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Biochemistry

कमरे के तापमान पर ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण और बड़े पैमाने पर सीरियल विवर्तन

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63022
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago, 2Department of Ophthalmology and Vision Sciences, University of Illinois at Chicago, 3Renz Research, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

यह योगदान बताता है कि क्रिस्टल-ऑन-क्रिस्टल उपकरणों पर प्रोटीन क्रिस्टलीकरण कैसे स्थापित किया जाए और ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण मंच का उपयोग करके कमरे के तापमान पर स्वचालित सीरियल डेटा संग्रह कैसे किया जाए।

Abstract

जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं और जैविक प्रक्रियाओं को यह प्रदर्शित करके सबसे अच्छा समझा जा सकता है कि प्रोटीन अपने कार्यात्मक राज्यों के बीच कैसे संक्रमण करते हैं। चूंकि क्रायोजेनिक तापमान गैर-शारीरिक हैं और प्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता को रोक सकते हैं, रोक सकते हैं, या यहां तक कि बदल सकते हैं, कमरे के तापमान पर नियमित एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए एक मजबूत विधि अत्यधिक वांछनीय है। क्रिस्टल-ऑन-क्रिस्टल डिवाइस और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर को किसी भी नमूना हेरफेर के बिना विभिन्न आकारों के प्रोटीन क्रिस्टल के लिए कमरे के तापमान पर सीटू एक्स-रे विवर्तन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यहां हम डिवाइस असेंबली, ऑन-चिप क्रिस्टलाइजेशन, ऑप्टिकल स्कैनिंग, क्रिस्टल रिकग्निशन से लेकर एक्स-रे शॉट प्लानिंग और स्वचालित डेटा संग्रह तक प्रमुख चरणों के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। चूंकि इस प्लेटफ़ॉर्म को क्रिस्टल कटाई और न ही किसी अन्य नमूना हेरफेर की आवश्यकता होती है, चिप पर उगाए गए सैकड़ों से हजारों प्रोटीन क्रिस्टल को प्रोग्राम करने योग्य और उच्च-थ्रूपुट तरीके से एक्स-रे बीम में पेश किया जा सकता है।

Introduction

एक्स-रे विकिरण के आयनीकरण प्रभावों के कारण, प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी, काफी हद तक, पिछले तीन दशकों में क्रायोजेनिक स्थितियों तक सीमित हो गई है। इसलिए, इसके कार्य के दौरान प्रोटीन गतियों का वर्तमान ज्ञान काफी हद तक क्रायोजेनिक परिस्थितियों के तहत विभिन्न राज्यों में देखी गई स्थिर संरचनाओं के बीच तुलना से उत्पन्न होता है। हालांकि, क्रायोजेनिक तापमान अनिवार्य रूप से विभिन्न संवहन अवस्थाओं के बीच जैव रासायनिक प्रतिक्रिया या अंतर-रूपांतरण की प्रगति में बाधा डालता है, जबकि प्रोटीन अणु काम पर होते हैं। क्रिस्टलोग्राफी द्वारा परमाणु संकल्प पर प्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता का सीधे निरीक्षण करने के लिए, कमरे के तापमान पर विवर्तन प्रयोगों के संचालन के लिए मजबूत और नियमित तरीकों की आवश्यकता होती है, जो नमूना वितरण, डेटा संग्रह और पश्चवर्ती डेटा विश्लेषण में तकनीकी नवाचारों की मांग करता है। इसके लिए, सीरियल क्रिस्टलोग्राफी में हालिया प्रगति ने कमरे के तापमान 1,2,3 पर मध्यवर्ती और अल्पकालिक संरचनात्मक प्रजातियों की आणविक छवियों को पकड़ने के लिए नए रास्ते पेश किए हैं। पारंपरिक क्रायोक्रिस्टलोग्राफी में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली "एक-क्रिस्टल-एक-डेटासेट" रणनीति के विपरीत, सीरियल क्रिस्टलोग्राफी एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के समान डेटा संग्रह रणनीति को अपनाती है। विशेष रूप से, सीरियल क्रिस्टलोग्राफी में प्रयोगात्मक डेटा बड़ी संख्या में व्यक्तिगत नमूनों से छोटे अंशों में एकत्र किया जाता है, इसके बाद गहन डेटा प्रोसेसिंग होती है जिसमें डेटा अंशों का मूल्यांकन किया जाता है और 3 डी संरचना निर्धारण4 के लिए एक पूर्ण डेटासेट में जोड़ा जाता है। यह "वन-क्रिस्टल-वन-शॉट" रणनीति प्रभावी रूप से विनाश रणनीति से पहले विवर्तन के माध्यम से कमरे के तापमान पर प्रोटीन क्रिस्टल को एक्स-रे विकिरण क्षति को कम करतीहै।

चूंकि सीरियल क्रिस्टलोग्राफी को डेटासेट को पूरा करने के लिए बड़ी संख्या में प्रोटीन क्रिस्टल की आवश्यकता होती है, इसलिए यह कई जैविक प्रणालियों के लिए प्रमुख तकनीकी चुनौतियां पैदा करता है जहां प्रोटीन के नमूने सीमित होते हैं और / या नाजुक क्रिस्टल हैंडलिंग शामिल होती है। एक और महत्वपूर्ण विचार यह है कि सीरियल विवर्तन प्रयोगों में क्रिस्टल अखंडता को सर्वोत्तम रूप से कैसे संरक्षित किया जाए। सीटू विवर्तन विधियां प्रोटीन क्रिस्टल को सीधे अलग करने की अनुमति देकर इन चिंताओं को संबोधित करती हैं जहां वे क्रिस्टलीकरण कक्ष 6,7,8,9 की सील को तोड़ने के बिना बढ़ते हैं। ये हैंडलिंग-मुक्त विधियां स्वाभाविक रूप से बड़े पैमाने पर सीरियल विवर्तन के साथ संगत हैं। हमने हाल ही में क्रिस्टल-ऑन-क्रिस्टल अवधारणा के आधार पर सीटू विवर्तन के लिए एक क्रिस्टलीकरण उपकरण के डिजाइन और कार्यान्वयन की सूचना दी है - मोनोक्रिस्टलाइन क्वार्ट्ज11 पर सीधे उगाए जाने वाले प्रोटीन क्रिस्टल। यह "क्रिस्टल-ऑन-क्रिस्टल" डिवाइस कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, इसमें मोनोक्रिस्टलाइन क्वार्ट्ज सब्सट्रेट से बना एक्स-रे और प्रकाश पारदर्शी खिड़की है, जो थोड़ा पृष्ठभूमि प्रकीर्णन पैदा करता है, इसलिए इसके परिणामस्वरूप प्रोटीन क्रिस्टल से विवर्तन छवियों में उत्कृष्ट सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है। दूसरा, एकल-क्रिस्टल क्वार्ट्ज ग्लास के बराबर एक उत्कृष्ट वाष्प बाधा है, जिससे प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए एक स्थिर वातावरण प्रदान किया जाता है। इसके विपरीत, बहुलक-आधारित सब्सट्रेट्स का उपयोग करने वाले अन्य क्रिस्टलीकरण उपकरण वाष्प पारगम्यता के कारण सूखने के लिए प्रवण होते हैं जब तक कि बहुलक सामग्री में पर्याप्त मोटाई न हो, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि प्रकीर्णन10 में योगदान होता है। तीसरा, यह उपकरण क्रिस्टल हेरफेर या कटाई के किसी भी रूप के बिना एक्स-रे बीम में बड़ी संख्या में प्रोटीन क्रिस्टल के वितरण को सक्षम बनाता है, जो क्रिस्टल अखंडताको संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

क्रिस्टल-ऑन-क्रिस्टल उपकरणों का उपयोग करके सीरियल एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों को सुव्यवस्थित करने के लिए, हमने ऑप्टिकल स्कैनिंग और एक्स-रे विवर्तन मोड12 के बीच आसान स्विचिंग की सुविधा के लिए एक डिफ्रेक्टोमीटर प्रोटोटाइप विकसित किया है। इस डिफ्रेक्टोमीटर का एक छोटा पदचिह्न है और इसका उपयोग आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी में उन्नत फोटॉन स्रोत (एपीएस) की दो बीमलाइनों पर सीरियल डेटा संग्रह के लिए किया गया है। विशेष रूप से, हमने लाउ विवर्तन के लिए बायोकार्स 14-आईडी-बी और मोनोक्रोमैटिक दोलन के लिए एलएस-कैट 21-आईडी-डी का उपयोग किया। इस डिफ्रेक्टोमीटर हार्डवेयर की आवश्यकता नहीं है यदि सिंक्रोट्रॉन या एक्स-रे फ्री-इलेक्ट्रॉन लेजर बीमलाइन दो प्रमुख क्षमताओं से लैस है: (1) सभी दिशाओं में एक्स-रे बीम के चारों ओर ±12 मिमी की यात्रा सीमा के साथ मोटरचालित नमूना स्थिति; और (2) हल्की रोशनी के तहत क्रिस्टल देखने के लिए एक ऑन-एक्सिस डिजिटल कैमरा जो अध्ययन के तहत प्रोटीन क्रिस्टल के लिए सुरक्षित है। मोनोक्रिस्टलाइन क्वार्ट्ज डिवाइस एक पोर्टेबल डिफ्रेक्टोमीटर और ऑप्टिकल स्कैनिंग, क्रिस्टल मान्यता और स्वचालित सीटू डेटा संग्रह के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ मिलकर सामूहिक रूप से सीरियल क्रिस्टलोग्राफी के लिए इनसीटूएक्स प्लेटफॉर्म का गठन करता है। यद्यपि यह विकास मुख्य रूप से पॉलीक्रोमैटिक एक्स-रे स्रोत का उपयोग करके इसके गतिशील क्रिस्टलोग्राफी अनुप्रयोगों से प्रेरित है, हमने मोनोक्रोमैटिक दोलन विधियों10,12 का समर्थन करने के लिए इस तकनीक की क्षमता का प्रदर्शन किया है। स्वचालन के साथ, यह मंच सस्ती प्रोटीन खपत के साथ कमरे के तापमान पर एक उच्च-थ्रूपुट सीरियल डेटा संग्रह विधि प्रदान करता है।

इस योगदान में, हम विस्तार से वर्णन करते हैं कि गीली प्रयोगशाला में ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण कैसे स्थापित किया जाए और इनसीटूएक्स प्लेटफॉर्म का उपयोग करके सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन पर सीरियल एक्स-रे डेटा संग्रह कैसे किया जाए।

बैच विधि का उपयोग एक ही प्रोटीन नमूने के लिए प्राप्त वाष्प प्रसार विधि के समान स्थिति के तहत ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण स्थापित करने के लिए किया जाता है (तालिका 1)। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, हम वाष्प प्रसार विधि के लिए 1.2-1.5x सांद्रता पर प्रीसिपेटेंट का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यदि आवश्यक हो, तो बैच क्रिस्टलीकरण की स्थिति को ठीक ग्रिड स्क्रीनिंग के माध्यम से और अनुकूलित किया जा सकता है। अनुकूलन परीक्षणों के लिए क्वार्ट्ज वेफर्स आवश्यक नहीं हैं; इसके बजाय ग्लास कवरलिप का उपयोग किया जा सकता है (नीचे देखें)। छोटे पैमाने पर अनुकूलन परीक्षणों को रखने के लिए आंशिक रूप से लोड किए गए क्रिस्टलीकरण उपकरणों की सिफारिश की जाती है। बैच विधि10 (तालिका 1) का उपयोग करके ऐसे उपकरणों पर कई प्रोटीन नमूनों को सफलतापूर्वक क्रिस्टलीकृत किया गया है।

डिवाइस में निम्नलिखित भाग होते हैं: 1) एक बाहरी अंगूठी; 2) दो क्वार्ट्ज वेफर्स; 3) प्लास्टिक या स्टेनलेस स्टील का एक वॉशर जैसा शीम; 4) एक रिटेनिंग रिंग; 5) सीलेंट के रूप में माइक्रोस्कोप विसर्जन तेल (चित्रा 1)। एक चिप पर लोड किए गए क्रिस्टलीकरण समाधान की कुल मात्रा प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करती है। क्रिस्टलीकरण कक्ष की क्षमता को विभिन्न मोटाई और / या आंतरिक व्यास के शिम को चुनकर समायोजित किया जा सकता है। हम नियमित रूप से मोटाई में 50-100 μm के शिम्स का उपयोग करके क्षमता में 10-20 μL के क्रिस्टलीकरण उपकरण स्थापित करते हैं। एक विशिष्ट डिवाइस सीरियल डेटा संग्रह के लिए पर्याप्त हजारों प्रोटीन क्रिस्टल का उत्पादन कर सकता है (चित्रा 2)।

सफल होने पर, ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण एक्स-रे विवर्तन के लिए तैयार प्रत्येक क्वार्ट्ज डिवाइस पर दसियों से सैकड़ों या हजारों प्रोटीन क्रिस्टल का उत्पादन करेगा। सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन पर, इस तरह के उपकरण को एक किनेमेटिक तंत्र का उपयोग करके डिफ्रेक्टोमीटर के तीन-अक्ष अनुवाद चरण पर रखा जाता है। एक माउंटेड डिवाइस की क्रिस्टलीकरण विंडो को ऑप्टिकल रूप से स्कैन किया जाता है और दसियों से सैकड़ों माइक्रोग्राफ में चित्रित किया जाता है। इन माइक्रोग्राफ को फिर एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मोंटेज में सिला जाता है। फोटोसेंसिटिव क्रिस्टल के लिए, अनपेक्षित फोटोएक्टिवेशन से बचने के लिए इन्फ्रारेड (आईआर) प्रकाश के तहत ऑप्टिकल स्कैनिंग की जा सकती है। डिवाइस पर यादृच्छिक रूप से वितरित प्रोटीन क्रिस्टल की पहचान और पता लगाने के लिए एक कंप्यूटर दृष्टि सॉफ्टवेयर विकसित किया गया है। इन क्रिस्टल को तब सीरियल क्रिस्टलोग्राफी में डेटा संग्रह रणनीति को सूचित करने या मार्गदर्शन करने के लिए उनके आकार, आकार और स्थिति के अनुसार रैंक किया जाता है। उदाहरण के लिए, एकल या एकाधिक शॉट्स प्रत्येक लक्षित क्रिस्टल पर स्थित हो सकते हैं। उपयोगकर्ता लक्षित क्रिस्टल के माध्यम से एकल पास या कई मार्गों की योजना बना सकते हैं। हमने विभिन्न यात्रा मार्गों की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर लागू किया है। उदाहरण के लिए, सबसे छोटे मार्ग की गणना एल्गोरिदम का उपयोग करके की जाती है जो यात्रा विक्रेता समस्या13 को संबोधित करती है। पंप-प्रोब गतिशील क्रिस्टलोग्राफिक अनुप्रयोगों के लिए, लेजर (पंप) और एक्स-रे (प्रोब) शॉट्स का समय और अवधि चुनी जा सकती है। प्रत्येक लक्षित क्रिस्टल को एक के बाद एक एक्स-रे बीम में स्थानांतरित करने के लिए एक स्वचालित सीरियल डेटा संग्रह प्रोग्राम किया जाता है।

इनसीटूएक्स डिफ्रेक्टोमीटर के प्रमुख घटकों में शामिल हैं: 1) एक डिवाइस धारक; 2) एक तीन-अक्ष अनुवाद चरण; 3) ऑप्टिकल स्कैनिंग के लिए एक प्रकाश स्रोत; 4) एक एक्स-रे बीम स्टॉप; 5) यदि प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन का अध्ययन किया जाता है तो पंप लेजर; 6) रास्पबेरी पाई माइक्रो कंप्यूटर एक आईआर-संवेदनशील कैमरे से लैस; 7) मोटर्स, कैमरा, प्रकाश स्रोतों, पंप लेजर को सिंक्रनाइज़ करने और बीमलाइन नियंत्रणों के साथ इंटरफ़ेस करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर।

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Protocol

1. डिवाइस प्री-असेंबली

  1. नमूना पहचान के लिए बाहरी रिंग (30 मिमी व्यास) को लेबल करें। यदि आवश्यक हो, तो परियोजना का नाम, डिवाइस नंबर, क्रिस्टलीकरण स्थिति और तिथि (चित्रा 1 ए) शामिल करें। बाहरी रिंग को एक साफ सतह (चित्रा 1 बी) पर उल्टा रखें, और सावधानीपूर्वक अंगूठी के अंदर एक क्वार्ट्ज वेफर रखें (चित्रा 1 सी)। यह पहला क्वार्ट्ज वेफर घटना एक्स-रे के लिए एक प्रवेश खिड़की के रूप में कार्य करता है।
  2. पेट्री डिश में माइक्रोस्कोप विसर्जन तेल (150 सीएसटी की चिपचिपाहट) की एक छोटी मात्रा डालें। तेल में एक शिम डुबोएं, और सुनिश्चित करें कि शिम के दोनों किनारों को ठीक से तेल दिया गया है (चित्रा 1 डी)। एक साफ सतह पर शिम को दबाकर अतिरिक्त तेल को हटा दें।
  3. पहले क्वार्ट्ज वेफर (चित्रा 1 ई) के शीर्ष पर तेल वाले शिम रखें।
    नोट: विसर्जन तेल एक उत्कृष्ट सीलेंट है जो क्रिस्टलीकरण कक्ष को संभावित वाष्प हानि से बचाता है। ठीक से इकट्ठे चिप्स आमतौर पर दिखाई देने वाले सुखाने के बिना हफ्तों तक चलते हैं। यह पूर्व-असेंबली चरण कमरे की रोशनी के तहत किया जाता है। प्रकाश-संवेदनशील नमूनों के लिए, नमूना लोडिंग, डिवाइस भंडारण और अवलोकन सहित बाद के सभी चरणों को सुरक्षा प्रकाश के तहत किया जाना चाहिए।

2. नमूना लोडिंग और डिवाइस असेंबली

  1. पहले क्वार्ट्ज वेफर पर प्रोटीन समाधान और क्रिस्टलीकरण बफर को अच्छी तरह से मिलाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। प्रोटीन नमूने और बफर के बीच मात्रा अनुपात आमतौर पर 2: 1 से 1: 2 (चित्रा 1 एफ) तक होता है। सुनिश्चित करें कि क्रिस्टलीकरण समाधान की कुल मात्रा शिम आकार और मोटाई द्वारा निर्धारित क्रिस्टलीकरण कक्ष की अधिकतम क्षमता से अधिक नहीं है। मिश्रण के दौरान हवा के बुलबुले से बचें।
    नोट: क्रिस्टलीकरण बफर की संरचना एक प्रयोग से दूसरे में भिन्न होती है। क्रिस्टलीकरण स्थितियों के लिए तालिका 1 देखें।
  2. मिश्रित घोल के ऊपर दूसरा क्वार्ट्ज वेफर रखें क्योंकि समाधान फैलना शुरू हो जाता है (चित्रा 1 जी)। यह दूसरा क्वार्ट्ज वेफर विच्छेदित एक्स-रे की निकास खिड़की के रूप में कार्य करता है।
  3. हवा को बाहर धकेलते समय तेल फैलाने में मदद करने के लिए किनारे पर दूसरे क्वार्ट्ज वेफर को हल्के से टैप करें। बाहरी रिंग में एक रिटेनिंग रिंग को स्क्रू करके डिवाइस को सुरक्षित करें (चित्रा 1 एच)। यदि आवश्यक हो तो एक कसने वाले उपकरण का उपयोग करें (चित्रा 1 आई)। ध्यान रखें कि अति-कसाव नाजुक क्वार्ट्ज वेफर्स को विकृत या यहां तक कि दरार का कारण बन सकता है।

3. डिवाइस भंडारण और क्रिस्टलीकरण अनुकूलन

  1. इकट्ठे उपकरणों (चित्रा 1 जे) को कमरे के तापमान पर एक बॉक्स में या तापमान नियंत्रण के साथ एक इनक्यूबेटर के अंदर स्टोर करें।
    नोट: क्रिस्टलीकरण डिवाइस इकट्ठा होने के बाद प्रोटीन क्रिस्टल कुछ घंटों से दिनों तक दिखाई दे सकते हैं। ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण से विशिष्ट परिणाम कई प्रतिनिधि प्रोटीन नमूनों (चित्रा 2) के लिए दिखाए गए हैं।
  2. माइक्रोस्कोप के तहत क्रिस्टलीकरण उपकरण का अवलोकन करके क्रिस्टल विकास की निगरानी करें। यदि आवश्यक हो, तो अनुभाग 1-3 के पुनरावृत्तियों द्वारा क्रिस्टलीकरण स्थितियों का अनुकूलन करें।

4. अंशांकन

नोट: नीचे दिए गए अनुभागों में उल्लिखित प्रोग्राम और कमांड इनसीटूएक्स सॉफ्टवेयर में चलाए जाते हैं।

  1. चिप धारक पर मिश्रित यट्रियम एल्यूमीनियम गार्नेट का एक पतला क्रिस्टल स्थापित करें (चित्रा 3)। बीम स्टॉप स्थापित करें। प्रोग्राम चलाकर डायरेक्ट बीम की एक्स-रे फ्लोरेसेंस छवियां लें:
    burnmark.py <व्यापक>.param
    जहां <व्यापक> क्रिस्टलीकरण डिवाइस के लिए एक उपयोगकर्ता-चयनित नाम है। .param एक फ़ाइल नाम है जिसमें डिवाइस-विशिष्ट नियंत्रण पैरामीटर होते हैं। डिफ़ॉल्ट मानों को धीरे-धीरे प्रोटोकॉल के साथ विशिष्ट मानों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा। एक नमूना .param फ़ाइल पूरक फ़ाइल 1 में दिखाया गया है।
  2. बीम प्रोफ़ाइल फिटिंग प्रोग्राम चलाकर प्रत्यक्ष एक्स-रे बीम की सटीक स्थिति ज्ञात करें:
    beam.py <बर्न छवि> -डी <व्यापक>
    जहां <बर्न छवि> एक्स-रे फ्लोरेसेंस छवि (चित्रा 4) का फ़ाइल नाम है।
    नोट: यह कार्यक्रम सटीक प्रत्यक्ष बीम पदों के साथ-साथ बीम आकार की गणना करता है। बीम की स्थिति एक ही डिवाइस से सभी क्रिस्टल के लिए स्थानांतरण गंतव्य को चिह्नित करती है। बीम आकार का उपयोग लक्ष्य योजना के लिए भी किया जाता है।

5. ऑप्टिकल स्कैनिंग

  1. चिप धारक में एक क्रिस्टलीकरण डिवाइस रखें और अंगूठे की कतरा का उपयोग करके डिवाइस को सुरक्षित करें (चित्रा 3 ए)।
  2. चिप धारक को एक किनेमेटिक तंत्र (चित्रा 3 बी) के माध्यम से डिफ्रेक्टोमीटर के अनुवाद चरण पर माउंट करें।
  3. डिवाइस की ऑप्टिकल विंडो से माइक्रोग्राफ लेने के लिए एक उचित प्रकाश स्रोत स्थापित करें। प्रोटीन नमूने की प्रकाश संवेदनशीलता के साथ-साथ प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर सफेद प्रकाश, आईआर प्रकाश, या पसंद के अन्य प्रकाश का उपयोग किया जा सकता है।
  4. स्कैन प्रोग्राम चलाएँ:
    scan.py <व्यापक>.param
    यह प्रोग्राम माइक्रोग्राफ के एक सेट को कैप्चर करता है जो स्वचालित रूप से निर्दिष्ट उपयोगकर्ता कंप्यूटरों में स्थानांतरित हो जाते हैं।
  5. किसी उपयोगकर्ता कंप्यूटर पर टाइलिंग प्रोग्राम चलाएँ:
    tile.py <व्यापक> -x -y
    जहां और क्रमशः माइक्रोग्राफ के कॉलम और पंक्ति विस्थापन के लिए प्रारंभिक मान हैं। यह प्रोग्राम सभी माइक्रोग्राफ को 1-3 μm/ पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 5) के मोंटेज में सिलता है।
    नोट: चरण 5.4 और 5.5 आमतौर पर कुछ मिनट लगते हैं। स्कैन क्षेत्र और आवर्धन के आधार पर माइक्रोग्राफ की कुल संख्या कई दसियों से लेकर सैकड़ों तक होती है।
  6. क्रिस्टल-खोज कार्यक्रम चलाएँ:
    findX.py <मोंटाज> -सी <लेंथ> <विड्थ> -डब्ल्यू <वेज> -एक्स <बीम आकार>
    जहां <मोंटाज> टाइल वाली छवि है। यह कार्यक्रम क्रिस्टल मान्यता और शॉट प्लानिंग करता है। < लंबाई> और <विड्थ> पाए जाने वाले क्रिस्टल आकार को इंगित करते हैं। यदि उपयोगकर्ता छोटे क्रिस्टल से बचना चाहता है, तो <विड्थ> का उपयोग अवांछित छोटे क्रिस्टल के आकार से बड़ी संख्या सेट करके कटऑफ के रूप में किया जा सकता है। <वेज> एक कोणीय मूल्य है जो अनियमित आकार के क्रिस्टल के लिए सहिष्णुता निर्धारित करता है। <बीम आकार> ऊपर दिए गए प्रोफाइल फिटिंग से प्राप्त प्रत्यक्ष बीम आकार को संदर्भित करता है (चरण 4.2; चित्र 4)। इसके अलावा, लक्षित शॉट्स को आगे बढ़ाने के लिए उपयोगकर्ताओं द्वारा एक नाममात्र मूल्य सेट किया जा सकता है। ये प्रमुख पैरामीटर विशिष्ट क्रिस्टल चयन और लक्ष्य योजना को सक्षम करते हैं (चित्रा 6)।

6. एक्स-रे विवर्तन

  1. प्रकाश स्रोत को हटा दें और बीम स्टॉप स्थापित करें। एक उपयुक्त डिटेक्टर दूरी निर्धारित करें। एक्स-रे हच खोजने के लिए बीमलाइन सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करें। यदि लागू हो तो एक्स-रे शटर और लेजर शटर खोलें।
  2. सीरियल विवर्तन के लिए डेटा संग्रह प्रोग्राम चलाएँ:
    collect.py <डिवाइस>.param-l <लाइट अवधि>
    यह कमांड डेटा संग्रह को ट्रिगर करता है जिसमें सभी नियोजित शॉट्स को एक पूर्वक्रमित अनुक्रम के अनुसार एक के बाद एक देखा जाता है। प्रत्येक लक्षित क्रिस्टल को बीम स्थिति (चरण 4.2) में स्थानांतरित किया जाता है। प्रत्येक स्टॉप पर, एक्स-रे एक्सपोजर को निर्धारित समय की देरी पर लेजर रोशनी के साथ या बिना लिया जाता है। मूवी 1 1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर संचालित एक स्वचालित डेटा संग्रह अनुक्रम दिखाता है। नियमित रूप से एक क्रिस्टलीकरण डिवाइस (मूवी 2) से सैकड़ों विवर्तन छवियां एकत्र की जाती हैं।
    नोट: अनुभाग 4 अंशांकन और अनुभाग 5 ऑप्टिकल स्कैन इनसीटूएक्स प्लेटफॉर्म में स्व-निहित हैं, इसलिए, पूरी तरह से दूसरे बीमलाइन में हस्तांतरणीय हैं। धारा 6 एक्स-रे विवर्तन में बीमलाइन ऑपरेशन में कुछ विवरण शामिल करना होगा।

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Representative Results

पिछले कुछ वर्षों में फोटोरिसेप्टर प्रोटीन और एंजाइमों सहित प्रोटीन नमूनों की एक विविध श्रृंखला से क्रिस्टलोग्राफिक परिणामों और वैज्ञानिक निष्कर्षों के साथ 10,12 प्रकाशित किए गए हैं, उदाहरण के लिए, एक प्लांट यूवी-बी फोटोरिसेप्टर यूवीआर 8, एक प्रकाश-संचालित डीएनए मरम्मत फोटोलाइस पीएचआरबी10, एक बहु-डोमेन संवेदी हिस्टिडाइन किनेज14 से एक नया दूर-लाल प्रकाश संवेदी प्रोटीन लाइट डुअल-सेंसर डोमेन, और एक बैक्टीरियोफाइटोक्रोम12 के फोटोसेंसरी कोर मॉड्यूल। प्रतिनिधि परिणामों के रूप में, हम तालिका 1 में इन प्रोटीनों की ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण स्थितियों को सूचीबद्ध करते हैं, और सीधे वाष्प प्रसार विधि के लिए उपयोग की जाने वाली स्थितियों के साथ उनकी तुलना करते हैं। यहां हम ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण (चित्रा 2) के चार अतिरिक्त केस स्टडीज और एक फिल्म (मूवी 2) में सीटू विवर्तन पैटर्न का संग्रह दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकत्र किए गए सीटू डेटासेट में प्रतिनिधि तालिका 2 में संक्षेपित हैं।

एक प्रतिनिधि मामले में, क्रायोक्रिस्टलोग्राफी ने इन क्रिस्टल14 की प्रकाश संवेदनशीलता और उच्च विलायक सामग्री (~ 80%) के कारण दूर-लाल-प्रकाश सेंसिंग फोटोरिसेप्टर प्रोटीन के लिए खराब विवर्तन को जन्म दिया। क्रायोक्रिस्टलोग्राफी डेटा से प्राप्त इलेक्ट्रॉन घनत्व क्रोमोफोर रचना को हल करने के लिए बहुत अधिक थे, जो हमारे वैज्ञानिक प्रश्न के केंद्र में है। सीटू प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम विवर्तन से पहले अनपेक्षित प्रकाश सक्रियण से बचने में सक्षम थे और 800 से अधिक क्रिस्टल से कमरे के तापमान पर एक अंधेरा डेटासेट प्राप्त किया। सीटू सीरियल लाउ विवर्तन के इस अंधेरे डेटासेट के परिणामस्वरूप बेहतर हल किए गए इलेक्ट्रॉन घनत्व हुए, जिससे एक बिलिन क्रोमोफोर के आत्मविश्वास मॉडल निर्माण की अनुमति मिली जो अब तक अज्ञात ऑल-जेड, सिन रचना (चित्रा 7 ए) 12,14 प्रदर्शित करता है। हमारे गतिशील क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों ने अंधेरे में 4,352 क्रिस्टल और प्रकाश रोशनी के बाद 8,287 क्रिस्टल से डेटा की तुलना करके इस दूर-लाल फोटोरिसेप्टर प्रोटीन में प्रकाश-प्रेरित परिवर्तनों का खुलासा किया है (चित्रा 7)। प्रकाश-प्रेरित अंतर मानचित्रों के प्रारंभिक विश्लेषण ने केंद्रीय β शीट में ठोस गतियों का खुलासा किया है, जो क्रोमोफोर के पाइरोल रिंग्स और कई सुगंधित अवशेषों (चित्रा 7 बी, सी) के बीच π-π स्टैकिंग के महत्व का सुझाव देता है। एक गहन विश्लेषण और वैज्ञानिक निष्कर्ष कहीं और प्रस्तुत किए जाएंगे।

Figure 1
चित्रा 1: क्रिस्टलीकरण डिवाइस असेंबली। प्रत्येक असेंबली की लागत दो मोनोक्रिस्टलाइन क्वार्ट्ज वेफर्स के साथ यूएस $ 30 या दो ग्लास कवरलिप के साथ यूएस $ 10 होने का अनुमान है। शिम को छोड़कर हार्डवेयर घटक पुन: प्रयोज्य हैं। (ए) बाहरी रिंग के सपाट पक्ष को पहचान उद्देश्यों के लिए लेबल किया गया है। (बी) बाहरी अंगूठी को एक साफ सतह पर उल्टा रखा जाता है। (C) 1 इंच व्यास का एक क्वार्ट्ज वेफर सावधानीपूर्वक अंदर रखा जाता है। क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के दौरान इसके बजाय एक ग्लास चिप का भी उपयोग किया जा सकता है लेकिन एक्स-रे विवर्तन के साथ संगत नहीं है। (D) शिम के दोनों किनारों पर तेल लगा हुआ है। (E) तेल युक्त शिम को पहले क्वार्ट्ज चिप पर रखा जाता है। (एफ) प्रोटीन और क्रिस्टलीकरण समाधान चिप के केंद्र में पाइप किए जाते हैं और मिश्रित होते हैं। (जी) एक दूसरा क्वार्ट्ज या ग्लास चिप ड्रॉप को कवर करता है ताकि यह चिप पर समान रूप से फैल जाए। (एच) दूसरे क्वार्ट्ज वेफर के ऊपर एक रिटेनिंग रिंग फंस जाती है। (I) रिटेनर रिंग को धीरे से कसने के लिए एक कसने वाले उपकरण का उपयोग किया जाता है। (जे) एक पूरी तरह से इकट्ठे उपकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: क्वार्ट्ज उपकरणों पर उगाए गए प्रतिनिधि प्रोटीन क्रिस्टल। (A) एक बैक्टीरियोफाइटोक्रोम का फोटोसेंसरी कोर मॉड्यूल ( तालिका 1 में Pa497)। (बी, सी) एक बहु-डोमेन संवेदी हिस्टिडाइन किनेज ( तालिका 1 में 2551g3 और 2551g3E1) से तीसरे GAF डोमेन के विभिन्न निर्माण। (डी) दोहरे सेंसर हिस्टिडाइन किनेज ( तालिका 1 में आरईसीजीएएफ) से अग्रानुक्रम संवेदी डोमेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: InSituX डिफ्रेक्टोमीटर. (A) चिप धारक में एक क्रिस्टलीकरण उपकरण लगाया जाता है. यद्यपि डिवाइस लंबवत रूप से लगाया गया है, चिप पर उगाए गए क्रिस्टल गिरने वाले नहीं हैं, मुख्य रूप से क्योंकि इकट्ठे डिवाइस में तरल परत बहुत पतली होती है, और बढ़ने पर क्रिस्टल उनके नाभिक में लंगर डाले जाते हैं। (बी) ऑप्टिकल स्कैन के लिए एक आईआर प्रकाश स्रोत स्थापित किया गया है। कैमरा एक प्रिज्म मिरर (तस्वीर में दिखाई नहीं दे रहा है) के माध्यम से एक्स-रे बीम के साथ प्रोटीन क्रिस्टल के इनलाइन दृश्य को कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डायरेक्ट बीम प्रोफाइल फिटिंग। एक्स-रे फ्लोरेसेंस छवि के लाल, हरे और नीले चैनलों का उपयोग दो-आयामी गॉसियन फ़ंक्शन को फिट करने के लिए किया जाता है। बाएं कॉलम लाल, हरे और नीले चैनलों की कच्ची छवि दिखाता है। मध्य स्तंभ सटीक बीम स्थिति और आकार के साथ उपयुक्त परिणाम है। दायां स्तंभ फिटिंग अवशिष्ट प्रदर्शित करता है। यदि फिटिंग अवशिष्ट का आयाम कच्ची छवि के एक छोटे से अंश तक फैला है, तो प्रत्यक्ष बीम की प्रोफ़ाइल फिटिंग सफल होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: छवि टाइलिंग. (A) ऑप्टिकल स्कैन के दौरान क्रिस्टल माइक्रोग्राफ की एक सरणी कैप्चर की जाती है. ऑप्टिकल स्कैन और डेटा ट्रांसफर में आमतौर पर 1-2 मिनट लगते हैं। आसन्न माइक्रोग्राफ अतिव्यापी क्षेत्र की एक पट्टी साझा करते हैं, क्षैतिज और लंबवत रूप से, जैसा कि पीले बक्से द्वारा चिह्नित किया गया है। (बी) अतिव्यापी क्षेत्रों में इष्टतम सहसंबंध के आधार पर एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मोंटेज बनाने के लिए माइक्रोग्राफ को एक साथ सिला जाता है। इस प्रक्रिया में आमतौर पर लैपटॉप कंप्यूटर पर एक मिनट लगता है। पीला बॉक्स (ए) में दिखाए गए 2 x 2 माइक्रोग्राफ द्वारा कैप्चर किए गए क्षेत्र को रेखांकित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: क्रिस्टल पहचान और शॉट प्लानिंग। प्रत्येक गुलाबी सर्कल एक क्रिस्टल के प्राथमिक शॉट को चिह्नित करता है। पीले घेरे अतिरिक्त शॉट्स को चिह्नित करते हैं यदि एक क्रिस्टल इन शॉट्स को स्थिति में रखने के लिए पर्याप्त लंबा है। गुलाबी लाइनें यात्रा विक्रेता समस्या के समाधान के रूप में एक मार्ग को चिह्नित करती हैं। क्लस्टर क्रिस्टल और छोटे क्रिस्टल से काफी हद तक बचा जाता है। क्रिस्टल खोज की आक्रामकता को findX.py के विकल्प के रूप में समायोजित किया जा सकता है (चरण 5.6)। एक क्रूर बल "ओवरकिल" रणनीति कोई क्रिस्टल अन-शॉट नहीं छोड़ेगी, लेकिन बहुत सारे विवर्तन छवियों का उत्पादन कर सकती है, लेकिन प्रक्रिया योग्य नहींहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: हिस्टिडाइन काइनेज के सुदूर-लाल-प्रकाश संवेदन डोमेन के इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र। (A) 2.5σ पर समोच्च किया गया 2Fo-Fc मानचित्र एक ऑल-Z, syn अनुरूपता14 में बिलिन क्रोमोफोर से जुड़े इलेक्ट्रॉन घनत्व को दर्शाता है। पाइरोल रिंग ए से डी तक चिह्नित हैं। (बी और सी) क्रमशः हरे और लाल रंग में ±2.5σ पर संकलित हल्के-अंधेरे अंतर मानचित्र, इलेक्ट्रॉन घनत्व के लाभ और हानि को उजागर करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: वाष्प प्रसार और ऑन-चिप बैच विधि के बीच क्रिस्टलीकरण स्थितियों की तुलना। वाष्प प्रसार और क्रिस्टलीकरण के बैच के तरीके अत्यधिक सहसंबद्ध हैं 10,14,15,16,17,18,19. वाष्प प्रसार की स्थिति से शुरू होकर, एक समान स्थिति को ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: क्वार्ट्ज उपकरणों से सीधे एकत्र किए गए सीटू डेटासेट का सारांश। कई क्रिस्टलीकरण उपकरणों से हजारों लाउ विवर्तन पैटर्न एकत्र किए जा सकते हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मूवी 1: एक मॉक डेटा संग्रह। लक्षित क्रिस्टल को एक्स-रे बीम में स्थानांतरित किया जाता है जैसा कि एक लाल सर्कल द्वारा चिह्नित किया जाता है। इस फिल्म में लक्षित क्रिस्टल का अनुक्रम यात्रा विक्रेता समस्या के समाधान का पालन नहीं करता है। लेजर और एक्स-रे एक्सपोज़र को प्रोग्राम किए गए विलंब के साथ प्रत्येक स्टॉप पर फायर किया जाता है। विवर्तन छवियां एकत्र की जाती हैं। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2: विवर्तन छवियां। एक क्रिस्टलीकरण उपकरण से सैकड़ों विवर्तन छवियों को एकत्र किया जा सकता है। कई डिवाइस एक पूर्ण और अत्यधिक निरर्थक डेटासेट (तालिका 2) का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त हैं। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: नमूना <व्यापक>.param फ़ाइल. एक छोटी पाठ फ़ाइल प्रत्येक क्रिस्टलीकरण डिवाइस के लिए विशिष्ट कुछ नियंत्रण पैरामीटर एकत्र करती है। ये पैरामीटर अपने डिफ़ॉल्ट मानों से शुरू होते हैं और प्रोटोकॉल के आगे बढ़ने के साथ अनुभाग 4, 5 और 6 में तदनुसार संशोधित किए जाएंगे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कमरे के तापमान पर आयोजित शुरुआती वर्षों में प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी ने एक्स-रे विकिरण क्षति से जूझने में जबरदस्त कठिनाई का अनुभव किया। इस प्रकार, इसे अधिक मजबूत क्रायोक्रिस्टलोग्राफी विधि द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है क्योंकि सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे स्रोत आसानी से उपलब्ध हो गएहैं। एक्स-रे फ्री-इलेक्ट्रॉन लेजर के आगमन के साथ, हाल के वर्षों में कमरे के तापमान प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी को पुनर्जीवित किया गया है, जिसमें शारीरिक रूप से प्रासंगिक तापमान2,21 पर प्रोटीन संरचनात्मक गतिशीलता का निरीक्षण करने की इच्छा से प्रेरित कई नए विकास हुए हैं। क्रिस्टल-ऑन-क्रिस्टल उपकरणों के आधार पर इनसीटूएक्स प्लेटफॉर्म का विकास उसी महत्वाकांक्षा से प्रेरित है, अर्थात, कमरे के तापमान पर गतिशील क्रिस्टलोग्राफी अध्ययन के लिए नियमित और मजबूत डेटा संग्रह विधियों को स्थापित करना। यह स्वचालित सीरियल एक्स-रे विवर्तन विधि प्रोटीन क्रिस्टल के लिए स्थिर संरचना निर्धारण पर भी लागू होती है जो फ्रीजिंग14 के लिए उत्तरदायी है। इस प्रोटोकॉल में, हम इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके कमरे के तापमान डेटा संग्रह को वितरित करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदमों के साथ प्रमुख तकनीकी विचार प्रस्तुत करते हैं। यह विधि नाजुक प्रोटीन क्रिस्टल के लिए विशेष रूप से अनुकूल है जो यांत्रिक हैंडलिंग, एक्स-रे विकिरण क्षति या वायु जोखिम के प्रति संवेदनशील हैं।

मंच प्रोटोटाइप का आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी के उन्नत फोटॉन स्रोत (एपीएस) में दो प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन पर बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है। हालांकि इस प्रोटोकॉल के अनुसार ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण स्थापित करना सरल है, डेटा संग्रह चरण में कई कस्टम-निर्मित हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर घटक शामिल हैं। नतीजतन, परियोजना-विशिष्ट डेटा संग्रह रणनीतियों के इसके आवेदन और कार्यान्वयन के लिए उपयोगकर्ताओं और बीमलाइन वैज्ञानिकों के बीच घनिष्ठ सहयोग की आवश्यकता हो सकती है। दूसरे शब्दों में, यह तकनीक अपने वर्तमान रूप में उन उपयोगकर्ताओं तक सीमित है जिनके पास एपीएस जैसे सिंक्रोट्रॉन तक पर्याप्त पहुंच है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल में वर्णित समग्र वर्कफ़्लो और प्रमुख कदम कमरे के तापमान प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी में रुचि रखने वाले किसी भी शोध समूह के लिए एक संदर्भ या गाइड के रूप में काम करेंगे।

इस मंच का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि माउंटिंग या फ्रीजिंग जैसे किसी भी क्रिस्टल हेरफेर की आवश्यकता नहीं होती है जैसे कि नाजुक प्रोटीन क्रिस्टल प्राचीन परिस्थितियों में अलग हो जाते हैं। एक और प्रमुख लाभ यह है कि मोनोक्रिस्टलाइन क्वार्ट्ज सब्सट्रेट का उपयोग प्रोटीन विवर्तन छवियों के लिए बहुत कम पृष्ठभूमि प्रकीर्णन को जन्म देता है, जबकि लंबे समय (हफ्तों से महीनों) में प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए स्थिर वातावरण की पेशकश करता है। हालांकि, यह मंच विरल-मैट्रिक्स क्रिस्टल स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि यह बड़े पैमाने पर क्रिस्टल उत्पादन के लिए अभिप्रेत है। जैसे, किसी दिए गए प्रोटीन नमूने के लिए प्रारंभिक ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण परीक्षण स्थापित करने के लिए क्रिस्टलीकरण स्थितियों का पूर्व ज्ञान आवश्यक है।

व्यवहार में, हम पाते हैं कि कुछ डिवाइस असेंबली चरण, जैसे कि शिम (चरण 1.2) को तेल कैसे करें और डिवाइस को कैसे सील करें (चरण 2.3), जितना तुच्छ लगता है, अक्सर क्रिस्टलीकरण के परिणामों को सीधे प्रभावित करता है। यदि तेल ठीक से नहीं किया जाता है तो एक उपकरण जल्दी से सूख सकता है। इसके अलावा, असेंबली के अंतिम चरण में डिवाइस का अति-कसाव क्वार्ट्ज वेफर्स को विकृत कर सकता है, जबकि अंडर-टाइटिंग से डिवाइस से संभावित रिसाव और / या अनियंत्रित वाष्पीकरण होता है। एक और महत्वपूर्ण कदम एक्स-रे शॉट्स की योजना बना रहा है। अतिव्यापी विवर्तन पैटर्न से बचने के लिए क्लस्टर या भीड़ वाले क्रिस्टल से सावधानीपूर्वक निपटना चाहिए जो अक्सर संसाधित करना मुश्किल होता है। माइक्रो-फोकसिंग एक्स-रे बीम के उपयोग से इस समस्या को कम किया जा सकता है। संभावित रूप से, एक पूर्ण डेटासेट प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है यदि क्रिस्टल आकृति विज्ञान एक बड़ी पतली प्लेट है ताकि अधिकांश प्लेटें क्वार्ट्ज खिड़कियों के समानांतर हों। इसके अलावा, एकल-क्रिस्टल क्वार्ट्ज चिप्स को साबुन और कार्बनिक सॉल्वैंट्स से जुड़ी सफाई प्रक्रिया के बाद पुनर्नवीनीकरण और पुन: उपयोग किया जा सकता है जो तेल और प्रोटीन मलबे को हटाते हैं। आमतौर पर, इन नाजुक चिप्स का लगभग 80-90% अगले प्रयोगों के लिए नुकसान के बिना साफ किया जा सकता है। माइक्रो-केंद्रित बीमलाइन पर छोटे क्रिस्टल के मामले में, जब क्रिस्टल पोजिशनिंग में बेहतर परिशुद्धता प्राप्त की जानी चाहिए, तो कई हार्डवेयर घटकों को अपग्रेड किया जा सकता है, जैसे कि बेहतर मोटर्स, बेहतर कैमरा और ऑप्टिक्स, अधिक आवर्धन, आदि। हालांकि, इनमें से कोई भी अत्याधुनिक सीमाओं के करीब नहीं है। इसलिए, बहुत कठिनाई के बिना सुधार के लिए बहुत जगह उपलब्ध है।

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Disclosures

जेडआर अमेरिकी पेटेंट 9632042 पर क्रिस्टल-ऑन-क्रिस्टल चिप्स के आविष्कारक हैं, जो रेन्ज़ रिसर्च, इंक को दिए गए हैं।

Acknowledgments

आर्गोन नेशनल लेबोरेटरी द्वारा अमेरिकी ऊर्जा विभाग के लिए संचालित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा के एक कार्यालय, उन्नत फोटॉन स्रोत का उपयोग अनुबंध डीई-एसी02-06सीएच 11357 द्वारा समर्थित था। बायोकार्स के उपयोग को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा अनुदान संख्या आर 24 जीएम 111072 के तहत समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। एलएस-कैट सेक्टर 21 का उपयोग मिशिगन आर्थिक विकास निगम और मिशिगन प्रौद्योगिकी ट्राई-कॉरिडोर अनुदान 085 पी 1000817 द्वारा समर्थित था। यह काम शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर01ईवाई024363), और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एमसीबी 2017274) से एक्सवाई को अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Outer ring In-house developed
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
Pump lasers Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

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References

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जैव रसायन अंक 181
कमरे के तापमान पर ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण और बड़े पैमाने पर सीरियल विवर्तन
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Biju, L. M., Wang, C., Kang, W.,… More

Biju, L. M., Wang, C., Kang, W., Tom, I. P., Kumarapperuma, I., Yang, X., Ren, Z. On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature. J. Vis. Exp. (181), e63022, doi:10.3791/63022 (2022).

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