Bu protokol, yaprak haznesinin tükürük proteinlerini ve yaprak haznesi vektörleri tarafından salınan bitki viral proteinlerini tespit etmek için bitki konağının nasıl kullanılacağını göstermektedir.
Böcek vektörleri yatay olarak tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsünü iletir. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, delici emici ağız kısımlarına sahip hemipteran böcekler tarafından bulaşır. Viral bulaşma sırasında, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçıyı köprüler, çünkü tükürük vektörleri virüsleri ve böcek proteinleri, bitkilerin böceklerden bitki konakçılarına bağışıklık tepkisini tetikler veya bastırır. Tükürük proteinlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri, arbovirüs-konakçı etkileşimlerinin araştırma alanında yeni bir odak alanı haline gelmektedir. Bu protokol, bitki konağını kullanarak yaprakçıkların tükürüğündeki proteinleri tespit etmek için bir sistem sağlar. Pirinç cüce virüsü (RDV) ile enfekte olmuş yaprak vektörü Nephotettix cincticeps buna bir örnek teşkil eder. N. cinctiacps’ın tükürüğü tarafından vektörleştirilen RDV’nin vitellogenin ve majör dış kapsid proteini P8, N. cinctiacps’ın beslendiği pirinç bitkisinde aynı anda tespit edilebilir. Bu yöntem, böcek beslemesinden sonra bitki konakçısında geçici olarak tutulan tükürük proteinlerini test etmek için geçerlidir. Bu tespit sisteminin hemipteran-virüs-bitki veya hemipteran-bitki etkileşimlerinin incelenmesine fayda sağlayacağına inanılmaktadır.
Temel bir problem olan arbovirüslerin vektör-konakçı iletim modu, biyoloji biliminin sınırındadır. Tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsü, böcek vektörleri1 tarafından yatay olarak bulaşır. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, yaprak bitleri, beyaz sinekler, yaprakçıklar, planthoppers ve thrips dahil olmak üzere hemipteran böcekler tarafından vektörleştirilir. Bu böcekler, bitki virüslerini verimli bir şekilde iletmelerini sağlayan farklı özelliklere sahiptir1. Delici emici ağız kısımlarına sahiptirler ve floem ve ksilemden gelen özsu ile beslenirler ve tükürüklerini 1,2,3,4 salgılarlar. Tekniklerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesiyle, tükürük bileşenlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri yoğun araştırmaların yeni bir odağı haline gelmektedir. Tükürükteki bilinen tükürük proteinleri, diğerlerinin yanı sıra pektinesteraz, selülaz, peroksidaz, alkali fosfataz, polifenol oksidaz ve sukraz gibi çok sayıda enzim içerir 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Tükürükteki proteinler ayrıca konakçı savunma tepkisini tetikleyen, böylece böceklerin performansını değiştiren elisitörleri ve konakçı savunmasını baskılayan efektörleri içerir, bu da böcek uygunluğunu arttırır ve konakçı patolojik yanıtlarını indükleyen bileşenler14,15,16,17. Bu nedenle, tükürük proteinleri böcekler ve konakçılar arasındaki iletişim için hayati öneme sahip malzemelerdir. Virüslerin bulaşması sırasında, delici emici virülifer böceklerin tükürük bezleri tarafından salgılanan tükürük de viral proteinler içerir. Viral bileşenler, onları böcekten bitki konağına serbest bırakmak için tükürük akışını kullanır. Bu nedenle, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçı tritrofik etkileşimini köprüler. Virülifer böcekler tarafından salgılanan tükürük proteinlerinin biyolojik fonksiyonunun araştırılması, virüs-vektör-konakçı ilişkisinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Hayvan virüsleri için, sivrisineklerin tükürüğünün Batı Nil virüsü (WNV) ve Dang virüsünün (DENV) bulaşmasına ve patojenitesine aracılık ettiği bildirilmektedir. Tükürük proteini AaSG34, dang humması-2 virüsü replikasyonunu ve iletimini teşvik ederken, tükürük proteini AaVA-1, otofajiyi aktive ederek DENV ve Zika virüsü (ZIKV) bulaşmasını teşvik eder18,19. Sivrisineklerin tükürük proteini D7, DENV viryonları ve rekombinant DENV zarf proteini20 ile doğrudan etkileşim yoluyla in vitro ve in vivo DENV enfeksiyonunu inhibe edebilir. Bitki virüslerinde, begomovirüs domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV), beyaz sineklerin tercihini ve performansını arttırmak için bitki konağının WRKY33 aracılı bağışıklığını baskılayan beyaz sinek tükürük proteini Bsp9’u indükler ve sonunda virüslerin bulaşmasını arttırır21. Böcek tükürük proteinlerinin bitki konakçılarında oynadığı rol üzerine yapılan çalışmalar, hayvan konakçılarınınkinin gerisinde kaldığından, bitki konakçılarındaki tükürük proteinlerini tespit etmek için kararlı ve güvenilir bir sisteme acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Pirinç cüce virüsü (RDV) olarak bilinen bitki virüsü, yaprak haznesi Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) tarafından yüksek verimlilikle ve sürekli çoğalan bir şekilde bulaşır22,23. RDV’nin ilk olarak bir böcek vektörü tarafından bulaştığı ve Asya’da ciddi bir pirinç hastalığına neden olduğu bildirilmiştir24,25. Virion ikosahedral ve çift katmanlı küreseldir ve dış tabaka P8 dış kapsid proteini22’yi içerir. N. cinctiaceps’te RDV’nin dolaşım süresi 14 gün 26,27,28,29,30’dur. RDV tükürük bezlerine ulaştığında, virionlar ekzositoz benzeri bir mekanizma 23 aracılığıyla tükürük bezlerindeki tükürük depolanan boşluklara salınır. Vitellogenin (Vg), dişi böceklerde oosit gelişimi için gerekli olan yumurta sarısı proteini öncüsüdür31,32,33. Çoğu böcek türü, yaklaşık 220 kDa’lık bir öncü proteini kodlayan 6-7 kb’lik en az bir Vg transkriptine sahiptir. Vg’nin protein öncülleri genellikle yumurtalık 18,19’a girmeden önce büyük (140 ila 190 kDa) ve küçük (<50 kDa) parçalara ayrılabilir. Önceki proteomik analiz, Vg’den türetilen peptitlerin, işlevleri bilinmemekle birlikte, yaprakçık Recilia dorsalis’in salgılanan tükürüğünde varlığını ortaya koymuştur (yayınlanmamış veriler). Bitkilerden ağızdan salgılanan Vg’nin, bitkilerin savunmalarına zarar vermek için bir efektör olarak işlev gördüğü yeni bildirilmiştir34. N. cinctiaces’in Vg’sinin tükürük akışıyla bitki konakçısına da salınıp bırakılamayacağı ve daha sonra bitki savunmasına müdahale etmek için bitkide rol oynayıp oynayamayacağı bilinmemektedir. N. cinctiaceps’in bitki savunmasını inhibe etmek veya aktive etmek için Vg gibi tükürük proteinlerini kullanıp kullanmadığını ele almak için ilk adım, beslenme sırasında bitkiye salınan proteinleri tanımlamaktır. Bitkide bulunan tükürük proteinlerini tanımlama yöntemini anlamak, tükürük proteinlerinin işlevini ve Hemiptera ile bitkiler arasındaki etkileşimleri açıklamak için potansiyel olarak gereklidir.
Burada sunulan protokolde, N. cinctiacps , böcek besleme yoluyla tanıtılan bitki konakçısında tükürük proteinlerinin varlığını incelemek için bir yöntem sağlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Protokol öncelikle tükürük proteinlerinin toplanmasını ve tespitini detaylandırır ve çoğu hemipteran üzerinde daha fazla araştırma için yararlıdır.
Delici emici böceklerin tükürük bezleri tarafından doğrudan salgılanan tükürük çok önemli bir rol oynar, çünkü konakçı dokuları ve vektörlerin krallıklar arası biyolojik faktörlerini konakçılara önceden sindirir ve detoksifiye eder 1,3,4. Elicitors, efektörler ve küçük RNA dahil olmak üzere krallıklar arası biyolojik faktörler, böcek-konakçı iletişimi için kritik öneme sahiptir<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31772124 ve 31972239) ve Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi’nden (Grant KSYLX014) gelen hibelerle desteklenmiştir.
Reagents | |||
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
Buffers and Solutions | |||
Buffer | Composition | Comments/Description | |
5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
Instruments | |||
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |