Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

On-chip krystallisering og storskala seriell diffraksjon ved romtemperatur

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63022
* These authors contributed equally

Summary

Dette bidraget beskriver hvordan du setter opp proteinkrystallisering på krystall-mot-krystall-enheter og hvordan du utfører automatisert seriell datainnsamling ved romtemperatur ved hjelp av krystalliseringsplattformen på brikken.

Abstract

Biokjemiske reaksjoner og biologiske prosesser kan best forstås ved å demonstrere hvordan proteiner overgår mellom sine funksjonelle tilstander. Siden kryogene temperaturer er ikke-fysiologiske og kan forhindre, avskrekke eller til og med endre proteinstrukturell dynamikk, er en robust metode for rutinemessige røntgendiffraksjonseksperimenter ved romtemperatur svært ønskelig. Krystall-på-krystall-enheten og tilhørende maskinvare og programvare som brukes i denne protokollen, er designet for å muliggjøre in situ røntgendiffraksjon ved romtemperatur for proteinkrystaller av forskjellige størrelser uten prøvemanipulering. Her presenterer vi protokollene for de viktigste trinnene fra enhetsmontering, on-chip krystallisering, optisk skanning, krystallgjenkjenning til røntgenbildeplanlegging og automatisert datainnsamling. Siden denne plattformen ikke krever krystallhøsting eller annen prøvemanipulering, kan hundrevis til tusenvis av proteinkrystaller dyrket på chip innføres i en røntgenstråle på en programmerbar og høy gjennomstrømningsmåte.

Introduction

På grunn av de ioniserende effektene av røntgenstråling har proteinkrystallografi i stor grad vært begrenset til kryogene forhold de siste tre tiårene. Derfor oppstår den nåværende kunnskapen om proteinbevegelser under funksjonen i stor grad fra sammenligninger mellom statiske strukturer observert i forskjellige tilstander under kryogene forhold. Imidlertid hindrer kryogene temperaturer uunngåelig utviklingen av en biokjemisk reaksjon eller interkonversjon mellom forskjellige konformasjonstilstander mens proteinmolekyler er på jobb. For å direkte observere proteinstrukturdynamikk ved atomoppløsning ved krystallografi, er det nødvendig med robuste og rutinemessige metoder for å gjennomføre diffraksjonseksperimenter ved romtemperatur, noe som krever tekniske innovasjoner innen prøvelevering, datainnsamling og bakre dataanalyse. For dette formål har nylige fremskritt innen seriell krystallografi tilbudt nye veier for å fange molekylære bilder av mellomprodukter og kortvarige strukturelle arter ved romtemperatur 1,2,3. I motsetning til "en-krystall-en-datasett" -strategien som er mye brukt i konvensjonell kryokrystallografi, vedtar seriell krystallografi en datainnsamlingsstrategi som ligner på enkeltpartikkelkryo-elektronmikroskopi. Spesielt samles eksperimentelle data i seriell krystallografi i små fraksjoner fra et stort antall individuelle prøver, etterfulgt av intensiv databehandling der datafraksjoner evalueres og kombineres til et komplett datasett for 3D-strukturbestemmelse4. Denne "one-crystal-one-shot" -strategien letter effektivt røntgenstrålingsskaden på proteinkrystaller ved romtemperatur via en diffraksjon før ødeleggelsesstrategi5.

Siden seriell krystallografi krever et stort antall proteinkrystaller for å fullføre et datasett, utgjør det store tekniske utfordringer for mange biologiske systemer der proteinprøver er begrensede og / eller delikat krystallhåndtering er involvert. En annen viktig vurdering er hvordan man best kan bevare krystallintegritet i serielle diffraksjonseksperimenter. In situ-diffraksjonsmetodene adresserer disse bekymringene ved å la proteinkrystaller diffraktere direkte fra der de vokser uten å bryte forseglingen til krystallisasjonskammeret 6,7,8,9. Disse håndteringsfrie metodene er naturlig kompatible med seriell diffraksjon i stor skala. Vi har nylig rapportert design og implementering av en krystallisasjonsanordning for in situ diffraksjon basert på et krystall-på-krystall-konsept - proteinkrystaller dyrket direkte på monokrystallinsk kvarts11. Denne "krystall-på-krystall" -enheten gir flere fordeler. For det første har den et røntgen- og lysgjennomsiktig vindu laget av et monokrystallinsk kvartssubstrat, noe som gir liten bakgrunnsspredning, noe som resulterer i gode signal-til-støy-forhold i diffraksjonsbilder fra proteinkrystaller. For det andre er enkeltkrystallkvarts en utmerket dampbarriere som tilsvarer glass, og gir dermed et stabilt miljø for proteinkrystallisering. I motsetning til dette er andre krystallisasjonsanordninger som bruker polymerbaserte substrater utsatt for tørking på grunn av dampgjennomtrengelighet, med mindre polymermaterialet har en betydelig tykkelse, noe som følgelig bidrar til høy bakgrunnsspredning10. For det tredje muliggjør denne enheten levering av et stort antall proteinkrystaller til røntgenstrålen uten noen form for krystallmanipulering eller høsting, noe som er kritisk for å bevare krystallintegritet11.

For å strømlinjeforme serielle røntgendiffraksjonseksperimenter ved hjelp av krystall-på-krystall-enhetene, har vi utviklet en diffraktometerprototype for å lette enkelt bytte mellom optisk skanning og røntgendiffraksjonsmodus12. Dette diffraktometeret har et lite fotavtrykk og har blitt brukt til seriell datainnsamling ved to strålelinjer av Advanced Photon Source (APS) ved Argonne National Laboratory. Spesielt brukte vi BioCARS 14-ID-B for Laue-diffraksjon og LS-CAT 21-ID-D for monokromatisk oscillasjon. Denne diffraktometermaskinvaren er ikke nødvendig hvis en synkrotron- eller røntgenfri elektronlaserstrålelinje er utstyrt med to nøkkelfunksjoner: (1) motorisert prøveposisjonering med et vandringsområde på ±12 mm rundt røntgenstrålen i alle retninger; og (2) et digitalt kamera på aksen for krystallvisning under lysbelysning som er trygt å proteinkrystaller under studien. Den monokrystallinske kvartsenheten sammen med et bærbart diffraktometer og kontrollprogramvaren for optisk skanning, krystallgjenkjenning og automatisert in situ datainnsamling utgjør samlet inSituX-plattformen for seriell krystallografi. Selv om denne utviklingen først og fremst er motivert av sine dynamiske krystallografiapplikasjoner ved hjelp av en polykromatisk røntgenkilde, har vi demonstrert potensialet til denne teknologien for å støtte monokromatiske oscillasjonsmetoder10,12. Med automatisering tilbyr denne plattformen en seriell datainnsamlingsmetode med høy gjennomstrømning ved romtemperatur med rimelig proteinforbruk.

I dette bidraget beskriver vi i detalj hvordan man setter opp on-chip krystallisering i et vått laboratorium og hvordan man utfører seriell røntgendatainnsamling ved en synkrotronstrålelinje ved hjelp av inSituX-plattformen.

Batchmetoden brukes til å sette opp on-chip krystallisering under en tilstand som ligner på dampdiffusjonsmetoden oppnådd for samme proteinprøve (tabell 1). Som utgangspunkt anbefaler vi å bruke nedbør ved 1,2-1,5x konsentrasjon av det for dampdiffusjonsmetoden. Om nødvendig kan batchkrystalliseringstilstanden optimaliseres ytterligere via fin rutenettscreening. Kvartsskiver er ikke nødvendige for optimaliseringsforsøk; Glassdeksler kan brukes i stedet (se nedenfor). Delvis belastede krystalliseringsenheter anbefales for å holde optimaliseringsforsøk i mindre skala. En rekke proteinprøver har blitt krystallisert på slike enheter ved hjelp av batchmetoden10 (tabell 1).

Selve enheten består av følgende deler: 1) en ytre ring; 2) to kvartsskiver; 3) en vaskemaskinlignende mellomlegg av plast eller rustfritt stål; 4) en festering; 5) mikroskop nedsenkningsolje som tetningsmasse (figur 1). Det totale volumet av krystallisasjonsløsningen lastet på en brikke avhenger av formålet med forsøket. Krystallisasjonskammerets kapasitet kan justeres ved å velge et mellomlag med forskjellige tykkelser og/eller indre diameter. Vi setter rutinemessig opp krystalliseringsanordninger på 10-20 μL i kapasitet ved bruk av mellomlegg på 50-100 μm i tykkelse. En typisk enhet kan produsere titusenvis av proteinkrystaller som er tilstrekkelige for seriell datainnsamling (figur 2).

Når det lykkes, vil on-chip krystallisering produsere titalls til hundrevis eller tusenvis av proteinkrystaller på hver kvartsenhet klar for røntgendiffraksjon. Ved en synkrotronstrålelinje er en slik anordning montert på et treakset oversettelsestrinn av diffraktometeret ved hjelp av en kinematisk mekanisme. Krystalliseringsvinduet til en montert enhet skannes optisk og avbildes i titalls til hundrevis av mikrografer. Disse mikrografiene blir deretter sydd inn i en høyoppløselig montasje. For lysfølsomme krystaller kan optisk skanning utføres under infrarødt (IR) lys for å unngå utilsiktet fotoaktivering. En datasynsprogramvare er utviklet for å identifisere og lokalisere proteinkrystaller tilfeldig fordelt på enheten. Disse krystallene blir deretter rangert i henhold til deres størrelse, form og posisjon for å informere eller veilede datainnsamlingsstrategien i seriell krystallografi. For eksempel kan ett eller flere skudd være plassert på hver målrettet krystall. Brukere kan planlegge en enkelt pass eller flere ruter gjennom målrettede krystaller. Vi har implementert programvare for å beregne ulike reiseruter. For eksempel beregnes den korteste ruten ved hjelp av algoritmer som adresserer det reisende selgerproblemet13. For dynamiske krystallografiske applikasjoner med pumpesonde kan tidspunktet og varigheten av laser- (pumpe) og røntgenbilder (sonde) velges. En automatisert seriell datainnsamling er programmert til å translokere hver målrettet krystall inn i røntgenstrålen etter hverandre.

Nøkkelkomponentene i insituX-diffraktometeret inkluderer: 1) en enhetsholder; 2) et treakset oversettelsesstadium; 3) en lyskilde for optisk skanning; 4) en røntgenstrålestopp; 5) pumpe lasere hvis lysfølsomme proteiner studeres; 6) Raspberry Pi mikrodatamaskin utstyrt med et IR-følsomt kamera; 7) kontrollprogramvare for å synkronisere motorer, kamera, lyskilder, pumpelaser og grensesnitt med strålelinjekontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forhåndsmontering av enheten

  1. Merk den ytre ringen (30 mm diameter) for prøveidentifikasjon. Ta om nødvendig med prosjektnavn, enhetsnummer, krystalliseringsbetingelse og dato (figur 1A). Plasser den ytre ringen opp ned på en ren overflate (figur 1B), og plasser forsiktig en kvartsskive inne i ringen (figur 1C). Denne første kvartsplaten fungerer som et inngangsvindu for hendelsesrøntgenstrålene.
  2. Hell en liten mengde mikroskop nedsenkningsolje (viskositet på 150 cSt) i en petriskål. Dypp et mellomlegg i oljen, og sørg for at begge sider av mellomlegget er riktig oljet (figur 1D). Fjern overflødig olje ved å dabbe mellomlegget på en ren overflate.
  3. Plasser det oljede mellomlaget oppå den første kvartsskiven (figur 1E).
    MERK: Nedsenkningsolje er et utmerket tetningsmiddel som beskytter krystalliseringskammeret mot potensielt damptap. Riktig monterte sjetonger varer vanligvis i flere uker uten synlig tørking. Dette forhåndsmonteringstrinnet utføres under romlys. For lysfølsomme prøver må alle påfølgende trinn, inkludert prøvelasting, lagring av enheter og observasjon, utføres under sikkerhetslys.

2. Prøveinnlasting og enhetsmontering

  1. Bruk en pipette til å blande proteinoppløsningen og krystallisasjonsbufferen grundig på den første kvartsskiven. Volumforholdet mellom proteinprøven og bufferen varierer vanligvis fra 2: 1 til 1: 2 (figur 1F). Forsikre deg om at det totale volumet av krystallisasjonsløsningen ikke overskrider krystallisasjonskammerets maksimale kapasitet bestemt av mellomstykkets størrelse og tykkelse. Unngå luftbobler under blanding.
    MERK: Sammensetningen av en krystallisasjonsbuffer varierer fra ett eksperiment til et annet. Se tabell 1 for krystallisasjonsbetingelser.
  2. Plasser den andre kvartsplaten over den blandede oppløsningen når oppløsningen begynner å spre seg (figur 1G). Denne andre kvartsskiven fungerer som utgangsvinduet til de diffrakterte røntgenstrålene.
  3. Trykk lett på den andre kvartsskiven på kanten for å spre oljen mens du skyver luft ut. Fest enheten ved å skru en festering inn i den ytre ringen (figur 1H). Bruk om nødvendig et tiltrekkingsverktøy (figur 1I). Vær oppmerksom på at overstramming kan føre til at delikate kvartsskiver deformeres eller til og med sprekker.

3. Optimalisering av enhetslagring og krystallisering

  1. Oppbevar de monterte enhetene (figur 1J) i en boks ved romtemperatur eller inne i en inkubator med temperaturkontroll.
    MERK: Proteinkrystaller kan vises om noen timer til dager etter at en krystalliseringsenhet er montert. Typiske resultater fra on-chip krystallisering er vist for flere representative proteinprøver (figur 2).
  2. Overvåk krystallvekst ved å observere krystallisasjonsenheten under et mikroskop. Optimaliser om nødvendig krystallisasjonsbetingelsene ved iterasjoner av §§ 1-3.

4. Kalibrering

MERK: Programmene og kommandoene som er nevnt i avsnittene nedenfor, kjøres i inSituX-programvare.

  1. Monter en tynn krystall av dopet yttrium aluminiumsgranat på sponholderen (figur 3). Monter strålestoppet. Ta røntgenfluorescensbilder av direktestrålen ved å kjøre programmet:
    burnmark.py .param
    der er et brukervalgt navn for krystallisasjonsenheten. .param er et filnavn som inneholder enhetsspesifikke kontrollparametere. Standardverdiene vil gradvis bli erstattet av spesifikke verdier langs protokollen. Et eksempel .param-fil vises i tilleggsfil 1.
  2. Finn den nøyaktige posisjonen til den direkte røntgenstrålen ved å kjøre stråleprofiltilpasningsprogrammet:
    beam.py -d
    der er filnavnet til røntgenfluorescensbildet (figur 4).
    MERK: Dette programmet beregner de nøyaktige direkte stråleposisjonene samt strålestørrelsen. Stråleposisjonen markerer translokasjonsdestinasjonen for alle krystaller fra samme enhet. Strålestørrelsen brukes også til målplanlegging.

5. Optisk skanning

  1. Plasser en krystalliseringsenhet i sponholderen og fest enheten med en tommelskrue (figur 3A).
  2. Monter sponholderen på translasjonstrinnet til diffraktometeret gjennom en kinematisk mekanisme (figur 3B).
  3. Installer en riktig lyskilde for å ta mikrografer fra det optiske vinduet på enheten. Hvitt lys, IR-lys eller annet valgt lys kan brukes avhengig av lysfølsomheten til proteinprøven, samt formålet med eksperimentet.
  4. Kjør skanneprogrammet:
    scan.py .param
    Dette programmet fanger et sett med mikrografer som automatisk overføres til spesifiserte brukerdatamaskiner.
  5. Kjør flisleggingsprogrammet på en brukerdatamaskin:
    tile.py -x -y
    der < x > og er startverdiene for henholdsvis kolonne- og radforskyvninger av mikrografer. Dette programmet syr alle mikrografer til en montasje på 1-3 μm / pikseloppløsning (figur 5).
    MERK: Trinn 5.4 og 5.5 tar vanligvis noen minutter. Totalt antall mikrografer varierer fra flere titalls til hundrevis, avhengig av skanneområdet og forstørrelsen.
  6. Kjør krystallsøkingsprogrammet:
    findX.py -c -w -x
    hvor er det flislagte bildet. Dette programmet utfører krystallgjenkjenning og skuddplanlegging. og angir krystallstørrelsen som finnes. Hvis brukeren ønsker å unngå mindre krystaller, kan brukes som en avskjæring ved å sette et tall større enn størrelsene på uønskede små krystaller. er en vinkelverdi som setter toleransen for krystaller med uregelmessig form. refererer til den direkte strålestørrelsen oppnådd fra profilmonteringen ovenfor (trinn 4.2; Figur 4). En nominell verdi kan også settes av brukere for å ytterligere plassere ut målrettede skudd. Disse nøkkelparametrene muliggjør spesifikk krystallvalg og målplanlegging (figur 6).

6. Røntgendiffraksjon

  1. Fjern lyskilden og installer strålestoppet. Still inn en passende detektoravstand. Følg beamline sikkerhetsprotokollen for å søke i røntgenhytten. Åpne røntgenlukkeren og laserlukkeren hvis det er aktuelt.
  2. Kjør datainnsamlingsprogrammet for seriell diffraksjon:
    collect.py .param -l
    Denne kommandoen utløser datainnsamling der alle planlagte bilder besøkes etter hverandre i henhold til en forhåndsprogrammert sekvens. Hver målrettet krystall translokeres til stråleposisjonen (trinn 4.2). Ved hvert stopp tas røntgeneksponering med eller uten laserbelysning ved en planlagt tidsforsinkelse. Film 1 viser en automatisert datainnsamlingssekvens som drives med en frekvens på 1 Hz. Rutinemessig samles titalls til hundrevis av diffraksjonsbilder fra en enkelt krystalliseringsenhet (Movie 2).
    MERK: Seksjon 4 kalibrering og seksjon 5 optisk skanning er selvstendig i inSituX-plattformen, derfor helt overførbar til en annen strålelinje. § 6 Røntgendiffraksjon må innebære noen detaljer i strålelinjedriften.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flere representative datasett har blitt publisert I løpet av de siste årene har 10,12 sammen med de krystallografiske resultatene og vitenskapelige funnene fra et mangfoldig utvalg av proteinprøver, inkludert fotoreceptorproteiner og enzymer, for eksempel en plante UV-B fotoreceptor UVR8, en lysdrevet DNA-reparasjonsfotolyase PhrB10, et nytt langt rødt lysfølende protein fra et multi-domene sensorisk histidinkinase 14 , ligand/lys dual-sensor domener, og den fotosensoriske kjernemodulen til en bakteriofytokrom12. Som representative resultater viser vi krystalliseringsbetingelsene for disse proteinene i tabell 1, og sammenligner dem direkte med betingelsene som brukes til dampdiffusjonsmetoden. Her viser vi ytterligere fire casestudier av on-chip krystallisering (figur 2) og en samling in situ diffraksjonsmønstre i en film (film 2). Representative in situ datasett samlet inn ved hjelp av denne protokollen er oppsummert i tabell 2.

I et representativt tilfelle ga kryokrystallografi opphav til dårlig diffraksjon for et fotoreseptorprotein med langt rødt lys, sannsynligvis på grunn av lysfølsomhet og høyt løsningsmiddelinnhold (~ 80%) av disse krystallene14. Elektrondensitetene oppnådd fra kryokrystallografidataene var for smurt til å løse kromoforkonformasjonen, som er i sentrum av vårt vitenskapelige spørsmål. Ved hjelp av in situ-protokollen kunne vi unngå utilsiktet lysaktivering før diffraksjon og fikk et mørkt datasett ved romtemperatur fra mer enn 800 krystaller. Dette mørke datasettet fra in situ seriell Laue-diffraksjon resulterte i bedre løste elektrontettheter, noe som muliggjør sikker modellbygging av en bilinkromofor som utviser en hittil ukjent all-Z, syn-konformasjon (figur 7A) 12,14. Våre dynamiske krystallografieksperimenter har videre avslørt lysinduserte endringer i dette langt røde fotoreseptorproteinet ved å sammenligne data fra 4.352 krystaller i mørke og 8.287 krystaller etter lysbelysning (figur 7). En foreløpig analyse av de lysinduserte forskjellskartene har avslørt samordnede bevegelser i det sentrale β-arket, noe som antyder viktigheten av π-π stabling mellom pyrrolringene til kromoforen og flere aromatiske rester (figur 7B, C). En grundig analyse og vitenskapelige funn vil bli presentert andre steder.

Figure 1
Figur 1: Sammenstilling av krystalliseringsenheter. Hver montering anslås å koste US $ 30 med to monokrystallinske kvartsskiver eller US $ 10 med to glassdeksel. Maskinvarekomponenter unntatt mellomlegget er gjenbrukbare. (A) Den flate siden av den ytre ringen er merket for identifikasjonsformål. (B) Den ytre ringen er plassert opp ned på en ren overflate. (C) En kvarts wafer på 1 tomme i diameter er nøye plassert inne. En glassbrikke kan også brukes i stedet under krystalliseringsforsøk, men er ikke kompatibel med røntgendiffraksjon. (D) Begge sider av mellomlegget er oljet. (E) Det oljede mellomlaget er plassert på den første kvartsbrikken. (F) Protein- og krystalliseringsløsninger pipetteres til midten av brikken og blandes. (G) En annen kvarts- eller glassbrikke dekker dråpen slik at den sprer seg jevnt over brikken. (H) En festering skrus over den andre kvartsskiven. (I) Et strammeverktøy brukes til å stramme holderringen forsiktig. (J) En fullt montert enhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative proteinkrystaller dyrket på kvartsenheter. (A) Den fotosensoriske kjernemodulen til en bakteriofytokrom (Pa497 i tabell 1). (B,C) Ulike konstruksjoner av det tredje GAF-domenet fra en multi-domene sensorisk histidinkinase (2551g3 og 2551g3Δα1 i tabell 1). (D) Tandemsensordomenene fra en histidinkinase med to sensorer (RECGAF i tabell 1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: inSituX diffractometer . (A) En krystalliseringsanordning er montert i sponholderen. Selv om enheten er montert vertikalt, kommer krystaller dyrket på chip ikke til å falle, først og fremst fordi væskelaget i en montert enhet er veldig tynt, og krystaller er forankret til kjernene når de vokser. (B) En IR-lyskilde er installert for optisk skanning. Kameraet fanger inline-visningen av proteinkrystallene langs røntgenstrålen gjennom et prismespeil (ikke synlig på bildet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Direkte stråleprofilmontering. De røde, grønne og blå kanalene i røntgenfluorescensbildet brukes til å passe til en todimensjonal Gaussisk funksjon. Venstre kolonne viser råbildet av de røde, grønne og blå kanalene. Den midterste kolonnen er tilpasningsresultatet med den nøyaktige stråleposisjonen og størrelsen. Den høyre kolonnen viser de passende restene. Hvis amplituden til monteringsrestene spenner over en liten brøkdel av råbildet, er profiltilpasningen til den direkte strålen vellykket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bildefliser . (A) En rekke krystallmikrografier fanges opp under en optisk skanning. Den optiske skanningen og dataoverføringen tar vanligvis 1-2 minutter. Tilstøtende mikrografer deler en stripe med overlappende område, horisontalt og vertikalt, som markert med gule bokser. (B) Mikrografer er sydd sammen for å lage en høyoppløselig montasje basert på den optimale korrelasjonen i de overlappende områdene. Denne prosessen tar vanligvis et minutt på en bærbar datamaskin. Den gule boksen skisserer området fanget av 2 x 2 mikrografer vist i (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Krystallgjenkjenning og skuddplanlegging. Hver rosa sirkel markerer det primære skuddet av en krystall. De gule sirklene markerer flere skudd hvis en krystall er lang nok til å plassere disse bildene. De rosa linjene markerer en rute som en løsning på det reisende selgerproblemet. Grupperte krystaller og mindre krystaller unngås i stor grad. Aggressiviteten til krystallfunn kan justeres som et alternativ til findX.py (trinn 5.6). En brute force "overkill" -strategi ville ikke etterlate krystall un-shot, men kunne produsere mange diffraksjonsbilder, men ikke prosessbare12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Elektrondensitetskart over fjernlyssensordomenet til en histidinkinase . (A) 2Fo-Fc-kartet konturert ved 2,5σ viser elektrontetthetene assosiert med bilinkromoforen i en all-Z,syn-konformasjon 14. Pyrrolringer A til D er merket. (B og C) Lys-mørke forskjellskart konturert ved ±2,5σ i henholdsvis grønt og rødt, fremhever forsterkning og tap av elektrontettheter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammenligning av krystallisasjonsbetingelser mellom dampdiffusjon og batchmetode på brikken. Dampdiffusjon og batchmetoder for krystallisering er høyt korrelert 10,14,15,16,17,18,19. Med utgangspunkt i en dampdiffusjonstilstand kan en lignende tilstand optimaliseres for krystallisering på brikken. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Sammendrag av in situ datasett samlet direkte fra kvartsenheter. Tusenvis av Laue-diffraksjonsmønstre kan samles fra flere krystalliseringsenheter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Film 1: En liksom-datainnsamling. Målrettede krystaller translokeres til røntgenstrålen som markert med en rød sirkel. Sekvensen av de målrettede krystallene i denne filmen følger ikke en løsning på det reisende selgerproblemet. Laser- og røntgeneksponeringer avfyres ved hvert stopp med en programmert forsinkelse. Diffraksjonsbilder samles inn. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Film 2: Diffraksjonsbilder. Hundrevis av diffraksjonsbilder kan samles fra en enkelt krystalliseringsenhet. Flere enheter er tilstrekkelige til å produsere et komplett og svært redundant datasett (tabell 2). Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Tilleggsfil 1: Eksempel .param-fil. En liten tekstfil samler noen kontrollparametere som er spesifikke for hver krystalliseringsenhet. Disse parameterne starter med standardverdiene og vil bli endret tilsvarende i avsnitt 4, 5 og 6 etter hvert som protokollen fortsetter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Proteinkrystallografi i de tidlige årene utført ved romtemperatur opplevde enorme vanskeligheter med å bekjempe røntgenstrålingsskader. Dermed har den blitt erstattet av den mer robuste kryokrystallografimetoden da synkrotronrøntgenkilder ble lett tilgjengelige20. Med fremkomsten av røntgenfrie elektronlasere har romtemperaturproteinkrystallografi blitt gjenopplivet de siste årene, med mange nye utviklinger drevet av et ønske om å observere proteinstrukturdynamikk ved en fysiologisk relevant temperatur 2,21. Utviklingen av inSituX-plattformen basert på krystall-mot-krystall-enhetene har vært motivert av den samme ambisjonen, det vil si å etablere rutinemessige og robuste datainnsamlingsmetoder for dynamiske krystallografistudier ved romtemperatur. Denne automatiserte serielle røntgendiffraksjonsmetoden gjelder også for statisk strukturbestemmelse for proteinkrystaller som ikke kan fryses14. I denne protokollen presenterer vi viktige tekniske hensyn sammen med kritiske trinn som trengs for å levere datainnsamling ved hjelp av denne plattformen. Denne metoden er spesielt egnet for skjøre proteinkrystaller som er følsomme for mekanisk håndtering, røntgenstrålingsskader eller lufteksponering.

Plattformprototypen har blitt grundig testet ved to proteinkrystallografistrålelinjer ved Advanced Photon Source (APS) fra Argonne National Laboratory. Selv om det er ganske enkelt å sette opp krystallisering på brikken i henhold til denne protokollen, involverer datainnsamlingstrinnet flere skreddersydde maskinvare- og programvarekomponenter. Som et resultat kan anvendelsen og implementeringen av prosjektspesifikke datainnsamlingsstrategier kreve nært samarbeid mellom brukere og beamline-forskere. Med andre ord er denne teknologien i sin nåværende form begrenset til de brukerne som har tilstrekkelig tilgang til synkrotroner som APS. Likevel vil den generelle arbeidsflyten og viktige trinn beskrevet i denne protokollen tjene som referanse eller veiledning for enhver forskningsgruppe som er interessert i romtemperaturproteinkrystallografi.

Den viktigste fordelen med denne plattformen er at det ikke kreves krystallmanipulering som montering eller frysing slik at delikate proteinkrystaller diffrakteres under uberørte forhold. En annen stor fordel er at bruken av det monokrystallinske kvartssubstratet gir svært liten bakgrunnsspredning til proteindiffraksjonsbilder, samtidig som det gir stabile miljøer for proteinkrystallisering over lang tid (uker til måneder). Denne plattformen er imidlertid ikke egnet for sparsom matrisekrystallscreening, da den er beregnet for storskala krystallproduksjon. Som sådan er det nødvendig med forkunnskaper om krystallisasjonsbetingelser for å sette opp innledende krystalliseringsforsøk på brikken for en gitt proteinprøve.

I praksis finner vi at noen enhetsmonteringstrinn, for eksempel hvordan du oljer en mellomlegg (trinn 1.2) og hvordan du forsegler en enhet (trinn 2.3), så triviell som de virker, ofte direkte påvirker resultatene av krystallisering. En enhet kan tørke ut raskt hvis oljing ikke gjøres riktig. I tillegg kan overstramming av enheten i det siste monteringstrinnet deformere kvartsskivene, mens understramming fører til potensielle lekkasjer og / eller ukontrollert fordampning fra enheten. Et annet kritisk skritt er å planlegge røntgenbilder. Man må nøye håndtere grupperte eller overfylte krystaller for å unngå overlappende diffraksjonsmønstre som ofte er vanskelige å behandle. Dette problemet kan lindres ved bruk av en mikrofokuserende røntgenstråle. Potensielt kan et komplett datasett være vanskelig å oppnå hvis krystallmorfologien er en stor tynn plate, slik at de fleste platene er parallelle med kvartsvinduene. I tillegg kan enkeltkrystallkvartsflisene resirkuleres og gjenbrukes etter en rengjøringsprosedyre som involverer såpe og organiske løsningsmidler som fjerner olje- og proteinrester. Vanligvis kan omtrent 80-90% av disse delikate sjetongene rengjøres uten skade for de neste forsøkene. Når det gjelder små krystaller på en mikrofokusert strålelinje, når bedre presisjon må oppnås i krystallposisjonering, kan flere maskinvarekomponenter oppgraderes, for eksempel finere motorer, bedre kamera og optikk, større forstørrelse, etc. Imidlertid er ingen av disse i nærheten av de nyeste begrensningene. Derfor er god plass tilgjengelig for forbedring uten store problemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ZR er oppfinneren av krystall-på-krystall-brikkene på det amerikanske patentet 9632042 gitt til Renz Research, Inc.

Acknowledgments

Bruk av Advanced Photon Source, et Office of Science User Facility operert for US Department of Energy av Argonne National Laboratory, ble støttet av kontrakt DE-AC02-06CH11357. Bruk av BioCARS ble støttet av National Institute of General Medical Sciences ved National Institutes of Health under tilskuddsnummer R24GM111072. Innholdet er utelukkende forfatterens ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Bruk av LS-CAT Sector 21 ble støttet av Michigan Economic Development Corporation og Michigan Technology Tri-Corridor grant 085P1000817. Dette arbeidet støttes av tilskudd fra University of Illinois i Chicago, National Institutes of Health (R01EY024363) og National Science Foundation (MCB 2017274) til XY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Outer ring In-house developed
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
Pump lasers Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
  2. Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).
  3. Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).
  4. Nogales, E., Scheres, S. H. W. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).
  5. Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. Diffraction before destruction. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313 (2014).
  6. Kisselman, G., et al. X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).
  7. Liang, M., et al. Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).
  8. le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).
  9. Perry, S. L., et al. In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device. Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).
  10. Ren, Z., et al. Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature. Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).
  11. Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).
  12. Ren, Z., et al. An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature. IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).
  13. Croes, G. A. A method for solving traveling salesman problems. Operations Research. 6, 791-812 (1958).
  14. Bandara, S., et al. Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118 (2021).
  15. Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).
  16. Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome. Nature. 479, 428-432 (2011).
  17. Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).
  18. Zeng, X., et al. Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8. Nature Plants. 1, 14006 (2015).
  19. Wang, M., et al. Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex. Biochemistry. 50, 581-590 (2011).
  20. Rodgrs, D. W. Cryocrystallography. Structure. 2, 1135-1140 (1994).
  21. Zhao, F. -Z., et al. A guide to sample delivery systems for serial crystallography. TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).

Tags

Biokjemi utgave 181
On-chip krystallisering og storskala seriell diffraksjon ved romtemperatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biju, L. M., Wang, C., Kang, W.,More

Biju, L. M., Wang, C., Kang, W., Tom, I. P., Kumarapperuma, I., Yang, X., Ren, Z. On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature. J. Vis. Exp. (181), e63022, doi:10.3791/63022 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter