Summary
תרומה זו מתארת כיצד להגדיר התגבשות חלבונים בהתקני גביש על גביש וכיצד לבצע איסוף נתונים סדרתי אוטומטי בטמפרטורת החדר באמצעות פלטפורמת ההתגבשות על השבב.
Abstract
ניתן להבין בצורה הטובה ביותר תגובות ביוכימיות ותהליכים ביולוגיים על ידי הדגמת האופן שבו חלבונים עוברים בין מצבם התפקודי. מאחר שטמפרטורות קריוגניות אינן פיזיולוגיות ועשויות למנוע, להרתיע או אפילו לשנות את הדינמיקה המבנית של חלבונים, שיטה חזקה לניסויים שגרתיים של עקיפת קרני רנטגן בטמפרטורת החדר רצויה מאוד. התקן הגביש על הגביש והחומרה והתוכנה הנלוות לו המשמשות בפרוטוקול זה נועדו לאפשר עקיפת קרני רנטגן באתרה בטמפרטורת החדר עבור גבישי חלבון בגדלים שונים ללא כל מניפולציה של דגימה. כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור השלבים העיקריים מהרכבת המכשיר, התגבשות על השבב, סריקה אופטית, זיהוי גבישים ועד תכנון צילומי רנטגן ואיסוף נתונים אוטומטי. מכיוון שפלטפורמה זו אינה דורשת קצירת גבישים או כל מניפולציה אחרת של דגימות, ניתן להכניס מאות עד אלפי גבישי חלבון הגדלים על שבב לקרן רנטגן באופן הניתן לתכנות ובתפוקה גבוהה.
Introduction
בשל ההשפעות המייננות של קרינת רנטגן, קריסטלוגרפיה של חלבונים, במידה רבה, הוגבלה לתנאים קריוגניים בשלושת העשורים האחרונים. לכן, הידע הנוכחי על תנועות חלבונים במהלך תפקודו נובע במידה רבה מהשוואות בין מבנים סטטיים שנצפו במצבים שונים בתנאים קריוגניים. עם זאת, טמפרטורות קריוגניות מעכבות בהכרח את התקדמות התגובה הביוכימית או את ההמרה בין מצבי קונפורמציה שונים בזמן שמולקולות חלבון פועלות. כדי לצפות ישירות בדינמיקה המבנית של חלבונים ברזולוציה אטומית על ידי קריסטלוגרפיה, יש צורך בשיטות חזקות ושגרתיות לביצוע ניסויי עקיפה בטמפרטורת החדר, מה שמחייב חידושים טכניים במסירת דגימות, איסוף נתונים וניתוח נתונים אחוריים. לשם כך, ההתקדמות האחרונה בקריסטלוגרפיה סדרתית הציעה דרכים חדשות ללכידת התמונות המולקולריות של חומרי ביניים ומינים מבניים קצרי מועד בטמפרטורת החדר 1,2,3. בניגוד לאסטרטגיית "גביש אחד-אחד-אחד-מערך נתונים" הנמצאת בשימוש נרחב בקריוקריסטלוגרפיה קונבנציונלית, קריסטלוגרפיה סדרתית מאמצת אסטרטגיית איסוף נתונים הדומה לזו של מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים חד-חלקיקית. באופן ספציפי, נתוני הניסוי בקריסטלוגרפיה סדרתית נאספים בשברים קטנים ממספר רב של דגימות בודדות, ולאחר מכן עיבוד נתונים אינטנסיבי שבו שברי נתונים מוערכים ומשולבים לתוך מערך נתונים שלם לקביעת מבנה תלת מימדי4. אסטרטגיה זו של "גביש אחד בשוט אחד" מקלה ביעילות על נזקי קרינת הרנטגן לגבישי חלבון בטמפרטורת החדר באמצעות אסטרטגיית עקיפה לפני השמדה5.
מאחר שקריסטלוגרפיה סדרתית דורשת מספר רב של גבישי חלבון כדי להשלים מערך נתונים, היא מציבה אתגרים טכניים גדולים עבור מערכות ביולוגיות רבות שבהן דגימות חלבון מוגבלות ו/או טיפול עדין בגבישים מעורב. שיקול חשוב נוסף הוא כיצד לשמר בצורה הטובה ביותר את שלמות הגביש בניסויי עקיפה סדרתיים. שיטות עקיפה in situ מטפלות בחששות אלה בכך שהן מאפשרות לגבישי חלבון להתפזר ישירות מהמקום שבו הם גדלים מבלי לשבור את החותם של תא ההתגבשות 6,7,8,9. שיטות נטולות טיפול אלה תואמות באופן טבעי לעקיפה סדרתית בקנה מידה גדול. לאחרונה דיווחנו על תכנון ויישום של התקן התגבשות עבור עקיפה באתרה המבוססת על תפיסה של גביש על גביש - גבישי חלבון הגדלים ישירות על קוורץ מונוקריסטליני11. מכשיר "קריסטל על גביש" זה מציע מספר יתרונות. ראשית, הוא כולל חלון שקוף של קרני רנטגן ואור העשוי ממצע קוורץ חד-קריסטלי, המייצר פיזור רקע מועט, ומכאן שהתוצאה היא יחסי אות לרעש מצוינים בתמונות עקיפה מגבישי חלבונים. שנית, הקוורץ החד-גבישי הוא מחסום אדים מצוין השווה ערך לזכוכית, ובכך מספק סביבה יציבה להתגבשות חלבונים. לעומת זאת, התקני התגבשות אחרים המשתמשים במצעים מבוססי פולימרים נוטים להתייבש עקב חדירות אדים אלא אם כן לחומר הפולימרי יש עובי משמעותי, וכתוצאה מכך תורם לפיזור רקע גבוה10. שלישית, מכשיר זה מאפשר משלוח של מספר רב של גבישי חלבון לקרן הרנטגן ללא כל צורה של מניפולציה או קציר גבישי, שהיא קריטית לשמירה על שלמות הגביש11.
כדי לייעל את ניסויי עקיפת קרני הרנטגן הסדרתיים באמצעות התקני גביש על גביש, פיתחנו אב-טיפוס של דיפרקטומטר כדי להקל על המעבר הקל בין מצבי הסריקה האופטית למצב עקיפת קרני רנטגן12. לדיפרקטומטר זה יש טביעת רגל קטנה והוא שימש לאיסוף נתונים סדרתי בשתי אלומות של מקור הפוטון המתקדם (APS) במעבדה הלאומית ארגון. באופן ספציפי, השתמשנו ב- BioCARS 14-ID-B עבור עקיפת Laue ו- LS-CAT 21-ID-D עבור תנודה מונוכרומטית. חומרת דיפרקטומטר זו אינה נדרשת אם קרן לייזר סינכרוטרון או רנטגן ללא אלקטרונים מצוידת בשתי יכולות עיקריות: (1) מיקום דגימה ממונעת עם טווח נסיעה של ±12 מ"מ סביב קרן הרנטגן לכל הכיוונים; ו-(2) מצלמה דיגיטלית על הציר לצפייה בגבישים תחת תאורת אור הבטוחה לגבישי חלבון הנחקרים. התקן הקוורץ המונוקריסטליני יחד עם דיפרקטומטר נייד ותוכנת הבקרה לסריקה אופטית, זיהוי גבישים ואיסוף נתונים אוטומטי באתרו מהווים יחד את פלטפורמת inSituX לקריסטלוגרפיה טורית. למרות שפיתוח זה מונע בעיקר על ידי יישומי הקריסטלוגרפיה הדינמית שלו באמצעות מקור רנטגן פוליכרומטי, הדגמנו את הפוטנציאל של טכנולוגיה זו לתמוך בשיטות תנודה מונוכרומטיות10,12. עם אוטומציה, פלטפורמה זו מציעה שיטת איסוף נתונים טורית בתפוקה גבוהה בטמפרטורת החדר עם צריכת חלבון במחיר סביר.
בתרומה זו, אנו מתארים בפירוט כיצד להגדיר התגבשות על השבב במעבדה רטובה וכיצד לבצע איסוף נתוני רנטגן סדרתי בקו קרן סינכרוטרון באמצעות פלטפורמת inSituX.
שיטת האצווה משמשת להגדרת התגבשות על השבב במצב דומה לזה של שיטת דיפוזיית האדים המתקבלת עבור אותה דגימת חלבון (טבלה 1). כנקודת התחלה, אנו ממליצים להשתמש במקדם בריכוז של פי 1.2-1.5 מזה של שיטת דיפוזיית האדים. במידת הצורך, ניתן למטב עוד יותר את מצב התגבשות האצווה באמצעות סינון רשת עדין. פרוסות קוורץ אינן נחוצות לניסויי אופטימיזציה; במקום זאת ניתן להשתמש בכיסויי זכוכית (ראו בהמשך). התקני התגבשות טעונים חלקית מומלצים כדי לשמור על ניסויי אופטימיזציה בקנה מידה קטן יותר. מספר דגימות חלבון התגבשו בהצלחה על מכשירים כאלה בשיטת אצווה10 (טבלה 1).
המכשיר עצמו מורכב מהחלקים הבאים: 1) טבעת חיצונית; 2) שני ופלים קוורץ; 3) מכונת כביסה אחת דמוית פלסטיק או נירוסטה; 4) טבעת שמירה; 5) שמן טבילה במיקרוסקופ כחומר איטום (איור 1). הנפח הכולל של פתרון ההתגבשות הנטען על שבב אחד תלוי במטרת הניסוי. ניתן לכוונן את קיבולת תא ההתגבשות על ידי בחירת שים בעוביים שונים ו/או בקוטר פנימי. אנו מקימים באופן שגרתי התקני התגבשות בקיבולת של 10-20 μL באמצעות שימסים בעובי של 50-100 מיקרומטר. מכשיר טיפוסי יכול לייצר עשרות עד אלפי גבישי חלבון המתאימים לאיסוף נתונים סדרתי (איור 2).
כאשר היא תצליח, התגבשות על השבב תייצר עשרות עד מאות ואף אלפי גבישי חלבון בכל מכשיר קוורץ המוכנים לעקיפת קרני רנטגן. בקו קרן סינכרוטרון, מכשיר כזה מותקן על שלב תרגום תלת-צירי של הדיפרקטומטר באמצעות מנגנון קינמטי. חלון ההתגבשות של התקן מותקן נסרק אופטית ומצולם בעשרות עד מאות מיקרוגרפים. מיקרוגרפים אלה נתפרים לאחר מכן למונטאז' ברזולוציה גבוהה. עבור גבישים רגישים לאור, סריקה אופטית יכולה להתבצע תחת אור אינפרא אדום (IR) כדי למנוע פוטו-אקטיבציה לא מכוונת. תוכנת ראייה ממוחשבת פותחה לזיהוי ואיתור גבישי חלבון המפוזרים באופן אקראי במכשיר. גבישים אלה מדורגים לאחר מכן לפי גודלם, צורתם ומיקומם כדי ליידע או להנחות את אסטרטגיית איסוף הנתונים בקריסטלוגרפיה סדרתית. לדוגמה, ניתן למקם יריות בודדות או מרובות על כל גביש ממוקד. משתמשים יכולים לתכנן מעבר יחיד או מסלולים מרובים דרך גבישים ממוקדים. יישמנו תוכנה לחישוב מסלולי נסיעה שונים. לדוגמה, המסלול הקצר ביותר מחושב באמצעות אלגוריתמים המטפלים בבעיית איש המכירות הנוסע13. עבור יישומים קריסטלוגרפיים דינמיים של בדיקת משאבה, ניתן לבחור את התזמון והמשך של צילומי לייזר (משאבה) ורנטגן (בדיקה). איסוף נתונים סדרתי אוטומטי מתוכנת לבצע טרנסלוקציה של כל גביש ממוקד לקרן הרנטגן בזה אחר זה.
הרכיבים העיקריים של דיפרקטומטר insituX כוללים: 1) מחזיק מכשיר; 2) שלב תרגום בעל שלושה צירים; 3) מקור אור לסריקה אופטית; 4) עצירת קרן רנטגן; 5) לשאוב לייזרים אם חלבונים רגישים לאור נחקרים; 6) מיקרו-מחשב Raspberry Pi המצויד במצלמה רגישה ל-IR; 7) בקרת תוכנה לסנכרון מנועים, מצלמה, מקורות אור, לייזר משאבה, ולהתממשק עם פקדי beamline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הרכבה מראש של המכשיר
- סמן את הטבעת החיצונית (קוטר 30 מ"מ) לזיהוי דגימה. במידת הצורך, כלול את שם הפרויקט, מספר ההתקן, מצב ההתגבשות והתאריך (איור 1A). הניחו את הטבעת החיצונית במהופך על משטח נקי (איור 1B), והניחו בזהירות פרוסת קוורץ אחת בתוך הטבעת (איור 1C). פרוסת קוורץ ראשונה זו משמשת כחלון כניסה לצילומי הרנטגן של האירוע.
- מוזגים כמות קטנה של שמן טבילה במיקרוסקופ (צמיגות של 150 cSt) לתוך צלחת פטרי. טבלו שים בשמן, וודאו ששני צידי השים משומנים כראוי (איור 1D). הסירו את עודפי השמן על ידי טפיחה של השן על משטח נקי.
- הניחו את ה-shim המשומן על גבי רקיק הקוורץ הראשון (איור 1E).
הערה: שמן טבילה הוא חומר איטום מצוין המגן על תא ההתגבשות מפני אובדן אדים פוטנציאלי. שבבים המורכבים כראוי בדרך כלל מחזיקים מעמד שבועות ללא ייבוש נראה לעין. שלב טרום הרכבה זה מבוצע תחת אור החדר. עבור דגימות רגישות לאור, כל השלבים הבאים, כולל טעינת דגימות, אחסון מכשירים ותצפית, חייבים להתבצע תחת נורית בטיחות.
2. טעינה לדוגמה והרכבת מכשירים
- השתמש בפיפטה כדי לערבב ביסודיות את תמיסת החלבון ואת חיץ ההתגבשות על פרוסת הקוורץ הראשונה. יחס הנפח בין דגימת החלבון למאגר נע בדרך כלל בין 2:1 ל-1:2 (איור 1F). ודא שהנפח הכולל של תמיסת ההתגבשות אינו עולה על הקיבולת המרבית של תא ההתגבשות שנקבע על ידי גודל ועובי השיים. יש להימנע מבועות אוויר במהלך הערבוב.
הערה: ההרכב של מאגר התגבשות משתנה מניסוי אחד למשנהו. עיין בטבלה 1 לתנאי התגבשות. - הניחו את פרוסת הקוורץ השנייה מעל התמיסה המעורבת כשהתמיסה מתחילה להתפשט (איור 1G). פרוסת קוורץ שנייה זו משמשת כחלון היציאה של קרני הרנטגן המפוזרות.
- טפחו קלות על פרוסת הקוורץ השנייה על הקצה כדי לסייע בפיזור השמן תוך דחיפת האוויר החוצה. אבטחו את המכשיר על-ידי הברגת טבעת תמך לתוך הטבעת החיצונית (איור 1H). השתמשו בכלי הידוק במידת הצורך (איור 1I). שימו לב שהידוק יתר עלול לגרום לפרוסות קוורץ עדינות להתעוות או אפילו להיסדק.
3. אופטימיזציה של אחסון והתגבשות המכשיר
- אחסנו את המכשירים שהורכבו (איור 1J) בקופסה בטמפרטורת החדר או בתוך אינקובטור עם בקרת טמפרטורה.
הערה: גבישי חלבון עשויים להופיע תוך מספר שעות עד ימים לאחר הרכבת מכשיר ההתגבשות. תוצאות אופייניות של התגבשות על השבב מוצגות עבור מספר דגימות חלבון מייצגות (איור 2). - עקוב אחר צמיחת הגביש על ידי התבוננות בהתקן ההתגבשות תחת מיקרוסקופ. במידת הצורך, מטב את תנאי ההתגבשות על ידי איטרציות של סעיפים 1-3.
4. כיול
הערה: התוכניות והפקודות המוזכרות בסעיפים שלהלן מופעלות בתוכנת inSituX.
- התקינו גביש דק של גארנט אלומיניום מסומם של איטריום על מחזיק השבב (איור 3). התקן את תחנת הקורה. צלם תמונות פלואורסצנטיות של קרני רנטגן של הקרן הישירה על ידי הפעלת התוכנית:
burnmark.py <מכשיר>.param
כאשר <התקן> הוא שם שנבחר על-ידי המשתמש עבור התקן ההתגבשות..param הוא שם קובץ המכיל פרמטרי בקרה ספציפיים להתקן. ערכי ברירת המחדל יוחלפו בהדרגה בערכים ספציפיים לאורך הפרוטוקול. קובץ.param לדוגמה מוצג בקובץ משלים 1. - מצא את המיקום המדויק של קרן הרנטגן הישירה על ידי הפעלת תוכנית התאמת פרופיל הקרן:
beam.py <צריבת תמונה> -d <התקן>
כאשר <תמונת צריבה> הוא שם הקובץ של תמונת הפלואורסצנציה של קרני הרנטגן (איור 4).
הערה: תוכנית זו מחשבת את מיקומי הקרן הישירים המדויקים וכן את גודל הקרן. מיקום הקרן מסמן את יעד הטרנסלוקציה של כל הגבישים מאותו מכשיר. גודל הקרן משמש גם לתכנון המטרה.
5. סריקה אופטית
- הנח התקן התגבשות במחזיק השבב ואבטח את המכשיר באמצעות אגודל (איור 3A).
- הרכיבו את מחזיק השבב על שלב התרגום של הדיפרקטומטר דרך מנגנון קינמטי (איור 3B).
- התקן מקור אור מתאים ללקיחת מיקרוגרפים מהחלון האופטי של המכשיר. ניתן להשתמש באור לבן, באור IR או באור אחר לפי בחירה, בהתאם לרגישות לאור של דגימת החלבון, כמו גם למטרת הניסוי.
- הפעל את תוכנית הסריקה:
scan.py <מכשיר>.param
תוכנית זו לוכדת קבוצה של מיקרוגרפים המועברים באופן אוטומטי למחשבי משתמש שצוינו. - הפעל את תוכנית הריצוף במחשב משתמש:
tile.py <מכשיר> -x-y
כאשר < x > ו-
הערה: שלבים 5.4 ו-5.5 נמשכים בדרך כלל מספר דקות. המספר הכולל של מיקרוגרפים נע בין כמה עשרות למאות בהתאם לאזור הסריקה וההגדלה. - הפעל את התוכנית למציאת קריסטלים:
findX.py <מונטאז'> -c <אורך> <רוחב> -w <טריז> -x <גודל קרן>
כאשר <מונטאז'> היא התמונה המרוצפת. תוכנית זו מבצעת זיהוי קריסטל ותכנון ירי. <אורך> ורוחב <> מציינים את גודל הגביש שנמצא. אם המשתמש מעוניין להימנע מגבישים קטנים יותר, <רוחב> יכול לשמש כחתך על ידי הגדרת מספר גדול יותר מהגדלים של גבישים קטנים לא רצויים. <טריז> הוא ערך זוויתי הקובע את העמידות לגבישים בעלי צורה לא סדירה. <גודל קרן> מתייחס לגודל הקרן הישיר המתקבל מהתאמת הפרופיל לעיל (שלב 4.2; איור 4). כמו כן, משתמשים יכולים להגדיר ערך נומינלי כדי להרחיק עוד יותר את הצילומים הממוקדים. פרמטרים מרכזיים אלה מאפשרים בחירת גביש ספציפי ותכנון מטרה (איור 6).
6. עקיפת רנטגן
- הסר את מקור האור והתקן את תחנת האלומה. קבעו מרחק גלאי מתאים. עקוב אחר פרוטוקול הבטיחות של קו הקרן כדי לחפש בצריף הרנטגן. פתח את תריס הרנטגן ואת תריס הלייזר אם רלוונטי.
- הפעל את תוכנית איסוף הנתונים עבור עקיפה טורית:
collect.py <התקן>.param -l <משך אור>
פקודה זו מפעילה איסוף נתונים שבו כל הצילומים המתוכננים מבקרים בזה אחר זה על פי רצף מתוכנת מראש. כל גביש ממוקד עובר טרנסלוקציה למיקום הקרן (שלב 4.2). בכל תחנה מתבצעת חשיפת רנטגן עם או בלי תאורת לייזר בהשהיה מתוזמנת בזמן. סרט 1 מציג רצף איסוף נתונים אוטומטי המופעל בתדר של 1 הרץ. באופן שגרתי עשרות עד מאות תמונות עקיפה נאספות מהתקן התגבשות יחיד (סרט 2).
הערה: כיול סעיף 4 וסריקה אופטית של סעיף 5 הם עצמאיים בפלטפורמת inSituX, ולכן ניתנים להעברה לחלוטין לקו קרן אחר. סעיף 6 עקיפת קרני רנטגן צריך לכלול פרטים מסוימים בפעולת קו הקרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מספר מערכי נתונים מייצגים פורסמו בשנים האחרונות 10,12 יחד עם התוצאות הקריסטלוגרפיות והממצאים המדעיים ממגוון רחב של דגימות חלבונים, כולל חלבונים ואנזימים פוטורצפטורים, לדוגמה, פוטורצפטור UV-B פוטורצפטור צמחי UVR8, תיקון DNA מונע אור פוטוליאז PhrB10, חלבון חישת אור אדום רחוק חדשני מהיסטידין קינאז חושי רב-תחומי 14 תחומי ליגנד/אור עם חיישן כפול, ומודול הליבה הפוטו-חושית של בקטריופיטוכרום12., כתוצאות מייצגות, אנו מפרטים את תנאי ההתגבשות על השבב של חלבונים אלה בטבלה 1, ומשווים אותם ישירות לתנאים המשמשים לשיטת דיפוזיית האדים. כאן אנו מראים ארבעה מקרי בוחן נוספים של התגבשות על שבב (איור 2) ואוסף של תבניות עקיפה באתרן בסרט (סרט 2). מערכי נתונים מייצגים באתרם שנאספו באמצעות פרוטוקול זה מסוכמים בטבלה 2.
במקרה מייצג, קריוקריסטלוגרפיה הולידה עקיפה לקויה עבור חלבון פוטורצפטור עם חישת אור אדום רחוק ככל הנראה בשל רגישות לאור ותכולת ממס גבוהה (~80%) של גבישים אלה14. צפיפויות האלקטרונים שהתקבלו מנתוני הקריוקריסטלוגרפיה היו מרוחות מכדי לפתור את קונפורמציית הכרומופור, העומדת במרכז השאלה המדעית שלנו. באמצעות פרוטוקול in situ, הצלחנו להימנע מהפעלת אור לא מכוונת לפני עקיפה וקיבלנו מערך נתונים כהה בטמפרטורת החדר מיותר מ-800 גבישים. מערך הנתונים הכהה הזה מ-in situ serial Laue diffraction הביא לפתרון טוב יותר של צפיפות אלקטרונים, מה שאפשר בניית מודל בטוח של כרומופור בילין שמציג קונפורמציה של all-Z,syn (איור 7A)12,14. ניסויי הקריסטלוגרפיה הדינמיים שלנו חשפו עוד יותר שינויים הנגרמים על-ידי אור בחלבון הפוטורצפטור האדום-רחוק הזה על-ידי השוואת נתונים מ-4,352 גבישים בחושך ו-8,287 גבישים לאחר הארת האור (איור 7). ניתוח ראשוני של מפות ההפרש המושרה על ידי האור חשף תנועות מרוכזות בגיליון β המרכזי, מה שמרמז על החשיבות של ערימת π-π בין טבעות הפירול של הכרומופור לבין מספר שאריות ארומטיות (איור 7B,C). ניתוח מעמיק וממצאים מדעיים יוצגו במקום אחר.
איור 1: מכלול התקן התגבשות. על פי הערכות, כל הרכבה עולה $30 עם שני פרוסות קוורץ מונוקריסטליניות או $10 עם שני כיסויי זכוכית. רכיבי חומרה מלבד ה-shim ניתנים לשימוש חוזר. (A) הצד השטוח של הטבעת החיצונית מסומן למטרות זיהוי. (B) הטבעת החיצונית מונחת במהופך על משטח נקי. (C) פרוסת קוורץ בקוטר 1 אינץ 'ממוקמת בזהירות בפנים. שבב זכוכית יכול לשמש גם במהלך ניסויי התגבשות, אך אינו תואם לעקיפוף קרני רנטגן. (D) שני צידי ה-shim משומן. (E) השים המשומן מונח על שבב הקוורץ הראשון. (F) תמיסות חלבון והתגבשות מצינורות למרכז השבב ומעורבבים. (G) שבב קוורץ או זכוכית שני מכסה את הטיפה כך שהיא מתפשטת באופן שווה על השבב. (H) טבעת תמך מוברגת מעל פרוסת הקוורץ השנייה. (I) כלי הידוק משמש להידוק עדין של טבעת הריטיינר. (י) מכשיר שהורכב במלואו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: גבישי חלבון מייצגים הגדלים במכשירי קוורץ. (A) מודול הליבה הפוטו-חושית של בקטריופיטוכרום (Pa497 בטבלה 1). (ב,ג) מבנים שונים של תחום GAF השלישי מתוך היסטידין קינאז חושי רב-תחומי (2551g3 ו- 2551g3Δα1 בטבלה 1). (D) התחומים החושיים הטנדם מתוך היסטידין קינאז בעל חיישן כפול (RECGAF בטבלה 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: דיפרקטומטר inSituX . (A) התקן התגבשות מותקן במחזיק השבב. למרות שהמכשיר מותקן אנכית, גבישים שגדלו על שבב לא הולכים ליפול, בעיקר משום שהשכבה הנוזלית במכשיר שהורכב דקה מאוד, וגבישים מעוגנים לגרעינים שלהם בעת הגידול. (B) מקור אור IR מותקן עבור הסריקה האופטית. המצלמה לוכדת את התצוגה המוטבעת של גבישי החלבון לאורך קרן הרנטגן דרך מראת מנסרה (שאינה נראית בתמונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: התאמת פרופיל קרן ישירה. הערוצים האדומים, הירוקים והכחולים של תמונת הרנטגן הפלואורסצנטית משמשים כדי להתאים לפונקציה דו-ממדית של גאוס. העמודה הימנית מציגה את התמונה הגולמית של הערוצים אדום, ירוק וכחול. העמודה האמצעית היא התוצאה המתאימה עם מיקום וגודל הקרן המדויקים. העמודה הימנית מציגה את השאריות המתאימות. אם המשרעת של שאריות ההתאמה משתרעת על פני חלק קטן מהתמונה הגולמית, התאמת הפרופיל של הקרן הישירה מוצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: אריחי תמונה . (A) מערך של מיקרוגרפים גבישיים נלכד במהלך סריקה אופטית. הסריקה האופטית והעברת הנתונים אורכות בדרך כלל 1-2 דקות. מיקרוגרפים סמוכים חולקים רצועה של אזור חופף, אופקית ואנכית, כפי שמסומן בתיבות צהובות. (B) מיקרוגרפים תפורים יחד כדי ליצור מונטאז' ברזולוציה גבוהה המבוסס על המתאם האופטימלי באזורים החופפים. תהליך זה אורך בדרך כלל דקה במחשב נייד. התיבה הצהובה מתארת את השטח שנלכד על-ידי 2 x 2 מיקרוגרפים המוצגים ב-(A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: זיהוי גבישי ותכנון יריות. כל עיגול ורוד מסמן את הצילום הראשוני של גביש. העיגולים הצהובים מסמנים צילומים נוספים אם גביש ארוך מספיק כדי למקם את הצילומים האלה. הקווים הוורודים מסמנים מסלול כפתרון לבעיית המוכר הנוסע. גבישים מקובצים באשכולות וגבישים קטנים יותר נמנעים במידה רבה. ניתן להתאים את האגרסיביות של מציאת גבישים כאופציה findX.py (שלב 5.6). אסטרטגיית "אוברקיל" של כוח הזרוע לא תשאיר שום קריסטל ללא צילום, אלא תוכל לייצר הרבה תמונות עקיפה, אך לא ניתנות לעיבוד12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: מפות צפיפות אלקטרונים של תחום חישת האור האדום הרחוק של היסטידין קינאז . (A) מפת 2Fo-Fc המתוארת ב-2.5σ מראה את צפיפות האלקטרונים הקשורה לכרומופור הבילין בקונפורמציה all-Z,syn 14. טבעות פירול A עד D מסומנות. (B ו-C) מפות הפרש בהיר-כהה עם קווי מתאר של ±2.5σ בירוק ובאדום, בהתאמה, מדגישות את הרווח וההפסד של צפיפות האלקטרונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: השוואת תנאי התגבשות בין דיפוזיית אדים לשיטת אצווה על השבב. שיטות דיפוזיה של אדים ואצווה של התגבשות מתואמות מאוד 10,14,15,16,17,18,19. החל ממצב דיפוזיה של אדים, ניתן לייעל מצב דומה להתגבשות על השבב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: סיכום של מערכי נתונים באתרם שנאספו ישירות ממכשירי קוורץ. ניתן לאסוף אלפי תבניות עקיפה של Laue ממספר מכשירי התגבשות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
סרט 1: אוסף נתונים מדומה. גבישים ממוקדים עוברים טרנסלוקציה לקרן הרנטגן כפי שמסומנים בעיגול אדום. רצף הגבישים הממוקדים בסרט זה אינו עוקב אחר פתרון לבעיית איש המכירות הנוסע. חשיפות לייזר ורנטגן נורות בכל תחנה עם השהיה מתוכנתת. תמונות עקיפה נאספות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 2: תמונות עקיפה. ניתן לאסוף מאות תמונות עקיפה מהתקן התגבשות יחיד. מספר התקנים מספיקים כדי לייצר מערך נתונים שלם ומיותר ביותר (טבלה 2). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
קובץ משלים 1: קובץ <מכשיר>.param לדוגמה. קובץ טקסט קטן אוסף כמה פרמטרי בקרה ספציפיים לכל התקן התגבשות. פרמטרים אלה מתחילים בערכי ברירת המחדל שלהם וישתנו בהתאם בסעיפים 4, 5 ו-6 עם התקדמות הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קריסטלוגרפיה של חלבונים בשנים הראשונות שבוצעה בטמפרטורת החדר חוותה קושי עצום במאבק בנזקי קרינת רנטגן. לפיכך, הוא הוחלף על ידי שיטת קריוקריסטלוגרפיה חזקה יותר כאשר מקורות רנטגן סינכרוטרון הפכו זמינים20. עם הופעתם של לייזרים נטולי אלקטרונים בקרני רנטגן, קריסטלוגרפיה של חלבונים בטמפרטורת החדר קמה לתחייה בשנים האחרונות, עם התפתחויות חדשות רבות המונעות על ידי הרצון לצפות בדינמיקה המבנית של חלבונים בטמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית 2,21. הפיתוח של פלטפורמת inSituX המבוססת על התקני גביש על גבישים הונע על ידי אותה שאיפה, כלומר, לבסס שיטות איסוף נתונים שגרתיות וחזקות למחקרי קריסטלוגרפיה דינמיים בטמפרטורת החדר. שיטת עקיפת קרני רנטגן סדרתית אוטומטית זו ישימה גם לקביעת מבנה סטטי עבור גבישי חלבון שאינם ניתנים להקפאה14. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיקולים טכניים מרכזיים יחד עם שלבים קריטיים הדרושים כדי לספק איסוף נתונים בטמפרטורת החדר באמצעות פלטפורמה זו. שיטה זו מתאימה במיוחד לגבישי חלבון שבירים הרגישים לטיפול מכני, לנזקי קרינת רנטגן או לחשיפה לאוויר.
אב הטיפוס של הפלטפורמה נבדק בהרחבה בשני קווי קרן קריסטלוגרפיה של חלבונים במקור הפוטונים המתקדם (APS) של המעבדה הלאומית ארגון. למרות שזה די פשוט להגדיר התגבשות על שבב על פי פרוטוקול זה, שלב איסוף הנתונים כולל מספר רכיבי חומרה ותוכנה בהתאמה אישית. כתוצאה מכך, היישום והיישום של אסטרטגיות איסוף נתונים ספציפיות לפרויקט עשויים לדרוש שיתוף פעולה הדוק בין משתמשים לבין מדעני beamline. במילים אחרות, טכנולוגיה זו בצורתה הנוכחית מוגבלת לאותם משתמשים שיש להם גישה נאותה לסינכרונים כגון APS. עם זאת, זרימת העבודה הכוללת והשלבים המרכזיים המתוארים בפרוטוקול זה ישמשו כהפניה או מדריך לכל קבוצת מחקר המעוניינת בקריסטלוגרפיה של חלבונים בטמפרטורת החדר.
היתרון המשמעותי ביותר של פלטפורמה זו הוא שלא נדרשת מניפולציה גבישית כגון הרכבה או הקפאה כך שגבישי חלבון עדינים מתפזרים בתנאים בתוליים. יתרון משמעותי נוסף הוא שהשימוש במצע קוורץ מונוקריסטליני מוליד מעט מאוד פיזור רקע לתמונות עקיפה של חלבונים תוך שהוא מציע סביבות יציבות להתגבשות חלבונים לאורך זמן (שבועות עד חודשים). עם זאת, פלטפורמה זו אינה מתאימה לסינון גביש מטריצה דלילה מכיוון שהיא מיועדת לייצור גבישים בקנה מידה גדול. לפיכך, נדרש ידע מוקדם בתנאי התגבשות כדי לקבוע ניסויי התגבשות ראשוניים על השבב עבור דגימת חלבון נתונה.
בפועל, אנו מוצאים כי חלק משלבי הרכבת המכשיר, כגון כיצד לשמן שים (שלב 1.2) וכיצד לאטום מכשיר (שלב 2.3), טריוויאליים ככל שהם נראים, משפיעים לעתים קרובות ישירות על תוצאות ההתגבשות. מכשיר עלול להתייבש במהירות אם השמן לא נעשה כראוי. בנוסף, הידוק יתר של המכשיר בשלב האחרון של ההרכבה עלול לעוות את פרוסות הקוורץ, בעוד הידוק חסר מוביל לדליפות פוטנציאליות ו/או אידוי בלתי מבוקר מהמכשיר. שלב קריטי נוסף הוא תכנון צילומי רנטגן. יש להתמודד בזהירות עם גבישים מקובצים באשכולות או צפופים כדי להימנע מדפוסי עקיפה חופפים שלעתים קרובות קשה לעבד. ניתן להקל על בעיה זו על ידי שימוש בקרן רנטגן מיקרו-ממוקדת. באופן פוטנציאלי, מערך נתונים שלם עשוי להיות קשה להשגה אם המורפולוגיה של הגביש היא צלחת דקה גדולה כך שרוב הלוחות מקבילים לחלונות הקוורץ. בנוסף, ניתן למחזר את שבבי הקוורץ החד-גבישיים ולעשות בהם שימוש חוזר לאחר הליך ניקוי הכולל סבון וממיסים אורגניים המסירים פסולת שמן וחלבון. בדרך כלל, כ 80-90% של שבבים עדינים אלה ניתן לנקות ללא נזק עבור הניסויים הבאים. במקרה של גבישים קטנים על קו קרן מיקרו-ממוקד, כאשר יש להשיג דיוק טוב יותר במיקום גבישי, ניתן לשדרג מספר רכיבי חומרה, כגון מנועים עדינים יותר, מצלמה ואופטיקה טובות יותר, הגדלה גדולה יותר וכו '. עם זאת, אף אחד מאלה אינו קרוב למגבלות המתקדמות ביותר. לכן, הרבה מקום זמין לשיפור ללא קושי רב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZR היא הממציאה של שבבי קריסטל-על-גביש על 9632042 הפטנט האמריקאי שהוענק לחברת Renz Research, Inc.
Acknowledgments
השימוש במקור פוטונים מתקדם, מתקן משתמש של משרד המדע שהופעל עבור משרד האנרגיה האמריקאי על ידי המעבדה הלאומית ארגון, נתמך על ידי חוזה DE-AC02-06CH11357. השימוש ב- BioCARS נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מענק מספר R24GM111072. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. השימוש ב- LS-CAT Sector 21 נתמך על ידי תאגיד הפיתוח הכלכלי של מישיגן ומענק המסדרון המשולש הטכנולוגי של מישיגן 085P1000817. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, המכונים הלאומיים לבריאות (R01EY024363) והקרן הלאומית למדע (MCB 2017274) ל- XY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).
- Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).
- Nogales, E., Scheres, S. H. W. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).
- Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. Diffraction before destruction. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313 (2014).
- Kisselman, G., et al. X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).
- Liang, M., et al. Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).
- Perry, S. L., et al. In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device. Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).
- Ren, Z., et al. Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature. Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).
- Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).
- Ren, Z., et al. An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature. IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).
- Croes, G. A. A method for solving traveling salesman problems. Operations Research. 6, 791-812 (1958).
- Bandara, S., et al. Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118 (2021).
- Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).
- Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome. Nature. 479, 428-432 (2011).
- Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).
- Zeng, X., et al. Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8. Nature Plants. 1, 14006 (2015).
- Wang, M., et al. Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex. Biochemistry. 50, 581-590 (2011).
- Rodgrs, D. W. Cryocrystallography. Structure. 2, 1135-1140 (1994).
- Zhao, F. -Z., et al. A guide to sample delivery systems for serial crystallography. TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).
