyle bir örnek, zaman içinde kesme stresini değiştirmek ve floresan yoğunluğundaki ilgili değişiklikleri gözlemlemektir. Son zamanlarda, basit bir model aracılığıyla, izlerin floresan yoğunluğunun moleküler kuvvet dağılımını tahmin etmek için kullanılabileceği gösterilmiştir13. Bu tahlil23 ile kuvvet nicelemesi elde etmek için oranmetrik yöntemlerin potansiyel uygulaması da vardır.

Hücre yuvarlanması hızla (10sn μm/s) ve uzun bir mesafede (1000'lerce μm) gerçekleştiğinden, moleküler gerilimlerini incelemek geleneksel gerçek zamanlı moleküler gerilim sensörleriyle zor olmuştur. Yapışıklık ayak izi tahlili, olay sonrası görüntülemeye izin vermek için bu zorlu kısıtlamayı kırar. TGT kopma olayı, yırtılmadan önce yaşanan gerilimin büyüklüğünü doğrudan bildirmese de, yuvarlanan yapışmada rol oynayan moleküler kuvvetlerin nicel olarak araştırılmasına izin vermek için floresan izlerinin analizinde umut verici gelişmeler yapılmıştır13,23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Acknowledgments

Bu çalışma Kanada İnovasyon Vakfı (CFI 35492), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı (SCH-2020-0559) ve British Columbia Üniversitesi Saygınlık Fonu tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel drill guide Custom made 3D printed with ABS filament
4-holes slide Custom made Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone VWR BDH1101-4LP
Acrylic spacer Custom made Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder Custom made Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane AlfaAesar L14043 CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution Cytiva HyClone SV3007901 Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene Spherotech PGP-60-5
Bovine serum albumin VWR 332
Buffer, DNA PAINT 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride VWR BDH9224
Cell culture flasks VWR 10062-868
Concentrated sulfuric acid VWR BDH3072-2.5LG 95-98%
Coverslip holding tweezers Techni-Tool 758TW150
Diamond-coated drill bits Abrasive technology C5250510 0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand) IDT DNA Custom oligo CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) IDT DNA Custom oligo /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT IDT DNA Custom oligo GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling IDT DNA Custom oligo CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape Scotch 237 3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA Thermofisher 15575020 0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy Gorilla 42001 5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS) Avantor 97068-085
GelGreen Biotium 41005
Glacial acetic acid VWR BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips Fisher Scientific 12-548-5P
Glass, Microscope slide VWR 48300-026 75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar VWR 74830-150 Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) Lonza 04-315Q
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA
HL-60 cells ATCC CCL-240
Humidity chamber slide support Custom made 3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide VWR BDH7690-1 30%
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Inlets/outlets Custom made Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) Lonza 12-722F
Magnesium chloride VWR BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads Invitrogen 10103D
Mailer tubes EMS EMS71406-10
Methanol VWR BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns Biorad 7326200 In SSC Buffer
PEG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
PEG-biotin Laysan Bio Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide VWR 470302-132
Protein, Protein G Abcam ab155724 N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc R&D System 137-PS Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin Cedarlane CL1005-01-5MG
Pump Syringe Harvard Apparatus 704801
Sodium bicarbonate Ward’s Science 470302-444
Sodium chloride VWR 97061-274
Sulfo-SMCC Thermofisher 22322
Syringe Hamilton 81520 Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles BD 305115 Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP Sigma-Aldrich C4706-2G
Tris VWR BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor Tygon ABW00001 Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene BD Intramedic 427406 Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20 Sigma-Aldrich 93773

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).

Tags

Biyoloji Sayı 175 yuvarlanan yapışma lökosit selectin P-selectin glikoprotein ligand-1 (PSGL-1) moleküler kuvvet sensörü yapışma ayak izi testi gerilim ölçer tether (TGT) nano ölçekli topografyada görüntüleme için DNA tabanlı nokta birikimi (DNA-PAINT)
Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

An, S. M., Kim, S. H., White, V. J., More

An, S. M., Kim, S. H., White, V. J., Yasunaga, A. B., McMahon, K. M., Murad, Y., Li, I. T. S. Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay. J. Vis. Exp. (175), e63013, doi:10.3791/63013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter