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Biochemistry

Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63022
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, University of Illinois at Chicago, 2Department of Ophthalmology and Vision Sciences, University of Illinois at Chicago, 3Renz Research, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Esta contribución describe cómo configurar la cristalización de proteínas en dispositivos de cristal sobre cristal y cómo realizar la recopilación automatizada de datos en serie a temperatura ambiente utilizando la plataforma de cristalización en chip.

Abstract

Las reacciones bioquímicas y los procesos biológicos se pueden entender mejor demostrando cómo las proteínas hacen la transición entre sus estados funcionales. Dado que las temperaturas criogénicas no son fisiológicas y pueden prevenir, disuadir o incluso alterar la dinámica estructural de las proteínas, es muy deseable un método robusto para experimentos rutinarios de difracción de rayos X a temperatura ambiente. El dispositivo de cristal sobre cristal y el hardware y software que lo acompañan utilizados en este protocolo están diseñados para permitir la difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente para cristales de proteínas de diferentes tamaños sin ninguna manipulación de la muestra. Aquí presentamos los protocolos para los pasos clave desde el ensamblaje del dispositivo, la cristalización en chip, el escaneo óptico, el reconocimiento de cristales hasta la planificación de tomas de rayos X y la recopilación automatizada de datos. Dado que esta plataforma no requiere recolección de cristales ni ninguna otra manipulación de muestras, cientos o miles de cristales de proteínas cultivados en chip se pueden introducir en un haz de rayos X de una manera programable y de alto rendimiento.

Introduction

Debido a los efectos ionizantes de la radiación de rayos X, la cristalografía de proteínas, en gran medida, se ha limitado a condiciones criogénicas en las últimas tres décadas. Por lo tanto, el conocimiento actual de los movimientos de las proteínas durante su función surge en gran medida de las comparaciones entre estructuras estáticas observadas en diferentes estados bajo condiciones criogénicas. Sin embargo, las temperaturas criogénicas inevitablemente dificultan la progresión de una reacción bioquímica o interconversión entre diferentes estados conformacionales mientras las moléculas de proteínas están trabajando. Para observar directamente la dinámica estructural de las proteínas a resolución atómica por cristalografía, se necesitan métodos robustos y rutinarios para realizar experimentos de difracción a temperatura ambiente, lo que requiere innovaciones técnicas en la entrega de muestras, la recopilación de datos y el posterior análisis de datos. Con este fin, los avances recientes en cristalografía en serie han ofrecido nuevas vías para capturar imágenes moleculares de especies estructurales intermedias y de vida corta a temperatura ambiente 1,2,3. En contraste con la estrategia de "un cristal, un conjunto de datos" ampliamente utilizada en la criocristalografía convencional, la cristalografía en serie adopta una estrategia de recopilación de datos similar a la de la microscopía crioelectrónica de una sola partícula. Específicamente, los datos experimentales en cristalografía en serie se recopilan en pequeñas fracciones de un gran número de muestras individuales, seguidas de un procesamiento intensivo de datos en el que las fracciones de datos se evalúan y combinan en un conjunto de datos completo para la determinación de la estructura 3D4. Esta estrategia de "un cristal, un disparo" alivia efectivamente el daño de la radiación de rayos X a los cristales de proteínas a temperatura ambiente a través de una estrategia de difracción antes de la destrucción5.

Dado que la cristalografía en serie requiere una gran cantidad de cristales de proteínas para completar un conjunto de datos, plantea grandes desafíos técnicos para muchos sistemas biológicos donde las muestras de proteínas son limitadas y / o se trata de un delicado manejo de cristales. Otra consideración importante es cómo preservar mejor la integridad cristalina en experimentos de difracción en serie. Los métodos de difracción in situ abordan estas preocupaciones al permitir que los cristales de proteínas se difracten directamente desde donde crecen sin romper el sello de la cámara de cristalización 6,7,8,9. Estos métodos sin manipulación son naturalmente compatibles con la difracción en serie a gran escala. Recientemente hemos informado sobre el diseño e implementación de un dispositivo de cristalización para difracción in situ basado en un concepto de cristal sobre cristal: cristales de proteínas cultivados directamente en cuarzo monocristalino11. Este dispositivo "cristal sobre cristal" ofrece varias ventajas. En primer lugar, cuenta con una ventana transparente de rayos X y luz hecha de un sustrato de cuarzo monocristalino, que produce poca dispersión de fondo, lo que resulta en excelentes relaciones señal-ruido en imágenes de difracción de cristales de proteínas. En segundo lugar, el cuarzo monocristalino es una excelente barrera de vapor equivalente al vidrio, proporcionando así un entorno estable para la cristalización de proteínas. Por el contrario, otros dispositivos de cristalización que utilizan sustratos a base de polímeros son propensos a secarse debido a la permeabilidad al vapor a menos que el material polimérico tenga un espesor sustancial, lo que contribuye a una alta dispersión de fondo10. En tercer lugar, este dispositivo permite la entrega de un gran número de cristales de proteínas al haz de rayos X sin ninguna forma de manipulación o recolección de cristales, lo cual es crítico para preservar la integridad del cristal11.

Para agilizar los experimentos de difracción de rayos X en serie utilizando los dispositivos de cristal sobre cristal, hemos desarrollado un prototipo de difractómetro para facilitar el cambio entre los modos de escaneo óptico y difracción de rayos X12. Este difractómetro tiene una huella pequeña y se ha utilizado para la recopilación de datos en serie en dos líneas de luz de la Fuente Avanzada de Fotones (APS) en el Laboratorio Nacional de Argonne. Específicamente, utilizamos BioCARS 14-ID-B para la difracción Laue y LS-CAT 21-ID-D para la oscilación monocromática. Este hardware de difractómetro no es necesario si una línea de haz láser de electrones libres de sincrotrón o rayos X está equipada con dos capacidades clave: (1) posicionamiento motorizado de la muestra con un rango de desplazamiento de ±12 mm alrededor del haz de rayos X en todas las direcciones; y (2) una cámara digital en el eje para la visualización de cristales bajo iluminación ligera que es segura para los cristales de proteínas en estudio. El dispositivo de cuarzo monocristalino junto con un difractómetro portátil y el software de control para escaneo óptico, reconocimiento de cristales y recopilación automatizada de datos in situ constituyen colectivamente la plataforma inSituX para cristalografía en serie. Aunque este desarrollo está motivado principalmente por sus aplicaciones de cristalografía dinámica utilizando una fuente de rayos X policromática, hemos demostrado el potencial de esta tecnología para soportar métodos de oscilación monocromática10,12. Con la automatización, esta plataforma ofrece un método de recopilación de datos en serie de alto rendimiento a temperatura ambiente con un consumo de proteínas asequible.

En esta contribución, describimos en detalle cómo configurar la cristalización en chip en un laboratorio húmedo y cómo realizar la recopilación de datos de rayos X en serie en una línea de luz sincrotrón utilizando la plataforma inSituX.

El método por lotes se utiliza para establecer la cristalización en chip bajo una condición similar a la del método de difusión de vapor obtenido para la misma muestra de proteína (Tabla 1). Como punto de partida, recomendamos usar precipitante a una concentración de 1.2-1.5x para el método de difusión de vapor. Si es necesario, la condición de cristalización por lotes se puede optimizar aún más mediante el cribado de rejilla fina. Las obleas de cuarzo no son necesarias para los ensayos de optimización; En su lugar, se pueden usar cubreobjetos de vidrio (ver más abajo). Se recomiendan dispositivos de cristalización parcialmente cargados para mantener los ensayos de optimización en una escala más pequeña. Varias muestras de proteínas se han cristalizado con éxito en tales dispositivos utilizando el método de lote10 (Tabla 1).

El dispositivo en sí consta de las siguientes partes: 1) un anillo exterior; 2) dos obleas de cuarzo; 3) una cuña similar a una arandela de plástico o acero inoxidable; 4) un anillo de retención; 5) aceite de inmersión del microscopio como sellador (Figura 1). El volumen total de la solución de cristalización cargada en un chip depende del propósito del experimento. La capacidad de la cámara de cristalización se puede ajustar eligiendo una cuña de diferentes espesores y/o diámetro interior. Configuramos rutinariamente dispositivos de cristalización de 10-20 μL de capacidad utilizando cuñas de 50-100 μm de espesor. Un dispositivo típico puede producir de decenas a miles de cristales de proteína adecuados para la recopilación de datos en serie (Figura 2).

Cuando tenga éxito, la cristalización en chip producirá decenas a cientos o incluso miles de cristales de proteínas en cada dispositivo de cuarzo listos para la difracción de rayos X. En una línea de luz de sincrotrón, dicho dispositivo se monta en una etapa de traslación de tres ejes del difractómetro utilizando un mecanismo cinemático. La ventana de cristalización de un dispositivo montado se escanea ópticamente y se visualiza en decenas o cientos de micrografías. Estas micrografías se unen en un montaje de alta resolución. Para cristales fotosensibles, el escaneo óptico se puede llevar a cabo bajo luz infrarroja (IR) para evitar la fotoactivación involuntaria. Se ha desarrollado un software de visión artificial para identificar y localizar cristales de proteínas distribuidos aleatoriamente en el dispositivo. Estos cristales se clasifican de acuerdo con su tamaño, forma y posición para informar o guiar la estrategia de recopilación de datos en cristalografía en serie. Por ejemplo, se pueden ubicar disparos únicos o múltiples en cada cristal objetivo. Los usuarios pueden planificar una sola pasada o múltiples rutas a través de cristales específicos. Hemos implementado software para calcular varias rutas de viaje. Por ejemplo, la ruta más corta se calcula utilizando algoritmos que abordan el problema del vendedor ambulante13. Para aplicaciones cristalográficas dinámicas bomba-sonda, se puede elegir el tiempo y la duración de las tomas de láser (bomba) y rayos X (sonda). Se programa una recopilación automatizada de datos en serie para translocar cada cristal objetivo en el haz de rayos X uno tras otro.

Los componentes clave del difractómetro insituX incluyen: 1) un soporte para dispositivo; 2) una etapa de traducción de tres ejes; 3) una fuente de luz para el escaneo óptico; 4) una parada del haz de rayos X; 5) bombear láseres si se estudian proteínas sensibles a la luz; 6) Microcomputadora Raspberry Pi equipada con una cámara sensible a IR; 7) Software de control para sincronizar motores, cámara, fuentes de luz, láser de bomba e interactuar con los controles de línea de luz.

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Protocol

1. Premontaje del dispositivo

  1. Etiquete el anillo exterior (30 mm de diámetro) para la identificación de la muestra. Si es necesario, incluya el nombre del proyecto, el número de dispositivo, la condición de cristalización y la fecha (Figura 1A). Coloque el anillo exterior boca abajo sobre una superficie limpia (Figura 1B) y coloque con cuidado una oblea de cuarzo dentro del anillo (Figura 1C). Esta primera oblea de cuarzo sirve como ventana de entrada para las radiografías incidentes.
  2. Vierta una pequeña cantidad de aceite de inmersión de microscopio (viscosidad de 150 cSt) en una placa de Petri. Sumerja una cuña en el aceite y asegúrese de que ambos lados de la cuña estén correctamente engrasados (Figura 1D). Retire el exceso de aceite frotando la cuña sobre una superficie limpia.
  3. Coloque la cuña aceitada encima de la primera oblea de cuarzo (Figura 1E).
    NOTA: El aceite de inmersión es un excelente sellador que protege la cámara de cristalización de la posible pérdida de vapor. Las virutas correctamente ensambladas generalmente duran semanas sin secado visible. Este paso previo al montaje se realiza bajo luz ambiental. Para muestras sensibles a la luz, todos los pasos posteriores, incluida la carga de muestras, el almacenamiento del dispositivo y la observación, deben llevarse a cabo bajo luz de seguridad.

2. Carga de muestras y ensamblaje del dispositivo

  1. Use una pipeta para mezclar bien la solución de proteína y el tampón de cristalización en la primera oblea de cuarzo. La relación de volumen entre la muestra de proteína y el tampón típicamente varía de 2:1 a 1:2 (Figura 1F). Asegúrese de que el volumen total de la solución de cristalización no exceda la capacidad máxima de la cámara de cristalización determinada por el tamaño y el grosor de la cuña. Evite las burbujas de aire durante la mezcla.
    NOTA: La composición de un tampón de cristalización varía de un experimento a otro. Consulte la Tabla 1 para conocer las condiciones de cristalización.
  2. Coloque la segunda oblea de cuarzo sobre la solución mezclada a medida que la solución comienza a extenderse (Figura 1G). Esta segunda oblea de cuarzo sirve como ventana de salida de los rayos X difractados.
  3. Golpee ligeramente la segunda oblea de cuarzo en el borde para ayudar a esparcir el aceite mientras expulsa el aire. Asegure el dispositivo atornillando un anillo de retención en el anillo exterior (Figura 1H). Utilice una herramienta de apriete si es necesario (Figura 1I). Tenga en cuenta que el apriete excesivo puede hacer que las delicadas obleas de cuarzo se deformen o incluso se agrieten.

3. Optimización del almacenamiento y cristalización del dispositivo

  1. Guarde los dispositivos ensamblados (Figura 1J) en una caja a temperatura ambiente o dentro de una incubadora con control de temperatura.
    NOTA: Los cristales de proteína pueden aparecer en unas pocas horas o días después de ensamblar un dispositivo de cristalización. Los resultados típicos de la cristalización en chip se muestran para varias muestras de proteínas representativas (Figura 2).
  2. Monitoree el crecimiento de cristales observando el dispositivo de cristalización bajo un microscopio. Si es necesario, optimice las condiciones de cristalización mediante iteraciones de las secciones 1-3.

4. Calibración

NOTA: Los programas y comandos mencionados en las secciones siguientes se ejecutan en el software inSituX.

  1. Instale un cristal delgado de granate de aluminio de itrio dopado en el soporte del chip (Figura 3). Instale el tope de haz. Tome imágenes de fluorescencia de rayos X del haz directo ejecutando el programa:
    burnmark.py .param
    donde es un nombre seleccionado por el usuario para el dispositivo de cristalización. .param es un nombre de archivo que contiene parámetros de control específicos del dispositivo. Los valores predeterminados se reemplazarán gradualmente por valores específicos a lo largo del protocolo. En el archivo complementario 1 se muestra un archivo .param de ejemplo.
  2. Encuentre la posición precisa del haz de rayos X directo ejecutando el programa de ajuste del perfil del haz:
    beam.py -d
    donde es el nombre de archivo de la imagen de fluorescencia de rayos X (Figura 4).
    NOTA: Este programa calcula las posiciones precisas del haz directo, así como el tamaño del haz. La posición del haz marca el destino de translocación para todos los cristales del mismo dispositivo. El tamaño del haz también se utiliza para la planificación de objetivos.

5. Escaneo óptico

  1. Coloque un dispositivo de cristalización en el soporte del chip y asegure el dispositivo con un tornillo de mariposa (Figura 3A).
  2. Monte el soporte del chip en la etapa de traslación del difractómetro a través de un mecanismo cinemático (Figura 3B).
  3. Instale una fuente de luz adecuada para tomar micrografías de la ventana óptica del dispositivo. Se puede usar luz blanca, luz IR u otra luz de elección dependiendo de la sensibilidad a la luz de la muestra de proteína, así como del propósito del experimento.
  4. Ejecute el programa de análisis:
    scan.py .param
    Este programa captura un conjunto de micrografías que se transfieren automáticamente a las computadoras de usuario especificadas.
  5. Ejecute el programa de mosaico en un equipo de usuario:
    tile.py -x -y
    donde y son los valores iniciales para los desplazamientos de columna y fila de micrografías, respectivamente. Este programa une todas las micrografías en un montaje de 1-3 μm/píxel de resolución (Figura 5).
    NOTA: Los pasos 5.4 y 5.5 suelen tardar unos minutos. El número total de micrografías varía de varias decenas a cientos dependiendo del área de escaneo y la ampliación.
  6. Ejecute el programa de búsqueda de cristales:
    findX.py -c -w -x
    donde es la imagen en mosaico. Este programa realiza reconocimiento de cristales y planificación de disparos. y indican el tamaño del cristal que se encontrará. Si el usuario desea evitar cristales más pequeños, se puede utilizar como límite estableciendo un número mayor que los tamaños de cristales pequeños no deseados. es un valor angular que establece la tolerancia para cristales de forma irregular. < tamaño del haz> se refiere al tamaño del haz directo obtenido del accesorio del perfil anterior (paso 4.2; Figura 4). Además, los usuarios pueden establecer un valor nominal para espaciar aún más los disparos dirigidos. Estos parámetros clave permiten la selección específica de cristales y la planificación de objetivos (Figura 6).

6. Difracción de rayos X

  1. Retire la fuente de luz e instale el tope del haz. Establezca una distancia de detector adecuada. Siga el protocolo de seguridad de la línea de luz para buscar en la cabina de rayos X. Abra el obturador de rayos X y el obturador láser si corresponde.
  2. Ejecute el programa de recopilación de datos para la difracción en serie:
    collect.py .param -l
    Este comando desencadena la recopilación de datos en la que todas las tomas planificadas se visitan una tras otra de acuerdo con una secuencia preprogramada. Cada cristal objetivo se transloca a la posición del haz (paso 4.2). En cada parada, la exposición a rayos X se toma con o sin iluminación láser en un retraso de tiempo programado. La película 1 muestra una secuencia automatizada de recopilación de datos operada a una frecuencia de 1 Hz. Rutinariamente se recogen de decenas a cientos de imágenes de difracción de un solo dispositivo de cristalización (Película 2).
    NOTA: La calibración de la sección 4 y el escaneo óptico de la sección 5 son autónomos en la plataforma inSituX, por lo tanto, completamente transferibles a otra línea de luz. Sección 6 La difracción de rayos X tiene que involucrar algún detalle en la operación de la línea de luz.

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Representative Results

En los últimos años se han publicado varios conjuntos de datos representativos 10,12 junto con los resultados cristalográficos y los hallazgos científicos de una amplia gama de muestras de proteínas, incluidas proteínas fotorreceptoras y enzimas, por ejemplo, una planta UV-B fotorreceptora UVR8, una fotoliasa de reparación del ADN impulsada por la luz PhrB10, una nueva proteína sensible a la luz roja lejana de una histidina quinasa sensorial multidominio 14 , dominios de doble sensor ligando/luz, y el módulo central fotosensorial de un bacteriofitocromo12. Como resultados representativos, enumeramos las condiciones de cristalización en chip de estas proteínas en la Tabla 1, y las comparamos directamente con las condiciones utilizadas para el método de difusión de vapor. Aquí mostramos cuatro estudios de caso adicionales de cristalización en chip (Figura 2) y una colección de patrones de difracción in situ en una película (Película 2). Los conjuntos de datos representativos in situ recopilados utilizando este protocolo se resumen en la Tabla 2.

En un caso representativo, la criocristalografía dio lugar a una difracción deficiente para una proteína fotorreceptora sensible a la luz roja lejana, probablemente debido a la sensibilidad a la luz y al alto contenido de disolventes (~80%) de estos cristales14. Las densidades de electrones obtenidas de los datos de criocristalografía estaban demasiado manchadas para resolver la conformación cromófora, que está en el centro de nuestra pregunta científica. Usando el protocolo in situ, pudimos evitar la activación involuntaria de la luz antes de la difracción y obtuvimos un conjunto de datos oscuros a temperatura ambiente de más de 800 cristales. Este conjunto de datos oscuros de la difracción de Laue en serie in situ dio como resultado densidades de electrones mejor resueltas, lo que permite la construcción segura del modelo de un cromóforo bilin que exhibe una conformación todo Z,syn hasta ahora desconocida (Figura 7A)12,14. Nuestros experimentos de cristalografía dinámica han revelado aún más cambios inducidos por la luz en esta proteína fotorreceptora de color rojo lejano al comparar datos de 4.352 cristales en la oscuridad y 8.287 cristales después de la iluminación de la luz (Figura 7). Un análisis preliminar de los mapas de diferencias inducidas por la luz ha revelado movimientos concertados en la hoja central de β, lo que sugiere la importancia del apilamiento de π-π entre los anillos pirrólicos del cromóforo y varios residuos aromáticos (Figura 7B, C). Un análisis en profundidad y los hallazgos científicos se presentarán en otra parte.

Figure 1
Figura 1: Montaje del dispositivo de cristalización. Se estima que cada ensamblaje costará US$30 con dos obleas de cuarzo monocristalino o US$10 con dos cubreobjetos de vidrio. Los componentes de hardware, excepto la corrección, son reutilizables. (A) El lado plano del anillo exterior está etiquetado para fines de identificación. (B) El anillo exterior se coloca boca abajo sobre una superficie limpia. (C) Una oblea de cuarzo de 1 pulgada de diámetro se coloca cuidadosamente en el interior. Un chip de vidrio también podría usarse en su lugar durante los ensayos de cristalización, pero no es compatible con la difracción de rayos X. (D) Ambos lados de la cuña están aceitados. (E) La cuña aceitada se coloca en el primer chip de cuarzo. (F) Las soluciones de proteína y cristalización se pipetean al centro del chip y se mezclan. (G) Un segundo chip de cuarzo o vidrio cubre la gota para que se extienda uniformemente sobre el chip. (H) Se atornilla un anillo de retención sobre la segunda oblea de cuarzo. (I) Se utiliza una herramienta de apriete para apretar suavemente el anillo de retención. (J) Un dispositivo completamente ensamblado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cristales proteicos representativos cultivados en dispositivos de cuarzo. (A) El módulo central fotosensorial de un bacteriofitocromo (Pa497 en la Tabla 1). (B,C) Diferentes construcciones del tercer dominio GAF a partir de una histidina quinasa sensorial multidominio (2551g3 y 2551g3Δα1 en la Tabla 1). (D) Los dominios sensoriales en tándem de una histidina quinasa de doble sensor (RECGAF en la Tabla 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: difractómetro inSituX . (A) Un dispositivo de cristalización está montado en el soporte del chip. Aunque el dispositivo está montado verticalmente, los cristales cultivados en chip no van a caer, principalmente porque la capa líquida en un dispositivo ensamblado es muy delgada y los cristales están anclados a sus núcleos cuando crecen. (B) Se instala una fuente de luz IR para el escaneo óptico. La cámara captura la vista en línea de los cristales de proteínas a lo largo del haz de rayos X a través de un espejo prismático (no visible en la imagen). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ajuste del perfil de haz directo. Los canales rojo, verde y azul de la imagen de fluorescencia de rayos X se utilizan para ajustarse a una función gaussiana bidimensional. La columna izquierda muestra la imagen sin procesar de los canales rojo, verde y azul. La columna central es el resultado de ajuste con la posición y el tamaño precisos de la viga. La columna derecha muestra los residuos de conexión. Si la amplitud de los residuos de conexión abarca una pequeña fracción de la imagen en bruto, el ajuste del perfil del haz directo es exitoso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Teselación de la imagen . (A) Se captura una serie de micrografías de cristal durante un escaneo óptico. El escaneo óptico y la transferencia de datos generalmente toman 1-2 minutos. Las micrografías adyacentes comparten una franja de área superpuesta, horizontal y verticalmente, marcada por cuadros amarillos. (B) Las micrografías se unen para hacer un montaje de alta resolución basado en la correlación óptima en las áreas superpuestas. Este proceso generalmente toma un minuto en una computadora portátil. El cuadro amarillo delinea el área capturada por 2 x 2 micrografías que se muestran en (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Reconocimiento de cristales y planificación de disparos. Cada círculo rosa marca la toma principal de un cristal. Los círculos amarillos marcan tomas adicionales si un cristal es lo suficientemente largo como para colocar estas tomas. Las líneas rosas marcan una ruta como solución al problema del vendedor ambulante. Los cristales agrupados y los cristales más pequeños se evitan en gran medida. La agresividad del hallazgo de cristales se puede ajustar como una opción para findX.py (paso 5.6). Una estrategia de "exageración" de fuerza bruta no dejaría ningún cristal sin disparar, pero podría producir muchas imágenes de difracción, pero no procesables12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Mapas de densidad electrónica del dominio de detección de luz roja lejana de una histidina quinasa. (A) El mapa 2Fo-Fc contorneado a 2,5σ muestra las densidades de electrones asociadas con el cromóforo bilin en una conformación sinsínica todo Z,14. Los anillos pirrófilos de la A a la D están marcados. (B y C) Los mapas de diferencias claro-oscuro contorneados a ±2.5σ en verde y rojo, respectivamente, resaltan la ganancia y la pérdida de densidades de electrones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación de las condiciones de cristalización entre la difusión de vapor y el método de lotes en chip. La difusión de vapor y los métodos de cristalización por lotes están altamente correlacionados 10,14,15,16,17,18,19. A partir de una condición de difusión de vapor, se puede optimizar una condición similar para la cristalización en chip. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Resumen de conjuntos de datos in situ recopilados directamente de dispositivos de cuarzo. Se pueden recolectar miles de patrones de difracción Laue de varios dispositivos de cristalización. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Película 1: Una recopilación de datos simulada. Los cristales dirigidos se translocan en el haz de rayos X marcados por un círculo rojo. La secuencia de los cristales objetivo en esta película no sigue una solución al problema del vendedor ambulante. Las exposiciones al láser y a los rayos X se disparan en cada parada con un retardo programado. Se recogen imágenes de difracción. Haga clic aquí para descargar esta película.

Película 2: Imágenes de difracción. Se pueden recolectar cientos de imágenes de difracción desde un solo dispositivo de cristalización. Varios dispositivos son suficientes para producir un conjunto de datos completo y altamente redundante (Tabla 2). Haga clic aquí para descargar esta película.

Archivo complementario 1: archivo .param de ejemplo. Un pequeño archivo de texto recopila algunos parámetros de control específicos de cada dispositivo de cristalización. Estos parámetros comienzan con sus valores predeterminados y se modificarán en consecuencia en las secciones 4, 5 y 6 a medida que avance el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La cristalografía de proteínas en los primeros años realizada a temperatura ambiente experimentó una tremenda dificultad para combatir el daño por radiación de rayos X. Por lo tanto, ha sido reemplazado por el método de criocristalografía más robusto a medida que las fuentes de rayos X sincrotrón se volvieron fácilmente disponibles20. Con el advenimiento de los láseres de electrones libres de rayos X, la cristalografía de proteínas a temperatura ambiente se ha revivido en los últimos años, con muchos nuevos desarrollos impulsados por el deseo de observar la dinámica estructural de las proteínas a una temperatura fisiológicamente relevante 2,21. El desarrollo de la plataforma inSituX basada en los dispositivos cristal sobre cristal ha estado motivado por la misma ambición, es decir, establecer métodos rutinarios y robustos de recolección de datos para estudios de cristalografía dinámica a temperatura ambiente. Este método automatizado de difracción de rayos X en serie también es aplicable a la determinación de la estructura estática de cristales de proteínas no susceptibles de congelación14. En este protocolo, presentamos consideraciones técnicas clave junto con los pasos críticos necesarios para entregar la recopilación de datos a temperatura ambiente utilizando esta plataforma. Este método es particularmente adecuado para cristales de proteínas frágiles que son sensibles al manejo mecánico, al daño por radiación de rayos X o a la exposición al aire.

El prototipo de la plataforma ha sido ampliamente probado en dos líneas de luz de cristalografía de proteínas en la Fuente Avanzada de Fotones (APS) del Laboratorio Nacional de Argonne. Si bien es bastante sencillo configurar la cristalización en chip de acuerdo con este protocolo, el paso de recopilación de datos implica varios componentes de hardware y software personalizados. Como resultado, su aplicación e implementación de estrategias de recopilación de datos específicas del proyecto puede requerir una estrecha colaboración entre los usuarios y los científicos de la línea de luz. En otras palabras, esta tecnología en su forma actual está limitada a aquellos usuarios que tienen acceso adecuado a sincrotrones como APS. Sin embargo, el flujo de trabajo general y los pasos clave descritos en este protocolo servirían como referencia o guía para cualquier grupo de investigación interesado en la cristalografía de proteínas a temperatura ambiente.

La ventaja más significativa de esta plataforma es que no se requiere manipulación de cristales, como montaje o congelación, de modo que los delicados cristales de proteínas se difracten en condiciones prístinas. Otra ventaja importante es que el uso del sustrato de cuarzo monocristalino da lugar a muy poca dispersión de fondo a imágenes de difracción de proteínas, al tiempo que ofrece entornos estables para la cristalización de proteínas durante mucho tiempo (semanas o meses). Sin embargo, esta plataforma no es adecuada para el cribado de cristales de matriz dispersa, ya que está diseñada para la producción de cristales a gran escala. Como tal, se requiere un conocimiento previo de las condiciones de cristalización para establecer ensayos iniciales de cristalización en chip para una muestra de proteína dada.

En la práctica, encontramos que algunos pasos de ensamblaje del dispositivo, como cómo engrasar una cuña (paso 1.2) y cómo sellar un dispositivo (paso 2.3), tan triviales como parecen, a menudo afectan directamente los resultados de la cristalización. Un dispositivo puede secarse rápidamente si el engrase no se realiza correctamente. Además, el apriete excesivo del dispositivo en el paso final del ensamblaje puede deformar las obleas de cuarzo, mientras que el apriete insuficiente conduce a posibles fugas y / o evaporación incontrolada del dispositivo. Otro paso crítico es la planificación de inyecciones de rayos X. Uno debe tratar cuidadosamente con cristales agrupados o abarrotados para evitar patrones de difracción superpuestos que a menudo son difíciles de procesar. Este problema puede aliviarse mediante el uso de un haz de rayos X de microenfoque. Potencialmente, un conjunto de datos completo podría ser difícil de obtener si la morfología del cristal es una placa grande y delgada, de modo que la mayoría de las placas son paralelas a las ventanas de cuarzo. Además, los chips de cuarzo monocristalino se pueden reciclar y reutilizar después de un procedimiento de limpieza que involucra jabón y solventes orgánicos que eliminan los desechos de aceite y proteínas. Por lo general, alrededor del 80-90% de estos delicados chips se pueden limpiar sin daños para los próximos experimentos. En el caso de cristales pequeños en una línea de luz microenfocada, cuando se debe lograr una mejor precisión en el posicionamiento del cristal, se podrían actualizar varios componentes de hardware, como motores más finos, mejor cámara y óptica, mayor aumento, etc. Sin embargo, ninguno de estos se acerca a las limitaciones de vanguardia. Por lo tanto, hay mucho espacio disponible para mejorar sin mucha dificultad.

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Disclosures

ZR es el inventor de los chips de cristal sobre cristal en la patente estadounidense 9632042 otorgada a Renz Research, Inc.

Acknowledgments

El uso de Advanced Photon Source, una instalación de usuario de la Oficina de Ciencias operada para el Departamento de Energía de los Estados Unidos por el Laboratorio Nacional de Argonne, fue respaldada por el contrato DE-AC02-06CH11357. El uso de BioCARS fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención R24GM111072. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. El uso de LS-CAT Sector 21 fue apoyado por Michigan Economic Development Corporation y Michigan Technology Tri-Corridor subvención 085P1000817. Este trabajo es apoyado por subvenciones de la Universidad de Illinois en Chicago, los Institutos Nacionales de Salud (R01EY024363) y la Fundación Nacional de Ciencias (MCB 2017274) a XY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Outer ring In-house developed
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
Pump lasers Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

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References

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Bioquímica Número 181
Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente
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Biju, L. M., Wang, C., Kang, W.,… More

Biju, L. M., Wang, C., Kang, W., Tom, I. P., Kumarapperuma, I., Yang, X., Ren, Z. On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature. J. Vis. Exp. (181), e63022, doi:10.3791/63022 (2022).

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