Summary
本文描述了如何在晶对晶器件上设置蛋白质结晶，以及如何使用片上结晶平台在室温下执行自动串行数据收集。
Abstract
通过展示蛋白质如何在其功能状态之间转变，可以最好地理解生化反应和生物过程。由于低温是非生理性的，并且可能会阻止，阻止甚至改变蛋白质结构动力学，因此非常需要一种在室温下进行常规X射线衍射实验的稳健方法。本协议中使用的晶对晶装置及其随附的硬件和软件旨在在室温下对不同尺寸的蛋白质晶体进行 原位 X射线衍射，而无需任何样品操作。在这里，我们介绍了从器件组装、片上结晶、光学扫描、晶体识别到 X 射线拍摄计划和自动数据收集的关键步骤的协议。由于该平台不需要晶体收集或任何其他样品操作，因此可以将芯片上生长的数百至数千个蛋白质晶体以可编程和高通量的方式引入X射线束中。
Introduction
由于X射线辐射的电离效应，蛋白质晶体学在很大程度上仅限于过去三十年的低温条件。因此，目前对蛋白质功能期间运动的知识主要来自低温条件下在不同状态下观察到的静态结构之间的比较。然而，当蛋白质分子起作用时，低温不可避免地会阻碍生化反应的进展或不同构象状态之间的相互转化。为了通过晶体学以原子分辨率直接观察蛋白质结构动力学，需要在室温下进行衍射实验所需的稳健和常规方法，这需要在样品输送，数据收集和后验数据分析方面进行技术创新。为此，连续晶体学的最新进展为在室温1，2，3下捕获中间体和短寿命结构物种的分子图像提供了新的途径。与传统低温晶体学中广泛使用的“一晶一数据集”策略相比，连续晶体学采用类似于单粒子冷冻电子显微镜的数据收集策略。具体来说，从大量单个样品中收集连续晶体学中的实验数据，然后进行密集的数据处理，其中评估数据分数并将其组合成一个完整的数据集以进行 3D 结构测定4。这种“一晶一击”策略通过衍射前破坏策略有效地缓解了室温下X射线辐射对蛋白质晶体的损伤5。
由于连续晶体学需要大量的蛋白质晶体来完成数据集，因此它对许多蛋白质样品有限和/或涉及精细晶体处理的生物系统提出了重大技术挑战。另一个重要的考虑因素是如何在连续衍射实验中最好地保持晶体完整性。原位衍射方法通过允许蛋白质晶体直接从它们生长的地方衍射而不会破坏结晶室6，7，8，9的密封来解决这些问题。这些免操作方法自然与大规模连续衍射兼容。我们最近报道了基于晶体对晶体概念的原位衍射结晶装置的设计和实现 - 直接在单晶石英上生长的蛋白质晶体11。这种“晶体对晶体”设备具有多种优势。首先，它具有由单晶石英衬底制成的X射线和光透明窗口，其产生的背景散射很小，因此在蛋白质晶体的衍射图像中具有出色的信噪比。其次，单晶石英是相当于玻璃的优良蒸汽屏障，从而为蛋白质结晶提供了稳定的环境。相比之下，使用聚合物基材的其他结晶装置由于蒸汽渗透性而容易干燥，除非聚合物材料具有相当大的厚度，因此有助于高背景散射10。第三，该装置能够将大量蛋白质晶体输送到X射线束，而无需任何形式的晶体操作或收获，这对于保持晶体完整性至关重要11。
为了简化使用晶对晶器件的串行X射线衍射实验，我们开发了一个衍射仪原型，以促进在光学扫描和X射线衍射模式之间轻松切换12。该衍射仪占地面积小，已用于阿贡国家实验室先进光子源（APS）的两个光束线的串行数据收集。具体来说，我们使用BioCARS 14-ID-B进行劳厄衍射，LS-CAT 21-ID-D进行单色振荡。如果同步加速器或X射线自由电子激光束线配备了两个关键功能，则不需要这种衍射仪硬件：（1）电动样品定位，X射线束周围所有方向的行程范围为±12 mm;（2）轴上数码相机，用于在光照明下观察晶体，对正在研究的蛋白质晶体是安全的。单晶石英器件与便携式衍射仪以及用于光学扫描、晶体识别和自动 原位 数据收集的控制软件共同构成了用于连续晶体学的inSituX平台。虽然这一发展主要是由其使用多色X射线源的动态晶体学应用推动的，但我们已经证明了该技术支持单色振荡方法的潜力10，12。通过自动化，该平台提供了一种室温下高通量串行数据收集方法，并且蛋白质消耗量合理。
在本文中，我们详细描述了如何在湿实验室中建立片上结晶，以及如何使用inSituX平台在同步加速器光束线上进行串行X射线数据收集。
批量法用于在类似于相同蛋白质样品获得的气相扩散法的条件下建立片上结晶（表1）。首先，我们建议使用浓度为蒸汽扩散法1.2-1.5倍的沉淀剂。如有必要，可以通过精细网格筛选进一步优化批次结晶条件。优化试验不需要石英晶圆;可以使用玻璃盖玻片代替（见下文）。建议使用部分加载的结晶装置，以保持较小规模的优化试验。许多蛋白质样品已使用批量方法10 在此类设备上成功结晶（表1）。
设备本身由以下部分组成：1）外圈;2）两个石英晶片;3）一个塑料或不锈钢垫片;4）固定环;5）显微镜浸油作为密封剂（图1）。加载在一个芯片上的结晶溶液的总体积取决于实验的目的。结晶室的容量可以通过选择不同厚度和/或内径的垫片来调节。我们通常使用厚度为 50-100 μm 的垫片设置容量为 10-20 μL 的结晶装置。一个典型的设备可以产生数十到数千个足以用于串行数据收集的蛋白质晶体（图2）。
如果成功，片上结晶将在每个石英器件上产生数十到数百甚至数千个蛋白质晶体，准备进行X射线衍射。在同步加速器光束线上，这种装置使用运动学机构安装在衍射仪的三轴平移台上。安装设备的结晶窗口在数十到数百张显微照片中进行光学扫描和成像。然后将这些显微照片拼接成高分辨率蒙太奇。对于光敏晶体，可以在红外（IR）光下进行光学扫描，以避免意外的光活化。已经开发了一种计算机视觉软件来识别和定位随机分布在设备上的蛋白质晶体。然后根据这些晶体的大小、形状和位置对这些晶体进行排名，以告知或指导连续晶体学中的数据收集策略。例如，可以在每个目标晶体上定位单次或多次拍摄。用户可以规划通过目标晶体的单次通过或多条路线。我们已经实施了软件来计算各种旅行路线。例如，最短路线是使用解决旅行推销员问题13 的算法计算的。对于泵浦探头动态晶体学应用，可以选择激光（泵浦）和X射线（探头）射击的时间和持续时间。自动串行数据收集被编程为将每个目标晶体一个接一个地转移到X射线束中。
InplaceX衍射仪的关键部件包括：1）设备支架;2）三轴平移阶段;3）用于光学扫描的光源;4）X射线束停止;5）如果研究光敏蛋白，泵浦激光器;6）树莓派微电脑配备红外感应摄像头;7）控制软件，用于同步电机，相机，光源，泵浦激光器以及与光束线控制的接口。
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Protocol
1. 设备预组装
- 标记外圈（直径 30 mm）以进行样品识别。如有必要，包括项目名称、设备编号、结晶条件和日期（图 1A）。将外圈倒置放在干净的表面上（图1B），并小心地将一个石英晶片放在环内（图1C）。第一个石英晶片用作入射X射线的入口窗口。
- 将少量显微镜浸油（粘度为150cSt）倒入培养皿中。将垫片浸入油中，并确保垫片的两侧都已正确上油（图1D）。通过将垫片轻拍在干净的表面上来去除多余的油。
- 将涂油垫片放在第一个石英晶片的顶部（图1E）。
注意：浸油是一种极好的密封剂，可保护结晶室免受潜在的蒸汽损失。正确组装的切屑通常可以使用数周而不会明显干燥。该预组装步骤在室内灯光下进行。对于光敏样品，所有后续步骤，包括样品装载、设备储存和观察，都必须在安全光下进行。
2. 样品装载和设备组装
- 使用移液管在第一个石英晶片上彻底混合蛋白质溶液和结晶缓冲液。蛋白质样品和缓冲液之间的体积比通常在2：1至1：2之间（图1F）。确保结晶溶液的总体积不超过由垫片尺寸和厚度确定的结晶室的最大容量。混合过程中避免气泡。
注意：结晶缓冲液的组成因实验而异。结晶条件见 表1 。 - 当溶液开始扩散时，将第二个石英晶片放在混合溶液上（图1G）。第二个石英晶片用作衍射X射线的出口窗口。
- 轻轻敲击边缘的第二个石英晶片，以帮助扩散油，同时将空气排出。通过将固定环拧入外圈来固定设备（图1H）。如有必要，请使用拧紧工具（图1I）。请注意，过度拧紧可能会导致精致的石英晶片变形甚至破裂。
3. 器件存储和结晶优化
- 将组装好的设备（图1J）储存在室温下的盒子中或带温度控制的培养箱内。
注意：结晶装置组装后几小时到几天内可能会出现蛋白质晶体。图中显示了几种代表性蛋白质样品的片上结晶的典型结果（图 2）。 - 通过在显微镜下观察结晶装置来监测晶体生长。如有必要，通过迭代第 1-3 节来优化结晶条件。
4. 校准
注意：以下部分中提到的程序和命令在inSituX软件中运行。
- 在芯片支架上安装一个掺杂钇铝石榴石的薄晶体（图 3）。安装光束挡块。通过运行程序获取直接光束的X射线荧光图像：
burnmark.py.param
其中 <设备> 是用户为结晶设备选择的名称。.param 是包含特定于设备的控制参数的文件名。默认值将逐渐替换为协议中的特定值。示例.param 文件显示在 补充文件 1 中。 - 通过运行光束轮廓拟合程序找到直接 X 射线束的精确位置：
beam.py <刻录映像> -d <设备>
其中 <烧伤图像> 是X射线荧光图像的文件名（图4）。
注意：该程序计算精确的直射光束位置以及光束尺寸。光束位置标记来自同一器件的所有晶体的易位目的地。光束尺寸也用于目标规划。
5. 光学扫描
- 将结晶装置放在芯片支架中，并使用指旋螺钉固定装置（图3A）。
- 通过运动机构将芯片支架安装到衍射仪的平移台上（图 3B）。
- 安装适当的光源，以便从设备的光学窗口拍摄显微照片。根据蛋白质样品的光灵敏度以及实验目的，可以使用白光、红外光或其他选择的光。
- 运行扫描程序：
scan.py <设备>.参数
该程序捕获一组自动传输到指定用户计算机的显微照片。 - 在用户计算机上运行切片程序：
tile.py <设备> -x-y
其中
注意：步骤 5.4 和 5.5 通常需要几分钟时间。显微照片的总数从几十到几百不等，具体取决于扫描区域和放大倍率。 - 运行晶体查找程序：
findX.py <蒙太奇> -c <长> <宽> -w <楔形> -x <光束尺寸>
其中 <蒙太奇> 是平铺图像。该程序执行晶体识别和拍摄计划。 <长度> 和 <宽度> 表示要找到的晶体尺寸。如果用户希望避免使用较小的晶体，可以通过设置大于不需要的小晶体尺寸的数字来使用 <宽度> 作为截止值。 <楔形> 是一个角度值，用于设置不规则形状晶体的公差。 <梁尺寸> 是指从上述轮廓拟合中获得的直接梁尺寸（步骤4.2; 图4）。此外，用户可以设置标称值以进一步间隔目标拍摄。这些关键参数可实现特定的晶体选择和目标规划（图 6）。
6. X射线衍射
- 拆下光源并安装光束挡块。设置适当的探测器距离。按照光束线安全协议搜索 X 射线小屋。打开X射线快门和激光快门（如果适用）。
- 运行数据收集程序以进行连续衍射：
collect.py.param -l <光照持续时间>
此命令触发数据收集，其中所有计划的镜头根据预先编程的顺序一个接一个地访问。每个目标晶体被转移到光束位置（步骤4.2）。在每个站点，X射线曝光在有或没有激光照明的情况下以预定的时间延迟进行。 视频 1 显示了以 1 Hz 频率运行的自动数据收集序列。 通常从单个结晶装置收集数十到数百个衍射图像（视频 2）。
注意：第 4 节校准和第 5 节光学扫描在 inSituX 平台中是独立的，因此可以完全转移到另一条光束线上。第6节 X射线衍射在光束线操作中必须涉及一些细节。
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Representative Results
在过去的几年中，已经发表了几个具有代表性的数据集10，12以及来自各种蛋白质样品的晶体学结果和科学发现，包括感光蛋白和酶，例如植物UV-B感光体UVR8，光驱动的DNA修复光解酶PhrB10，来自多域感觉组氨酸激酶的新型远红光感应蛋白14、配体/光双传感器域和细菌植物色素12 的光感核心模块。作为代表性结果，我们在表1中列出了这些蛋白质的片上结晶条件，并直接将它们与用于气相扩散法的条件进行比较。在这里，我们展示了另外四个片上结晶案例研究（图2）和电影中的原位衍射图谱集合（视频2）。表2总结了使用该协议收集的代表性原位数据集。
在一个代表性的案例中，冷冻晶体学导致远红光传感光感受器蛋白的衍射不良，这可能是由于这些晶体的光敏感性和高溶剂含量（~80%）14。从冷冻晶体学数据中获得的电子密度过于模糊，无法解决发色团构象，这是我们科学问题的核心。使用 原位 协议，我们能够避免衍射前的意外光激活，并在室温下从800多个晶体中获得暗数据集。这个来自 原位 连续劳厄衍射的暗数据集导致了更好的电子密度分辨，允许自信地构建表现出迄今为止未知的全Z，syn 构象的胆蛋白发色团的模型（图7A）12，14。我们的动态晶体学实验通过比较来自黑暗中 4，352 个晶体和光照后 8，287 个晶体的数据，进一步揭示了这种远红色感光蛋白的光诱导变化（图 7）。对光诱导差异图的初步分析揭示了中央β片的协同运动，这表明发色团的吡咯环和几个芳香族残基之间的π π堆积的重要性（图7B，C）。深入分析和科学发现将在其他地方介绍。
图 1：结晶装置组件。 每个组件估计每个组件的成本为30美元（两个单晶石英晶片）或10美元（两个玻璃盖玻片）。除垫片外的硬件组件是可重复使用的。（A） 外圈的平坦面有标签，以便识别。（B）将外圈倒置放在干净的表面上。（C）小心地将直径为1英寸的石英晶片放在里面。在结晶试验期间也可以使用玻璃芯片代替，但与X射线衍射不兼容。（D）垫片的两侧都涂有油。（E）将涂油的垫片放置在第一个石英芯片上。（F）将蛋白质和结晶溶液移液到芯片中心并混合。（G）第二个石英或玻璃屑覆盖液滴，使其均匀地分布在芯片上。（H） 在第二个石英晶片上拧上固定环。（I） 使用拧紧工具轻轻拧紧固定环。（J） 完全组装好的装置。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：在石英器件上生长的代表性蛋白质晶体。 （A）细菌植物色素的光感核心模块（ 表1中的Pa497）。（乙，丙）来自多结构域感觉组氨酸激酶的第三GAF结构域的不同构建体（ 表1中的2551g3和2551g3Δα1）。（D）来自双传感器组氨酸激酶的串联感觉域（ 表1中的RECGAF）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：原位 X 衍射仪 。 （A） 结晶装置安装在芯片支架中。虽然设备是垂直安装的，但在芯片上生长的晶体不会掉落，主要是因为组装设备中的液体层非常薄，晶体在生长时会锚定在它们的细胞核上。（B） 安装红外光源进行光学扫描。相机通过棱镜（图片中不可见）沿X射线束捕获蛋白质晶体的内联视图。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：直接梁轮廓拟合。 X射线荧光图像的红色，绿色和蓝色通道用于拟合二维高斯函数。左列显示红色、绿色和蓝色通道的原始图像。中间柱是具有精确梁位置和尺寸的拟合结果。右列显示拟合残差。如果拟合残差的振幅仅涵盖原始图像的一小部分，则直射光束的轮廓拟合成功。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：图像平铺 。 （A）在光学扫描过程中捕获晶体显微照片阵列。光学扫描和数据传输通常需要1-2分钟。相邻的显微照片在水平和垂直方向上共享一条重叠区域，如黄色框所示。（B）将显微照片拼接在一起，根据重叠区域的最佳相关性制作高分辨率蒙太奇。此过程在笔记本电脑上通常需要一分钟。黄色框概述了（A）所示的2 x 2显微照片捕获的区域。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：晶体识别和拍摄规划。 每个粉红色圆圈标志着水晶的主要镜头。如果水晶足够长以定位这些镜头，则黄色圆圈标记其他镜头。粉色线标记了一条路线，作为旅行推销员问题的解决方案。在很大程度上避免了簇状晶体和较小的晶体。晶体发现的侵蚀性可以作为 findX.py 的选项进行调整（步骤5.6）。蛮力“矫枉过正”策略不会留下任何未拍摄的晶体，但可以产生大量衍射图像，但不可处理12。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：组氨酸激酶远红光传感域的电子密度图。 （A）在2.5σ处轮廓的2Fo-Fc图显示了与全Z，syn构象14中的胆蛋白发色团相关的电子密度。标记了吡咯环 A 到 D。（B和C）分别以绿色和红色在±2.5σ处绘制的明暗差异图突出显示了电子密度的增益和损失。请点击此处查看此图的大图。
表 1：蒸汽扩散法和片上批量法之间的结晶条件比较。气相扩散和结晶的批量方法高度相关10，14，15，16，17，18，19。从蒸汽扩散条件开始，可以针对片上结晶优化类似的条件。请按此下载此表格。
表 2：直接从石英设备收集的 原位 数据集摘要。 可以从几个结晶装置中收集数千个劳厄衍射图。 请按此下载此表格。
电影 1：模拟数据收集。 目标晶体被转移到X射线束中，如红色圆圈标记的那样。这部电影中目标晶体的顺序并没有遵循旅行推销员问题的解决方案。激光和X射线曝光在每个站点以编程延迟发射。收集衍射图像。 请点击这里下载此影片。
视频2：衍射图像。 可以从单个结晶装置收集数百个衍射图像。多个设备足以生成完整且高度冗余的数据集（表 2）。 请点击这里下载此影片。
补充文件 1：示例<设备>.param 文件。 一个小的文本文件收集一些特定于每个结晶设备的控制参数。这些参数从其默认值开始，并将随着协议的进行在第 4、5 和 6 节中相应地修改。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
早年在室温下进行的蛋白质晶体学在对抗X射线辐射损伤方面经历了巨大的困难。因此，它已被更强大的低温晶体学方法所取代，因为同步加速器X射线源变得容易获得20。随着X射线自由电子激光器的出现，室温蛋白质晶体学近年来得到了复兴，许多新的发展是由在生理相关温度下观察蛋白质结构动力学的愿望推动的2，21。基于晶体对晶体器件的inSituX平台的开发也受到同样的雄心壮志的推动，即为室温下的动态晶体学研究建立常规和强大的数据收集方法。这种自动串行X射线衍射方法也适用于不适合冷冻的蛋白质晶体的静态结构测定14。在该协议中，我们提出了关键的技术考虑因素以及使用该平台提供室温数据收集所需的关键步骤。该方法特别适用于对机械处理、X 射线辐射损伤或空气暴露敏感的脆弱蛋白质晶体。
该平台原型已在阿贡国家实验室的高级光子源（APS）的两个蛋白质晶体学光束线上进行了广泛的测试。虽然根据该协议设置片上结晶相当简单，但数据收集步骤涉及几个定制的硬件和软件组件。因此，其应用和实施项目特定的数据收集策略可能需要用户和光束线科学家之间的密切合作。换句话说，目前形式的这项技术仅限于那些能够充分访问同步加速器（例如APS）的用户。尽管如此，本协议中描述的整体工作流程和关键步骤将作为任何对室温蛋白质晶体学感兴趣的研究小组的参考或指导。
该平台最显着的优点是不需要晶体操作，例如镶嵌或冷冻，因此在原始条件下衍射了精致的蛋白质晶体。另一个主要优点是，使用单晶石英衬底对蛋白质衍射图像产生的背景散射非常小，同时为长时间（数周至数月）的蛋白质结晶提供稳定的环境。然而，该平台不适合稀疏基质晶体筛选，因为它旨在用于大规模晶体生产。因此，需要事先了解结晶条件，才能为给定的蛋白质样品进行初始片上结晶试验。
在实践中，我们发现一些设备组装步骤，例如如何给垫片上油（步骤1.2）和如何密封设备（步骤2.3），尽管看起来微不足道，但往往直接影响结晶的结果。如果上油不正确，设备可能会很快变干。此外，在组装的最后一步过度拧紧设备可能会使石英晶圆变形，而拧紧不足会导致潜在的泄漏和/或设备不受控制的蒸发。另一个关键步骤是计划X射线拍摄。必须小心处理簇状或拥挤的晶体，以避免通常难以加工的重叠衍射图案。这个问题可以通过使用微聚焦X射线束来缓解。如果晶体形态是一块大的薄板，因此大多数板与石英窗口平行，则可能难以获得完整的数据集。此外，单晶石英片可以在涉及肥皂和有机溶剂的清洁程序后回收和重复使用，以去除油和蛋白质碎片。通常，这些脆弱的碎片中约有80-90%可以清洁而不会损坏以进行下一次实验。对于微聚焦光束线上的小晶体，当晶体定位必须达到更好的精度时，可以升级几个硬件组件，例如更精细的电机、更好的相机和光学器件、更大的放大倍率等。然而，这些都没有接近最先进的限制。因此，有足够的改进空间，没有太大困难。
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Disclosures
ZR是授予Renz Research，Inc.的美国专利9632042上晶体对晶体芯片的发明者。
Acknowledgments
使用先进光子源是阿贡国家实验室为美国能源部运营的科学用户设施，得到了合同DE-AC02-06CH11357的支持。BioCARS的使用得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所的支持，授权号为R24GM111072。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。LS-CAT 第 21 区的使用得到了密歇根经济发展公司和密歇根技术三走廊拨款 085P1000817 的支持。这项工作得到了伊利诺伊大学芝加哥分校，国立卫生研究院（R01EY024363）和国家科学基金会（MCB 2017274）对XY的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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