Summary
이 기고는 결정-온-크리스탈 장치에서 단백질 결정화를 설정하는 방법과 온칩 결정화 플랫폼을 사용하여 실온에서 자동화된 직렬 데이터 수집을 수행하는 방법을 설명합니다.
Abstract
생화학 반응과 생물학적 과정은 단백질이 기능적 상태 사이에서 어떻게 전환되는지 보여줌으로써 가장 잘 이해할 수 있습니다. 극저온은 비생리적이며 단백질 구조 역학을 방지, 억제 또는 변경할 수 있으므로 실온에서 일상적인 X선 회절 실험을 위한 강력한 방법이 매우 바람직합니다. 이 프로토콜에 사용되는 크리스탈 온 크리스탈 장치와 함께 제공되는 하드웨어 및 소프트웨어는 샘플 조작 없이 다양한 크기의 단백질 결정에 대해 실온에서 현장 X선 회절을 가능하게 하도록 설계되었습니다. 여기에서는 장치 조립, 온칩 결정화, 광학 스캐닝, 크리스탈 인식에서 X선 샷 계획 및 자동화된 데이터 수집에 이르는 주요 단계에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 결정 수확이나 다른 샘플 조작이 필요하지 않기 때문에 칩에서 성장한 수백에서 수천 개의 단백질 결정을 프로그래밍 가능하고 처리량이 높은 방식으로 X선 빔에 도입할 수 있습니다.
Introduction
X 선 방사선의 이온화 효과로 인해 단백질 결정학은 지난 30 년 동안 극저온 조건으로 제한되었습니다. 따라서 기능 중 단백질 운동에 대한 현재의 지식은 주로 극저온 조건에서 다른 상태에서 관찰되는 정적 구조 간의 비교에서 비롯됩니다. 그러나 극저온 온도는 단백질 분자가 작동하는 동안 필연적으로 생화학 반응의 진행이나 서로 다른 구조적 상태 간의 상호 전환을 방해합니다. 결정학을 통해 원자 분해능에서 단백질 구조 역학을 직접 관찰하려면 실온에서 회절 실험을 수행하기 위한 강력하고 일상적인 방법이 필요하며, 이를 위해서는 샘플 전달, 데이터 수집 및 사후 데이터 분석의 기술 혁신이 필요합니다. 이를 위해 최근 연속 결정학의 발전은 실온 1,2,3에서 중간체 및 수명이 짧은 구조 종의 분자 이미지를 캡처하는 새로운 길을 제공했습니다. 기존의 저온 결정학에서 널리 사용되는 "1 결정 1 데이터 세트"전략과 달리 직렬 결정학은 단일 입자 초저온 전자 현미경과 유사한 데이터 수집 전략을 채택합니다. 특히, 연속 결정학의 실험 데이터는 많은 수의 개별 샘플에서 작은 분획으로 수집 된 다음 데이터 분획을 평가하고 3D 구조 결정을위한 완전한 데이터 세트로 결합하는 집중적 인 데이터 처리가 이루어집니다4. 이 "단결정 원샷" 전략은 파괴 전 회절 전략5를 통해 실온에서 단백질 결정에 대한 X선 방사선 손상을 효과적으로 완화합니다.
연속 결정학은 데이터 세트를 완성하기 위해 많은 수의 단백질 결정이 필요하기 때문에 단백질 샘플이 제한적이거나 섬세한 결정 처리가 관련된 많은 생물학적 시스템에 주요 기술적 과제를 제기합니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 연속 회절 실험에서 결정 무결성을 가장 잘 보존하는 방법입니다. 현장 회절 방법은 결정화 챔버 6,7,8,9의 밀봉을 깨뜨리지 않고 단백질 결정이 성장하는 곳에서 직접 회절되도록 함으로써 이러한 문제를 해결합니다. 이러한 취급이 필요 없는 방법은 대규모 직렬 회절과 자연스럽게 호환됩니다. 우리는 최근에 단결정 석영11에서 직접 성장한 단백질 결정인 결정 대 결정 개념에 기반한 현장 회절을 위한 결정화 장치의 설계 및 구현을 보고했습니다. 이 "크리스탈 온 크리스탈" 장치는 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 단결정 석영 기판으로 만들어진 X선 및 가벼운 투명 창이 있어 배경 산란이 거의 발생하지 않아 단백질 결정의 회절 이미지에서 신호 대 잡음비가 우수합니다. 둘째, 단결정 석영은 유리와 동등한 우수한 수증기 장벽이므로 단백질 결정화를위한 안정적인 환경을 제공합니다. 대조적으로, 중합체-기재를 사용하는 다른 결정화 장치는 중합체 물질이 상당한 두께를 갖지 않는 한 증기 투과성으로 인해 건조되기 쉽고, 이는 결과적으로 높은 배경 산란(10)에 기여한다. 셋째, 이 장치는 결정 무결성을 보존하는 데 중요한 결정 조작 또는 수확의 어떠한 형태도 없이 많은 수의 단백질 결정을 X선 빔에 전달할 수 있습니다(11).
크리스탈 온 크리스탈 장치를 사용하여 연속 X선 회절 실험을 간소화하기 위해, 당사는 광학 스캐닝과 X선 회절 모드(12) 사이를 쉽게 전환할 수 있도록 회절계 프로토타입을 개발하였다. 이 회절계는 설치 공간이 작으며 아르곤 국립 연구소의 고급 광자 소스 (APS)의 두 빔 라인에서 직렬 데이터 수집에 사용되었습니다. 특히, 라우에 회절에는 BioCARS 14-ID-B를, 단색 진동에는 LS-CAT 21-ID-D를 사용했습니다. 싱크로트론 또는 X선 자유 전자 레이저 빔라인에 두 가지 주요 기능이 장착된 경우 이 회절계 하드웨어가 필요하지 않습니다: (1) 모든 방향으로 X선 빔 주위의 이동 범위가 ±12mm인 전동 샘플 포지셔닝; (2) 연구중인 단백질 결정에 안전한 빛 조명 아래에서 결정을보기위한 축상 디지털 카메라. 단결정 석영 장치는 휴대용 회절분석기 및 광학 스캐닝, 크리스탈 인식 및 자동화된 현장 데이터 수집을 위한 제어 소프트웨어와 함께 직렬 결정학을 위한 inSituX 플랫폼을 구성합니다. 이러한 개발은 주로 다색 X선 소스를 사용하는 동적 결정학 응용 분야에 의해 동기가 부여되지만, 우리는 단색 진동 방법10,12를 지원하는 이 기술의 잠재력을 입증했습니다. 자동화를 통해 이 플랫폼은 저렴한 단백질 소비로 실온에서 높은 처리량의 직렬 데이터 수집 방법을 제공합니다.
이 기고에서는 습식 실험실에서 온칩 결정화를 설정하는 방법과 inSituX 플랫폼을 사용하여 싱크로트론 빔라인에서 직렬 X선 데이터 수집을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.
배치 방법은 동일한 단백질 샘플에 대해 얻은 증기 확산 방법과 유사한 조건에서 온칩 결정화를 설정하는 데 사용됩니다(표 1). 출발점으로 증기 확산 방법의 경우 1.2-1.5x 농도의 침전제를 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 미세 그리드 스크리닝을 통해 배치 결정화 조건을 추가로 최적화할 수 있습니다. 석영 웨이퍼는 최적화 시험에 필요하지 않습니다. 유리 커버 슬립을 대신 사용할 수 있습니다 (아래 참조). 부분적으로 로드된 결정화 장치는 최적화 시험을 더 작은 규모로 유지하기 위해 권장됩니다. 다수의 단백질 샘플이 배치 방법10 을 사용하여 이러한 장치 상에서 성공적으로 결정화되었다(표 1).
장치 자체는 다음 부분으로 구성됩니다 : 1) 외부 링; 2) 2 개의 석영 웨이퍼; 3) 플라스틱 또는 스테인레스 스틸의 와셔와 같은 심 하나; 4) 고정 링; 5) 실란트로 현미경 침지 오일 (그림 1). 하나의 칩에로드 된 결정화 용액의 총 부피는 실험의 목적에 따라 다릅니다. 결정화 챔버의 용량은 다양한 두께 및/또는 내경의 심을 선택하여 조정할 수 있습니다. 우리는 두께가 50-100 μm인 심을 사용하여 10-20 μL 용량의 결정화 장치를 일상적으로 설정합니다. 일반적인 장치는 연속 데이터 수집에 적합한 수만에서 수천 개의 단백질 결정을 생성할 수 있습니다(그림 2).
성공하면 온칩 결정화는 X선 회절에 대비한 각 석영 장치에서 수십에서 수백 또는 수천 개의 단백질 결정을 생성합니다. 싱크로트론 빔 라인에서, 이러한 장치는 운동 학적 메커니즘을 사용하여 회절 계의 3 축 변환 스테이지에 장착된다. 장착 된 장치의 결정화 창은 광학적으로 스캔되고 수십에서 수백 개의 현미경 사진으로 이미지화됩니다. 그런 다음 이 현미경 사진을 고해상도 몽타주로 스티칭합니다. 감광성 결정의 경우, 의도하지 않은 광 활성화를 피하기 위해 적외선 (IR) 광 하에서 광학 스캐닝을 수행 할 수 있습니다. 컴퓨터 비전 소프트웨어는 장치에 무작위로 분포 된 단백질 결정을 식별하고 찾기 위해 개발되었습니다. 그런 다음 이러한 결정은 크기, 모양 및 위치에 따라 순위가 매겨져 직렬 결정학에서 데이터 수집 전략을 알리거나 안내합니다. 예를 들어, 단일 또는 다중 샷이 각 타겟 크리스탈에 위치 할 수 있습니다. 사용자는 대상 크리스탈을 통해 단일 패스 또는 여러 경로를 계획할 수 있습니다. 우리는 다양한 여행 경로를 계산하는 소프트웨어를 구현했습니다. 예를 들어, 최단 경로는 외판원 문제(13)를 해결하는 알고리즘을 사용하여 계산된다. 펌프-프로브 동적 결정학 어플리케이션의 경우 레이저(펌프) 및 X선(프로브) 샷의 타이밍과 지속 시간을 선택할 수 있습니다. 자동 직렬 데이터 수집은 각 표적 크리스탈을 X선 빔으로 차례로 전위하도록 프로그래밍됩니다.
insituX 회절분석기의 주요 구성 요소는 다음과 같습니다: 1) 장치 홀더; 2) 3축 변환 단계; 3) 광학 스캐닝을 위한 광원; 4) X 선 빔 정지; 5) 빛에 민감한 단백질을 연구하는 경우 레이저 펌프; 6) IR 민감한 카메라가 장착 된 라즈베리 파이 마이크로 컴퓨터; 7) 모터, 카메라, 광원, 펌프 레이저를 동기화하고 빔라인 제어와 인터페이스하는 제어 소프트웨어.
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Protocol
1. 장치 사전 조립
- 샘플 식별을 위해 외부 링(직경 30mm)에 라벨을 붙입니다. 필요한 경우 프로젝트 이름, 장치 번호, 결정화 조건 및 날짜를 포함합니다(그림 1A). 깨끗한 표면에 외부 링을 거꾸로 놓고(그림 1B) 링 내부에 석영 웨이퍼 하나를 조심스럽게 놓습니다(그림 1C). 이 첫 번째 석영 웨이퍼는 입사 X선의 입구 창 역할을 합니다.
- 소량의 현미경 침지 오일(점도 150cSt)을 페트리 접시에 붓습니다. 심이 오일에 담그고 심의 양쪽에 기름칠이 제대로 되었는지 확인합니다(그림 1D). 깨끗한 표면에 심을 두드려 여분의 오일을 제거하십시오.
- 기름칠 된 심을 첫 번째 석영 웨이퍼 위에 놓습니다 (그림 1E).
알림: 침지 오일은 잠재적인 증기 손실로부터 결정화 챔버를 보호하는 우수한 실란트입니다. 적절하게 조립 된 칩은 일반적으로 눈에 띄는 건조없이 몇 주 동안 지속됩니다. 이 사전 조립 단계는 실내 조명 아래에서 수행됩니다. 빛에 민감한 샘플의 경우 샘플 로딩, 장치 보관 및 관찰을 포함한 모든 후속 단계를 안전 조명 아래에서 수행해야 합니다.
2. 샘플 로딩 및 장치 조립
- 피펫을 사용하여 첫 번째 석영 웨이퍼에서 단백질 용액과 결정화 버퍼를 완전히 혼합합니다. 단백질 샘플과 완충액 사이의 부피비는 일반적으로 2:1에서 1:2 사이입니다(그림 1F). 결정화 용액의 총 부피가 심 크기 및 두께에 의해 결정된 결정화 챔버의 최대 용량을 초과하지 않는지 확인하십시오. 혼합하는 동안 기포를 피하십시오.
참고: 결정화 버퍼의 조성은 실험마다 다릅니다. 결정화 조건에 대해서는 표 1 을 참조하십시오. - 용액이 퍼지기 시작하면 혼합 용액 위에 두 번째 석영 웨이퍼를 놓습니다(그림 1G). 이 두 번째 석영 웨이퍼는 회절 된 X- 레이의 출구 창 역할을합니다.
- 두 번째 석영 웨이퍼를 가장자리에 가볍게 두드려 공기를 밀어내면서 오일을 퍼뜨립니다. 고정 링을 외부 링에 나사로 고정하여 장치를 고정합니다(그림 1H). 필요한 경우 조임 도구를 사용하십시오(그림 1I). 과도하게 조이면 섬세한 석영 웨이퍼가 변형되거나 균열될 수 있습니다.
3. 장치 저장 및 결정화 최적화
- 조립 된 장치 (그림 1J)를 실온의 상자 또는 온도 조절 기능이있는 인큐베이터 내부에 보관하십시오.
알림: 단백질 결정은 결정화 장치가 조립된 후 몇 시간에서 며칠 내에 나타날 수 있습니다. 온칩 결정화의 일반적인 결과는 몇 가지 대표적인 단백질 샘플에 대해 표시됩니다(그림 2). - 결정화 장치를 현미경으로 관찰하여 결정 성장을 모니터링합니다. 필요한 경우 섹션 1-3을 반복하여 결정화 조건을 최적화합니다.
4. 교정
참고: 아래 섹션에 언급된 프로그램과 명령은 inSituX 소프트웨어에서 실행됩니다.
- 도핑된 이트륨 알루미늄 가닛의 얇은 결정을 칩 홀더에 설치합니다(그림 3). 빔 스톱을 설치하십시오. 프로그램을 실행하여 직접 빔의 X 선 형광 이미지를 찍습니다.
burnmark.py <장치>.매개변수
여기서 <장치> 는 결정화 장치에 대해 사용자가 선택한 이름입니다..param 은 장치별 제어 매개 변수를 포함하는 파일 이름입니다. 기본값은 프로토콜을 따라 특정 값으로 점차 대체됩니다. 샘플.param 파일은 보조 파일 1에 나와 있습니다. - 빔 프로파일 피팅 프로그램을 실행하여 직접 X선 빔의 정확한 위치를 찾습니다.
beam.py <이미지 굽기> -d <장치>
여기서 <화상 이미지> 는 X선 형광 이미지의 파일 이름입니다(그림 4).
알림: 이 프로그램은 정확한 직접 빔 위치와 빔 크기를 계산합니다. 빔 위치는 동일한 장치의 모든 결정에 대한 전위 대상을 표시합니다. 빔 크기는 대상 계획에도 사용됩니다.
5. 광학 스캐닝
- 결정화 장치를 칩 홀더에 놓고 나비 나사를 사용하여 장치를 고정합니다(그림 3A).
- 칩 홀더를 운동학적 메커니즘을 통해 회절계의 변환 단계에 장착합니다(그림 3B).
- 장치의 광학 창에서 현미경 사진을 찍을 수있는 적절한 광원을 설치하십시오. 백색광, IR 광 또는 기타 선택된 빛은 단백질 샘플의 광 민감도와 실험 목적에 따라 사용할 수 있습니다.
- 스캔 프로그램을 실행하십시오.
scan.py <장치>.매개변수
이 프로그램은 지정된 사용자 컴퓨터로 자동 전송되는 현미경 사진 세트를 캡처합니다. - 사용자 컴퓨터에서 바둑판식 배열 프로그램을 실행합니다.
tile.py <장치> -x-y
여기서 < x > 및
참고: 5.4 및 5.5단계는 일반적으로 몇 분 정도 걸립니다. 현미경 사진의 총 수는 스캔 영역과 배율에 따라 수십에서 수백에 이릅니다. - 크리스탈 찾기 프로그램을 실행하십시오.
findX.py <몽타주> -c <길이> <너비> -w <웨지> -x <빔 크기>
여기서 <몽타주> 는 바둑판식 이미지입니다. 이 프로그램은 크리스탈 인식 및 샷 계획을 수행합니다. <길이> 및 <너비> 는 찾을 결정 크기를 나타냅니다. 사용자가 더 작은 결정을 피하려면 원하지 않는 작은 결정의 크기보다 큰 숫자를 설정하여 <너비> 를 컷오프로 사용할 수 있습니다. <쐐기> 는 불규칙한 모양의 결정에 대한 허용 오차를 설정하는 각도 값입니다. <빔 크기> 는 위의 프로파일 피팅에서 얻은 직접 빔 크기를 나타냅니다(단계 4.2; 그림 4). 또한 사용자가 공칭 값을 설정하여 대상 샷의 간격을 더 확보할 수 있습니다. 이러한 주요 파라미터는 특정 결정 선택 및 타겟 계획을 가능하게 합니다(그림 6).
6. X 선 회절
- 광원을 제거하고 빔 스톱을 설치하십시오. 적절한 감지기 거리를 설정하십시오. 빔라인 안전 프로토콜에 따라 X선 허치를 검색하십시오. 해당하는 경우 X선 셔터와 레이저 셔터를 엽니다.
- 직렬 회절에 대한 데이터 수집 프로그램을 실행합니다.
collect.py <장치>.param -l <조명 지속 시간>
이 명령은 사전 프로그래밍된 시퀀스에 따라 계획된 모든 샷을 차례로 방문하는 데이터 수집을 트리거합니다. 각 타겟 크리스탈은 빔 위치로 전위됩니다 (단계 4.2). 각 정류장에서 X선 노출은 예약된 시간 지연으로 레이저 조명 유무에 관계없이 촬영됩니다. 동영상 1 은 1Hz의 주파수에서 작동하는 자동화된 데이터 수집 시퀀스를 보여줍니다. 일상적으로 수십에서 수백 개의 회절 이미지가 단일 결정화 장치(영화 2)로부터 수집됩니다.
알림: 섹션 4 보정 및 섹션 5 광학 스캔은 inSituX 플랫폼에 자체 포함되어 있으므로 다른 빔라인으로 완전히 전송할 수 있습니다. 섹션 6 X선 회절은 빔라인 작동에 대한 몇 가지 세부 사항을 포함해야 합니다.
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Representative Results
지난 몇 년 동안 광수용체 단백질 및 효소, 예를 들어 식물 UV-B 광수용체 UVR8, 광 구동 DNA 복구 광분해효소 PhrB10, 다중 영역 감각 히스티딘 키나아제14로부터의 새로운 원적외혈 감지 단백질인 광적색 감지 단백질과 같은 다양한 범위의 단백질 샘플로부터의 결정학적 결과 및 과학적 발견과함께 몇 가지 대표적인 데이터 세트가 발표되었습니다. , 리간드/광 이중 센서 도메인 및 박테리오피토크롬12의 광감각 코어 모듈. 대표적인 결과로서 이들 단백질의 온칩 결정화 조건을 표 1에 나열하고 증기 확산법에 사용된 조건과 직접 비교한다. 여기에서는 온칩 결정화에 대한 4가지 추가 사례 연구(그림 2)와 영화의 현장 회절 패턴 모음(영화 2)을 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용하여 수집된 대표적인 현장 데이터 세트는 표 2에 요약되어 있습니다.
대표적인 경우에서, 저온 결정학은 이들 결정의 광 감도 및 높은 용매 함량 (~ 80 %)으로 인해 가능한 원적외 광 감지 광 수용체 단백질에 대한 불량한 회절을 야기했다14. 저온 결정학 데이터에서 얻은 전자 밀도는 너무 번져서 과학적 질문의 중심에있는 발색단 형태를 해결할 수 없었습니다. in situ 프로토콜을 사용하여 회절 전에 의도하지 않은 빛 활성화를 피할 수 있었고 800개 이상의 결정에서 실온에서 어두운 데이터 세트를 얻을 수 있었습니다. 현장 직렬 Laue 회절에서 얻은 이 어두운 데이터 세트는 전자 밀도를 더 잘 분해하여 지금까지 알려지지 않은 all-Z, syn 형태를 나타내는 빌린 발색단의 확실한 모델 구축을 가능하게 했습니다(그림 7A)12,14. 우리의 동적 결정학 실험은 어두운 곳에서 4,352개의 결정과 빛 조명 후 8,287개의 결정에서 얻은 데이터를 비교하여 이 원적색 광수용체 단백질의 빛에 의한 변화를 추가로 밝혀냈습니다(그림 7). 광으로 인한 차이 맵의 예비 분석은 중앙 β 시트에서 공동 운동을 밝혀 발색단의 피롤 고리와 여러 방향족 잔기 사이의 π-π 적층의 중요성을 시사합니다(그림 7B, C). 심층 분석과 과학적 발견은 다른 곳에서 발표 될 것입니다.
그림 1: 결정화 장치 어셈블리. 각 어셈블리의 가격은 단결정 석영 웨이퍼 2개로 US$30, 유리 커버슬립 2개로 US$10로 추정됩니다. shim을 제외한 하드웨어 구성 요소는 재사용할 수 있습니다. (A) 외부 링의 평평한 면은 식별을 위해 표시되어 있습니다. (B) 외부 링이 깨끗한 표면에 거꾸로 놓여 있습니다. (C) 직경 1 인치의 석영 웨이퍼가 조심스럽게 내부에 배치됩니다. 유리 칩은 결정화 시험 중에 대신 사용될 수도 있지만 X 선 회절과는 호환되지 않습니다. (D) 심의 양쪽에 기름칠이 되어 있습니다. (E) 기름칠 된 심은 첫 번째 석영 칩 위에 놓입니다. (F) 단백질 및 결정화 용액을 칩의 중앙으로 피펫팅하고 혼합한다. (G) 제 2 석영 또는 유리 칩은 칩 위에 고르게 퍼지도록 방울을 덮는다. (H) 고정 링이 두 번째 석영 웨이퍼 위에 나사로 고정됩니다. (I) 조임 도구를 사용하여 리테이너 링을 부드럽게 조입니다. (J) 완전히 조립 된 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 석영 장치에서 성장한 대표적인 단백질 결정. (A) 박테리오피토크롬의 광감각 코어 모듈( 표 1의 Pa497). (ᄃ,씨) 다중 도메인으로부터의 제3 GAF 도메인의 상이한 구축물은 히스티딘 키나제 ( 표 1의 2551g3 및 2551g3Δα1)이다. (d) 이중센서 히스티딘 키나아제( 표 1의 RECGAF)로부터의 탠덤 감각 도메인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: inSituX 회절계 . (A) 결정화 장치가 칩 홀더에 장착된다. 장치가 수직으로 장착되지만 칩에서 성장한 결정은 주로 조립 된 장치의 액체 층이 매우 얇고 성장할 때 결정이 핵에 고정되기 때문에 떨어지지 않습니다. (B) 광학 스캔을 위해 IR 광원이 설치됩니다. 카메라는 프리즘 미러를 통해 X선 빔을 따라 단백질 결정의 인라인 보기를 캡처합니다(그림에는 표시되지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 직접 빔 프로파일 피팅. X선 형광 이미지의 빨간색, 녹색 및 파란색 채널은 2차원 가우스 함수를 피팅하는 데 사용됩니다. 왼쪽 열에는 빨강, 녹색 및 파랑 채널의 원시 이미지가 표시됩니다. 중간 기둥은 정확한 빔 위치와 크기의 피팅 결과입니다. 오른쪽 열에는 피팅 잔차가 표시됩니다. 피팅 잔차의 진폭이 원시 이미지의 작은 부분에 걸쳐 있으면 직접 빔의 프로파일 피팅이 성공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 이미지 바둑판식 배열. (A) 광학 스캔 중에 결정 현미경 사진의 배열이 캡처됩니다. 광학 스캔 및 데이터 전송에는 일반적으로 1-2분이 소요됩니다. 인접한 현미경 사진은 노란색 상자로 표시된 것처럼 수평 및 수직으로 겹치는 영역의 스트립을 공유합니다. (B) 현미경 사진은 겹치는 영역에서 최적의 상관 관계를 기반으로 고해상도 몽타주를 만들기 위해 함께 스티칭됩니다. 이 프로세스는 일반적으로 랩톱 컴퓨터에서 몇 분 정도 걸립니다. 노란색 상자는 (A)에 표시된 2 x 2 현미경 사진으로 캡처한 영역을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 크리스탈 인식 및 샷 계획. 각 분홍색 원은 크리스탈의 기본 샷을 표시합니다. 노란색 원은 크리스탈이 이러한 샷을 배치할 수 있을 만큼 충분히 긴 경우 추가 샷을 표시합니다. 분홍색 선은 여행 세일즈맨 문제에 대한 해결책으로 경로를 표시합니다. 클러스터형 결정과 더 작은 결정은 크게 피합니다. 크리스탈 발견의 공격성은 findX.py 옵션으로 조정할 수 있습니다 (5.6 단계). 무차별 대입 "과잉" 전략은 결정이 발사되지 않은 채로 두지 않지만 많은 회절 이미지를 생성할 수 있지만 처리할 수는 없습니다12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 히스티딘 키나아제의 원적외선 감지 도메인의 전자 밀도 지도. (A) 2.5σ 에서 윤곽이 잡힌 2Fo-Fc 맵은 all-Z, syn 형태14에서 빌린 발색단과 관련된 전자 밀도를 보여줍니다. 피롤 고리 A에서 D까지 표시됩니다. (B 및 C) 녹색과 빨간색으로 각각 ±2.5σ 로 윤곽이 잡힌 명암 차이 맵은 전자 밀도의 이득과 손실을 강조 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 증기 확산과 온칩 배치 방법 간의 결정화 조건 비교. 결정화의 증기 확산 및 배치 방법은 10,14,15,16,17,18,19와 고도로 상관되어 있습니다. 증기 확산 조건에서 시작하여 유사한 조건을 온칩 결정화에 최적화할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 석영 장치에서 직접 수집된 현장 데이터 세트 요약. 수천 개의 라우에 회절 패턴을 여러 결정화 장치에서 수집할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 모의 데이터 수집. 표적 결정은 빨간색 원으로 표시된 X선 빔으로 전위됩니다. 이 영화에서 표적이 된 크리스탈의 순서는 여행하는 세일즈맨 문제에 대한 해결책을 따르지 않습니다. 레이저 및 X선 노출은 프로그래밍된 지연으로 각 정지에서 발사됩니다. 회절 이미지가 수집됩니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 2: 회절 이미지. 단일 결정화 장치에서 수백 개의 회절 이미지를 수집할 수 있습니다. 여러 장치는 완전하고 고도로 중복된 데이터 세트를 생성하기에 충분합니다(표 2). 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 샘플 <장치>.param 파일. 작은 텍스트 파일은 각 결정화 장치에 특정한 일부 제어 파라미터를 수집합니다. 이러한 매개 변수는 기본값으로 시작하며 프로토콜이 진행됨에 따라 섹션 4, 5 및 6에서 그에 따라 수정됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
실온에서 수행된 초기 단백질 결정학은 X선 방사선 손상과 싸우는 데 엄청난 어려움을 겪었습니다. 따라서, 싱크로트론 X선 소스가 쉽게 이용 가능해짐에 따라 보다 강력한 저온결정학 방법으로 대체되었다20. X 선 자유 전자 레이저의 출현으로 최근 몇 년 동안 실온 단백질 결정학이 부활했으며 생리 학적 관련 온도 2,21에서 단백질 구조 역학을 관찰하려는 욕구에 의해 많은 새로운 개발이 이루어졌습니다. 크리스탈 온 크리스탈 장치를 기반으로 하는 inSituX 플랫폼의 개발은 실온에서 동적 결정학 연구를 위한 일상적이고 강력한 데이터 수집 방법을 확립하려는 동일한 야망에 의해 동기가 부여되었습니다. 이 자동 직렬 X선 회절법은 동결(14)에 적용할 수 없는 단백질 결정에 대한 정적 구조 결정에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 이 플랫폼을 사용하여 실온 데이터 수집을 제공하는 데 필요한 중요한 단계와 함께 주요 기술 고려 사항을 제시합니다. 이 방법은 기계적 취급, X선 방사선 손상 또는 공기 노출에 민감한 깨지기 쉬운 단백질 결정에 특히 적합합니다.
플랫폼 프로토타입은 아르곤 국립 연구소의 APS(Advanced Photon Source)에 있는 두 개의 단백질 결정학 빔라인에서 광범위하게 테스트되었습니다. 이 프로토콜에 따라 온칩 결정화를 설정하는 것은 다소 간단하지만 데이터 수집 단계에는 여러 맞춤형 하드웨어 및 소프트웨어 구성 요소가 포함됩니다. 결과적으로 프로젝트별 데이터 수집 전략을 적용하고 구현하려면 사용자와 빔라인 과학자 간의 긴밀한 협업이 필요할 수 있습니다. 즉, 현재 형태의이 기술은 APS와 같은 싱크로트론에 대한 적절한 액세스 권한이있는 사용자로 제한됩니다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜에 설명된 전체 워크플로 및 주요 단계는 실온 단백질 결정학에 관심이 있는 모든 연구 그룹을 위한 참조 또는 가이드 역할을 합니다.
이 플랫폼의 가장 중요한 장점은 섬세한 단백질 결정이 깨끗한 조건에서 회절되도록 장착 또는 동결과 같은 결정 조작이 필요하지 않다는 것입니다. 또 다른 주요 이점은 단결정 석영 기질을 사용하면 단백질 회절 이미지에 대한 배경 산란이 거의 발생하지 않으면서 장시간(몇 주에서 수개월) 동안 단백질 결정화를 위한 안정적인 환경을 제공한다는 것입니다. 그러나 이 플랫폼은 대규모 결정 생산을 위한 것이므로 희소 매트릭스 결정 스크리닝에는 적합하지 않습니다. 따라서 결정화 조건에 대한 사전 지식은 주어진 단백질 샘플에 대한 초기 온칩 결정화 시험을 설정하는 데 필요합니다.
실제로 심에 기름을 바르는 방법(1.2단계) 및 장치를 밀봉하는 방법(2.3단계)과 같은 일부 장치 조립 단계는 사소해 보이지만 종종 결정화 결과에 직접적인 영향을 미친다는 것을 알게 되었습니다. 기름칠이 제대로 이루어지지 않으면 장치가 빨리 마를 수 있습니다. 또한 조립의 최종 단계에서 장치를 과도하게 조이면 석영 웨이퍼가 변형될 수 있으며, 조임이 부족하면 장치에서 잠재적인 누출 및/또는 제어되지 않은 증발이 발생할 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계는 X- 레이 촬영을 계획하는 것입니다. 종종 처리하기 어려운 회절 패턴이 겹치지 않도록 클러스터되거나 붐비는 결정을 조심스럽게 다루어야합니다. 이 문제는 마이크로 포커싱 X 선 빔을 사용하여 완화 할 수 있습니다. 잠재적으로 결정 형태가 큰 얇은 판이어서 대부분의 판이 석영 창과 평행한 경우 완전한 데이터 세트를 얻기 어려울 수 있습니다. 또한 단결정 석영 칩은 기름과 단백질 파편을 제거하는 비누 및 유기 용제를 포함하는 세척 절차 후에 재활용 및 재사용 할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 섬세한 칩의 약 80-90 %는 다음 실험을 위해 손상없이 청소할 수 있습니다. 마이크로 포커싱 빔라인에 있는 작은 크리스탈의 경우, 크리스털 포지셔닝에서 더 나은 정밀도를 달성해야 하는 경우 더 미세한 모터, 더 나은 카메라 및 광학, 더 큰 배율 등과 같은 여러 하드웨어 구성 요소를 업그레이드할 수 있습니다. 그러나 이들 중 어느 것도 최첨단 제한에 가깝지 않습니다. 따라서 큰 어려움 없이 개선할 수 있는 충분한 공간이 있습니다.
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Disclosures
ZR은 Renz Research, Inc.에 부여된 미국 특허 9632042 크리스탈 온 크리스탈 칩의 발명가입니다.
Acknowledgments
아르곤 국립 연구소가 미국 에너지부를 위해 운영하는 과학 사용자 시설의 사무실 인 Advanced Photon Source의 사용은 계약 DE-AC02-06CH11357에 의해 지원되었습니다. BioCARS의 사용은 국립 보건원의 국립 일반 의학 연구소에서 보조금 번호 R24GM111072로 지원했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. LS-CAT 섹터 21의 사용은 미시간 경제 개발 공사와 미시간 기술 트라이 코리더 보조금 085P1000817의 지원을 받았습니다. 이 작업은 시카고 일리노이 대학교, 국립 보건원 (R01EY024363) 및 국립 과학 재단 (MCB 2017274)의 XY에 대한 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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