Summary
Detta bidrag beskriver hur man ställer in proteinkristallisering på kristall-på-kristall-enheter och hur man utför automatiserad seriell datainsamling vid rumstemperatur med hjälp av on-chip-kristalliseringsplattformen.
Abstract
Biokemiska reaktioner och biologiska processer kan bäst förstås genom att visa hur proteiner övergår mellan sina funktionella tillstånd. Eftersom kryogena temperaturer är icke-fysiologiska och kan förhindra, avskräcka eller till och med förändra proteinstrukturdynamiken är en robust metod för rutinmässiga röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur mycket önskvärd. Kristall-på-kristall-enheten och dess medföljande hårdvara och programvara som används i detta protokoll är utformade för att möjliggöra röntgendiffraktion på plats vid rumstemperatur för proteinkristaller i olika storlekar utan provmanipulation. Här presenterar vi protokollen för de viktigaste stegen från enhetsmontering, on-chip kristallisering, optisk skanning, kristalligenkänning till röntgenskottplanering och automatiserad datainsamling. Eftersom denna plattform inte kräver någon kristallskörd eller någon annan provmanipulation kan hundratals till tusentals proteinkristaller som odlas på chip införas i en röntgenstråle på ett programmerbart sätt med hög genomströmning.
Introduction
På grund av de joniserande effekterna av röntgenstrålning har proteinkristallografi i stor utsträckning begränsats till kryogena förhållanden under de senaste tre decennierna. Därför härrör den nuvarande kunskapen om proteinrörelser under dess funktion till stor del från jämförelser mellan statiska strukturer observerade i olika tillstånd under kryogena förhållanden. Kryogena temperaturer hindrar emellertid oundvikligen utvecklingen av en biokemisk reaktion eller interkonversion mellan olika konformationstillstånd medan proteinmolekyler är i arbete. För att direkt observera proteinstrukturdynamik vid atomär upplösning genom kristallografi behövs robusta och rutinmässiga metoder för att genomföra diffraktionsexperiment vid rumstemperatur, vilket kräver tekniska innovationer inom provleverans, datainsamling och bakre dataanalys. För detta ändamål har de senaste framstegen inom seriell kristallografi erbjudit nya vägar för att fånga molekylära bilder av intermediärer och kortlivade strukturella arter vid rumstemperatur 1,2,3. I motsats till strategin "en-kristall-en-dataset" som ofta används i konventionell kryokristallografi, antar seriell kristallografi en datainsamlingsstrategi som liknar den för enpartikel kryoelektronmikroskopi. Specifikt samlas experimentella data i seriell kristallografi i små fraktioner från ett stort antal enskilda prover, följt av intensiv databehandling där datafraktioner utvärderas och kombineras till en komplett dataset för 3D-strukturbestämning4. Denna "en-kristall-ett-skott" -strategi underlättar effektivt röntgenstrålningsskadorna på proteinkristaller vid rumstemperatur via en diffraktion före förstörelsestrategi5.
Eftersom seriell kristallografi kräver ett stort antal proteinkristaller för att slutföra en dataset, innebär det stora tekniska utmaningar för många biologiska system där proteinprover är begränsade och / eller känslig kristallhantering är inblandad. En annan viktig faktor är hur man bäst bevarar kristallintegriteten i seriella diffraktionsexperiment. Diffraktionsmetoderna på plats tar itu med dessa problem genom att låta proteinkristaller diffrera direkt från där de växer utan att bryta kristallisationskammarens tätning 6,7,8,9. Dessa hanteringsfria metoder är naturligt kompatibla med storskalig seriell diffraktion. Vi har nyligen rapporterat om design och implementering av en kristallisationsanordning för in situ-diffraktion baserad på ett kristall-på-kristall-koncept - proteinkristaller odlade direkt på monokristallin kvarts11. Denna "kristall-på-kristall" -enhet erbjuder flera fördelar. För det första har den ett röntgen- och ljustransparent fönster av ett monokristallint kvartssubstrat, vilket ger liten bakgrundsspridning, vilket resulterar i utmärkta signal-brusförhållanden i diffraktionsbilder från proteinkristaller. För det andra är enkristallkvartsen en utmärkt ångspärr som motsvarar glas, vilket ger en stabil miljö för proteinkristallisering. Däremot är andra kristallisationsanordningar som använder polymerbaserade substrat benägna att torka på grund av ångpermeabilitet såvida inte polymermaterialet har en väsentlig tjocklek, vilket följaktligen bidrar till hög bakgrundsspridning10. För det tredje möjliggör denna anordning leverans av ett stort antal proteinkristaller till röntgenstrålen utan någon form av kristallmanipulation eller skörd, vilket är avgörande för att bevara kristallintegriteten11.
För att effektivisera seriella röntgendiffraktionsexperiment med kristall-mot-kristall-enheterna har vi utvecklat en diffraktometerprototyp för att underlätta enkel växling mellan optisk skanning och röntgendiffraktionslägen12. Denna diffraktometer har ett litet fotavtryck och har använts för seriell datainsamling vid två strålrör från Advanced Photon Source (APS) vid Argonne National Laboratory. Specifikt använde vi BioCARS 14-ID-B för Laue-diffraktion och LS-CAT 21-ID-D för monokromatisk svängning. Denna diffraktometerhårdvara krävs inte om ett synkrotron- eller röntgenfrielektronlaserstrålrör är utrustat med två nyckelfunktioner: (1) motoriserad provpositionering med ett slagområde på ±12 mm runt röntgenstrålen i alla riktningar; och (2) en digitalkamera på axeln för kristallvisning under ljusbelysning som är säker för proteinkristaller som studeras. Den monokristallina kvartsanordningen tillsammans med en bärbar diffraktometer och styrprogramvaran för optisk skanning, kristalligenkänning och automatiserad datainsamling på plats utgör tillsammans inSituX-plattformen för seriell kristallografi. Även om denna utveckling främst motiveras av dess dynamiska kristallografiapplikationer med hjälp av en polykromatisk röntgenkälla, har vi visat potentialen hos denna teknik för att stödja monokromatiska oscillationsmetoder10,12. Med automatisering erbjuder denna plattform en seriell datainsamlingsmetod med hög genomströmning vid rumstemperatur med prisvärd proteinförbrukning.
I detta bidrag beskriver vi i detalj hur man ställer in on-chip-kristallisering i ett vått laboratorium och hur man utför seriell röntgendatainsamling vid ett synkrotronstrålrör med hjälp av inSituX-plattformen.
Batchmetoden används för att ställa in kristallisering på chip under ett tillstånd som liknar det för ångdiffusionsmetoden erhållen för samma proteinprov (tabell 1). Som utgångspunkt rekommenderar vi att du använder fällningsmedel vid 1,2-1,5x koncentration av den för ångdiffusionsmetoden. Vid behov kan batchkristallisationstillståndet optimeras ytterligare via finrutnätsscreening. Kvartsskivor är inte nödvändiga för optimeringsförsök; glasöverdrag kan användas istället (se nedan). Delvis laddade kristalliseringsanordningar rekommenderas för att hålla optimeringsförsök i mindre skala. Ett antal proteinprover har framgångsrikt kristalliserats på sådana anordningar med hjälp av batchmetod10 (tabell 1).
Enheten i sig består av följande delar: 1) en yttre ring; 2) två kvartsskivor; 3) en brickliknande shim av plast eller rostfritt stål; 4) en kvarhållningsring; 5) mikroskop nedsänkningsolja som tätningsmedel (figur 1). Den totala volymen av kristallisationslösningen laddad på ett chip beror på experimentets syfte. Kristallisationskammarens kapacitet kan justeras genom att välja en shim med olika tjocklekar och / eller innerdiameter. Vi ställer rutinmässigt in kristalliseringsanordningar på 10-20 μL i kapacitet med hjälp av shims på 50-100 μm i tjocklek. En typisk enhet kan producera tiotusentals proteinkristaller som är tillräckliga för seriell datainsamling (figur 2).
När det lyckas kommer kristallisering på chip att producera tiotals till hundratals eller till och med tusentals proteinkristaller på varje kvartsanordning redo för röntgendiffraktion. Vid ett synkrotronstrålrör är en sådan anordning monterad på ett treaxligt översättningssteg av diffraktometern med användning av en kinematisk mekanism. Kristalliseringsfönstret för en monterad enhet skannas optiskt och avbildas i tiotals till hundratals mikrografer. Dessa mikrografer sys sedan i ett högupplöst montage. För ljuskänsliga kristaller kan optisk skanning utföras under infrarött (IR) ljus för att undvika oavsiktlig fotoaktivering. En programvara för datorseende har utvecklats för att identifiera och lokalisera proteinkristaller slumpmässigt fördelade på enheten. Dessa kristaller rangordnas sedan efter deras storlek, form och position för att informera eller vägleda datainsamlingsstrategin inom seriell kristallografi. Till exempel kan enstaka eller flera skott placeras på varje riktad kristall. Användare kan planera ett enda pass eller flera rutter genom riktade kristaller. Vi har implementerat programvara för att beräkna olika resvägar. Till exempel beräknas den kortaste vägen med hjälp av algoritmer som adresserar problemet med resande säljare13. För dynamiska kristallografiska tillämpningar med pumpsond kan tidpunkten och varaktigheten för laser- (pump) och röntgenbilder (sond) väljas. En automatiserad seriell datainsamling är programmerad för att translokera varje riktad kristall till röntgenstrålen efter varandra.
Nyckelkomponenterna i insituX-diffraktometern inkluderar: 1) en enhetshållare; 2) ett treaxligt översättningssteg; 3) en ljuskälla för optisk skanning; 4) ett röntgenstrålestopp; 5) pumplasrar om ljuskänsliga proteiner studeras; 6) Raspberry Pi mikrodator utrustad med en IR-känslig kamera; 7) Kontrollprogramvara för att synkronisera motorer, kamera, ljuskällor, pumplaser och för gränssnitt med strålrörskontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förmontering av enheten
- Märk den yttre ringen (30 mm diameter) för providentifiering. Inkludera vid behov projektnamn, enhetsnummer, kristallisationstillstånd och datum (bild 1A). Placera den yttre ringen upp och ner på en ren yta (figur 1B) och placera försiktigt en kvartsskiva inuti ringen (figur 1C). Denna första kvartsskiva fungerar som ett ingångsfönster för de infallande röntgenstrålarna.
- Häll en liten mängd mikroskop nedsänkningsolja (viskositet på 150 cSt) i en petriskål. Doppa en shim i oljan och se till att båda sidor av shim är ordentligt oljade (figur 1D). Ta bort överflödig olja genom att dabba shim på en ren yta.
- Placera den oljade shimmen ovanpå den första kvartsskivan (figur 1E).
OBS: Nedsänkningsolja är ett utmärkt tätningsmedel som skyddar kristallisationskammaren från potentiell ångförlust. Korrekt monterade chips håller vanligtvis i veckor utan synlig torkning. Detta förmonteringssteg utförs under rumsljus. För ljuskänsliga prover måste alla efterföljande steg, inklusive provbelastning, enhetslagring och observation, utföras under säkerhetsljus.
2. Provladdning och enhetsmontering
- Använd en pipett för att noggrant blanda proteinlösningen och kristalliseringsbufferten på den första kvartsskivan. Volymförhållandet mellan proteinprovet och bufferten varierar vanligtvis från 2: 1 till 1: 2 (Figur 1F). Se till att kristallisationslösningens totala volym inte överstiger kristallisationskammarens maximala kapacitet bestämd av shimstorleken och tjockleken. Undvik luftbubblor under blandning.
OBS: Sammansättningen av en kristallisationsbuffert varierar från ett experiment till ett annat. Se tabell 1 för kristallisationsförhållanden. - Placera den andra kvartsskivan över den blandade lösningen när lösningen börjar spridas ut (figur 1G). Denna andra kvartsskiva fungerar som utgångsfönstret för de diffraktionerade röntgenstrålarna.
- Knacka lätt på den andra kvartsskivan på kanten för att sprida oljan medan du trycker ut luft. Säkra enheten genom att skruva fast en fästring i den yttre ringen (bild 1H). Använd ett åtdragningsverktyg om det behövs (figur 1I). Tänk på att överdragning kan orsaka att känsliga kvartsskivor deformeras eller till och med spricker.
3. Enhetslagring och kristalliseringsoptimering
- Förvara de monterade enheterna (figur 1J) i en låda vid rumstemperatur eller inuti en inkubator med temperaturkontroll.
OBS: Proteinkristaller kan dyka upp om några timmar till dagar efter att en kristalliseringsanordning har monterats. Typiska resultat från on-chip kristallisering visas för flera representativa proteinprover (figur 2). - Övervaka kristalltillväxt genom att observera kristalliseringsanordningen under ett mikroskop. Optimera vid behov kristallisationsförhållandena genom iterationer av sektionerna 1-3.
4. Kalibrering
OBS: De program och kommandon som nämns i avsnitten nedan körs i inSituX-programvaran.
- Installera en tunn kristall av dopad yttriumaluminiumgranat på spånhållaren (figur 3). Montera strålstoppet. Ta röntgenfluorescensbilder av direktstrålen genom att köra programmet:
burnmark.py.param
därär ett användarvalt namn för kristalliseringsenheten. .param är ett filnamn som innehåller enhetsspecifika kontrollparametrar. Standardvärdena kommer gradvis att ersättas av specifika värden längs protokollet. Ett exempel på filen.param visas i tilläggsfil 1. - Hitta den exakta positionen för den direkta röntgenstrålen genom att köra strålprofilanpassningsprogrammet:
beam.py-d
därär filnamnet på röntgenfluorescensbilden (figur 4).
OBS: Detta program beräknar de exakta direkta strålpositionerna samt strålstorleken. Strålpositionen markerar translokationsdestinationen för alla kristaller från samma enhet. Strålstorleken används också för målplanering.
5. Optisk skanning
- Placera en kristalliseringsanordning i chiphållaren och säkra enheten med en tumskruv (bild 3A).
- Montera spånhållaren på diffraktometerns översättningssteg genom en kinematisk mekanism (figur 3B).
- Installera en ordentlig ljuskälla för att ta mikrografer från enhetens optiska fönster. Vitt ljus, IR-ljus eller annat valfritt ljus kan användas beroende på proteinprovets ljuskänslighet samt syftet med experimentet.
- Kör skanningsprogrammet:
scan.py.param
Detta program fångar en uppsättning mikrografer som automatiskt överförs till angivna användardatorer. - Kör plattsättningsprogrammet på en användardator:
tile.py-x -y
där < x > och
OBS: Steg 5.4 och 5.5 tar vanligtvis några minuter. Det totala antalet mikrografer varierar från flera tiotals till hundratals beroende på skanningsområde och förstoring. - Kör kristallsökningsprogrammet:
findX.py-c -w -x
därär den kaklade bilden. Detta program utför kristalligenkänning och skottplanering. och anger kristallstorleken som ska hittas. Om användaren vill undvika mindre kristaller kan användas som en cutoff genom att ställa in ett antal som är större än storleken på oönskade små kristaller. är ett vinkelvärde som sätter toleransen för kristaller av oregelbunden form. avser den direkta strålstorlek som erhålls från profilmonteringen ovan (steg 4.2; Figur 4). Dessutom kan ett nominellt värde ställas in av användare för att ytterligare placera ut riktade bilder. Dessa nyckelparametrar möjliggör specifikt kristallval och målplanering (figur 6).
6. Röntgendiffraktion
- Ta bort ljuskällan och installera strålstoppet. Ställ in ett lämpligt detektoravstånd. Följ strålrörets säkerhetsprotokoll för att söka i röntgenhytten. Öppna röntgenluckan och laserluckan om tillämpligt.
- Kör datainsamlingsprogrammet för seriell diffraktion:
collect.py.param -l
Detta kommando utlöser datainsamling där alla planerade bilder besöks efter varandra enligt en förprogrammerad sekvens. Varje målkristall translokeras till strålläget (steg 4.2). Vid varje stopp tas röntgenexponering med eller utan laserbelysning vid en schemalagd tidsfördröjning. Film 1 visar en automatiserad datainsamlingssekvens som drivs med en frekvens på 1 Hz. Rutinmässigt samlas tiotals till hundratals diffraktionsbilder in från en enda kristalliseringsenhet (film 2).
OBS: Sektion 4-kalibrering och optisk skanning i avsnitt 5 är fristående i inSituX-plattformen och kan därför helt överföras till ett annat strålrör. 6 § Röntgendiffraktion måste innebära vissa detaljer i strålrörsdriften.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flera representativa dataset har publicerats Under de senaste åren 10,12 tillsammans med kristallografiska resultat och vetenskapliga resultat från ett brett spektrum av proteinprover, inklusive fotoreceptorproteiner och enzymer, till exempel en växt UV-B-fotoreceptor UVR8, en ljusdriven DNA-reparationsfotolyas PhrB10, ett nytt långt rött ljusavkänningsprotein från ett sensoriskt histidinkinas med flera domäner 14 , ligand/ljus dubbelsensordomäner och den fotosensoriska kärnmodulen i en bakteriofytokrom12. Som representativa resultat listar vi kristallisationsförhållandena på chipet för dessa proteiner i tabell 1 och jämför dem direkt med de förhållanden som används för ångdiffusionsmetoden. Här visar vi ytterligare fyra fallstudier av on-chip-kristallisering (figur 2) och en samling in situ-diffraktionsmönster i en film (film 2). Representativa in situ-datauppsättningar som samlats in med hjälp av detta protokoll sammanfattas i tabell 2.
I ett representativt fall gav kryokristallografi upphov till dålig diffraktion för ett långt rött ljusavkännande fotoreceptorprotein sannolikt på grund av ljuskänslighet och högt lösningsmedelsinnehåll (~ 80%) av dessa kristaller14. Elektrondensiteterna erhållna från kryokristallografidata var för utsmetade för att lösa kromoforkonformationen, som är i centrum för vår vetenskapliga fråga. Med hjälp av in situ-protokollet kunde vi undvika oavsiktlig ljusaktivering före diffraktion och erhöll ett mörkt dataset vid rumstemperatur från mer än 800 kristaller. Denna mörka datamängd från in situ seriell Laue-diffraktion resulterade i bättre upplösta elektrontätheter, vilket möjliggjorde säker modellbyggnad av en bilinkromofor som uppvisar en hittills okänd all-Z,syn-konformation (figur 7A)12,14. Våra dynamiska kristallografiexperiment har ytterligare avslöjat ljusinducerade förändringar i detta långt röda fotoreceptorprotein genom att jämföra data från 4 352 kristaller i mörker och 8 287 kristaller efter ljusbelysning (figur 7). En preliminär analys av de ljusinducerade skillnadskartorna har avslöjat samordnade rörelser i det centrala β-arket, vilket tyder på vikten av π-π-stapling mellan kromoforens pyrrolringar och flera aromatiska rester (figur 7B,C). En fördjupad analys och vetenskapliga rön kommer att presenteras på annat håll.
Bild 1: Montering av kristalliseringsanordning. Varje montering beräknas kosta US $ 30 med två monokristallina kvartsskivor eller US $ 10 med två glasöverdrag. Hårdvarukomponenter utom shim är återanvändbara. (A) Den plana sidan av den yttre ringen är märkt för identifieringsändamål. B) Den yttre ringen placeras upp och ner på en ren yta. (C) En kvartsskiva med en diameter på 1 tum placeras försiktigt inuti. Ett glaschip kan också användas istället under kristallisationsförsök men är inte kompatibelt med röntgendiffraktion. (D) Båda sidor av shim är oljade. (E) Den oljade shimmen placeras på det första kvartschipet. (F) Protein- och kristallisationslösningar pipetteras till mitten av chipet och blandas. (G) En andra kvarts eller glasflisa täcker droppen så att den sprider sig jämnt över chipet. (H) En fästring skruvas över den andra kvartsskivan. (I) Ett åtdragningsverktyg används för att dra åt hållarringen försiktigt. (J) En helt monterad anordning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa proteinkristaller odlade på kvartsanordningar. (A) Den fotosensoriska kärnmodulen i ett bakteriofytokrom (Pa497 i tabell 1). (B,C) Olika konstruktioner av den tredje GAF-domänen från ett sensoriskt histidinkinas med flera domäner (2551g3 och 2551g3Δα1 i tabell 1). (D) Tandemsensoriska domäner från ett histidinkinas med dubbla sensorer (RECGAF i tabell 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inSituX diffraktometer . (A) En kristallisationsanordning är monterad i chiphållaren. Även om enheten är monterad vertikalt kommer kristaller som odlas på chip inte att falla, främst för att vätskeskiktet i en monterad enhet är mycket tunt och kristaller är förankrade i sina kärnor när de växer. (B) En IR-ljuskälla är installerad för den optiska skanningen. Kameran fångar den inbyggda vyn av proteinkristallerna längs röntgenstrålen genom en prismaspegel (syns inte på bilden). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Direkt balkprofilmontering. De röda, gröna och blå kanalerna i röntgenfluorescensbilden används för att passa en tvådimensionell Gaussisk funktion. Den vänstra kolumnen visar den råa bilden av de röda, gröna och blå kanalerna. Den mellersta kolonnen är det passande resultatet med den exakta strålpositionen och storleken. Den högra kolumnen visar monteringsresterna. Om amplituden hos de passande resterna sträcker sig över en liten bråkdel av råbilden, är profilmonteringen av direktstrålen framgångsrik. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Bildplattor . (A) En uppsättning kristallmikrografer fångas under en optisk skanning. Den optiska skanningen och dataöverföringen tar vanligtvis 1-2 minuter. Intilliggande mikrografer delar en remsa av överlappande område, horisontellt och vertikalt, markerat med gula rutor. (B) Mikrografer sys ihop för att göra ett högupplöst montage baserat på den optimala korrelationen i de överlappande områdena. Denna process tar vanligtvis en minut på en bärbar dator. Den gula rutan beskriver det område som fångats av 2 x 2 mikrografer som visas i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kristalligenkänning och skottplanering. Varje rosa cirkel markerar det primära skottet av en kristall. De gula cirklarna markerar ytterligare skott om en kristall är tillräckligt lång för att placera dessa skott. De rosa linjerna markerar en rutt som en lösning på problemet med resande säljare. Klustrade kristaller och mindre kristaller undviks till stor del. Kristallfyndets aggressivitet kan justeras som ett alternativ till findX.py (steg 5.6). En brute force "overkill" -strategi skulle inte lämna någon kristall un-shot men kan producera massor av diffraktionsbilder, men inte bearbetade12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Elektrondensitetskartor över den fjärrröda-ljusavkännande domänen för ett histidinkinas . (A) 2Fo-Fc-kartan konturerad vid 2,5σ visar elektrondensiteterna associerade med bilinkromoforen i en all-Z,syn-konformation 14. Pyrrolringar A till D är markerade. (B och C) Ljus-mörka skillnadskartor konturerade vid ±2,5σ i grönt respektive rött, markerar förstärkningen och förlusten av elektrondensiteter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Jämförelse av kristallisationsförhållanden mellan ångdiffusion och on-chip batchmetod. Ångdiffusion och batchmetoder för kristallisering är starkt korrelerade 10,14,15,16,17,18,19. Med utgångspunkt från ett ångdiffusionstillstånd kan ett liknande tillstånd optimeras för kristallisering på chipet. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Sammanfattning av in situ-datauppsättningar som samlats in direkt från kvartsanordningar. Tusentals Laue-diffraktionsmönster kan samlas in från flera kristalliseringsanordningar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Film 1: En fingerad datainsamling. Riktade kristaller translokeras till röntgenstrålen som markeras av en röd cirkel. Sekvensen av de riktade kristallerna i den här filmen följer inte en lösning på problemet med resande säljare. Laser- och röntgenexponeringar avfyras vid varje stopp med en programmerad fördröjning. Diffraktionsbilder samlas in. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 2: Diffraktionsbilder. Hundratals diffraktionsbilder kan samlas in från en enda kristalliseringsenhet. Flera enheter är tillräckliga för att skapa en fullständig och mycket redundant datauppsättning (tabell 2). Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Tilläggsfil 1: Exempel på
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinkristallografi under de första åren som genomfördes vid rumstemperatur upplevde enorma svårigheter att bekämpa röntgenstrålningsskador. Således har den ersatts av den mer robusta kryokristallografimetoden eftersom synkrotronröntgenkällor blev lättillgängliga20. Med tillkomsten av röntgenfrielektronlasrar har rumstemperaturproteinkristallografi återupplivats de senaste åren, med många nya utvecklingar som drivs av en önskan att observera proteinstrukturell dynamik vid en fysiologiskt relevant temperatur 2,21. Utvecklingen av inSituX-plattformen baserad på kristall-på-kristall-enheterna har motiverats av samma ambition, det vill säga att etablera rutinmässiga och robusta datainsamlingsmetoder för dynamiska kristallografistudier vid rumstemperatur. Denna automatiserade seriella röntgendiffraktionsmetod är också tillämplig på statisk strukturbestämning för proteinkristaller som inte kan frysas14. I det här protokollet presenterar vi viktiga tekniska överväganden tillsammans med kritiska steg som behövs för att leverera datainsamling i rumstemperatur med hjälp av denna plattform. Denna metod är särskilt lämpad för ömtåliga proteinkristaller som är känsliga för mekanisk hantering, röntgenstrålningsskador eller luftexponering.
Plattformsprototypen har testats omfattande vid två proteinkristallografistrålrör vid Advanced Photon Source (APS) vid Argonne National Laboratory. Även om det är ganska enkelt att ställa in kristallisering på chip enligt detta protokoll, involverar datainsamlingssteget flera skräddarsydda hårdvaru- och mjukvarukomponenter. Som ett resultat kan dess tillämpning och implementering av projektspecifika datainsamlingsstrategier kräva nära samarbete mellan användare och strålrörsforskare. Med andra ord är denna teknik i sin nuvarande form begränsad till de användare som har tillräcklig tillgång till synkrotroner som APS. Ändå skulle det övergripande arbetsflödet och nyckelstegen som beskrivs i detta protokoll fungera som en referens eller guide för alla forskargrupper som är intresserade av rumstemperaturproteinkristallografi.
Den viktigaste fördelen med denna plattform är att ingen kristallmanipulation som montering eller frysning krävs så att känsliga proteinkristaller diffreras under orörda förhållanden. En annan stor fördel är att användningen av det monokristallina kvartssubstratet ger upphov till mycket liten bakgrundsspridning till proteindiffraktionsbilder samtidigt som det erbjuder stabila miljöer för proteinkristallisering under lång tid (veckor till månader). Denna plattform är dock inte lämplig för glasscreening med gles matris eftersom den är avsedd för storskalig kristallproduktion. Som sådan krävs förkunskaper om kristallisationsförhållanden för att ställa in initiala kristallisationsförsök på chip för ett givet proteinprov.
I praktiken finner vi att vissa enhetsmonteringssteg, till exempel hur man oljar en shim (steg 1.2) och hur man tätar en enhet (steg 2.3), så triviala som de verkar, ofta direkt påverkar resultaten av kristallisering. En enhet kan torka ut snabbt om oljning inte görs ordentligt. Dessutom kan överdragning av anordningen i det sista monteringssteget deformera kvartsskivorna, medan underdragning leder till potentiella läckor och / eller okontrollerad avdunstning från enheten. Ett annat kritiskt steg är att planera röntgenbilder. Man måste noggrant hantera klustrade eller trånga kristaller för att undvika överlappande diffraktionsmönster som ofta är svåra att bearbeta. Detta problem kan lindras genom användning av en mikrofokuserande röntgenstråle. Potentiellt kan ett komplett dataset vara svårt att få tag på om kristallmorfologin är en stor tunn platta så att de flesta plattorna är parallella med kvartsfönstren. Dessutom kan enkristallkvartsflisen återvinnas och återanvändas efter en rengöringsprocedur med tvål och organiska lösningsmedel som tar bort olje- och proteinskräp. Vanligtvis kan cirka 80-90% av dessa känsliga marker rengöras utan skador för nästa experiment. När det gäller små kristaller på ett mikrofokuserat strålrör, när bättre precision måste uppnås vid kristallpositionering, kan flera hårdvarukomponenter uppgraderas, såsom finare motorer, bättre kamera och optik, större förstoring etc. Ingen av dessa är dock i närheten av de senaste begränsningarna. Därför finns gott om utrymme för förbättring utan större svårigheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZR är uppfinnaren av kristall-på-kristallchips på det amerikanska patentet 9632042 beviljats Renz Research, Inc.
Acknowledgments
Användning av Advanced Photon Source, en Office of Science User Facility som drivs för US Department of Energy av Argonne National Laboratory, stöddes av kontrakt DE-AC02-06CH11357. Användning av BioCARS stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer R24GM111072. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. Användningen av LS-CAT Sector 21 stöddes av Michigan Economic Development Corporation och Michigan Technology Tri-Corridor grant 085P1000817. Detta arbete stöds av bidrag från University of Illinois i Chicago, National Institutes of Health (R01EY024363) och National Science Foundation (MCB 2017274) till XY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).
- Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).
- Nogales, E., Scheres, S. H. W. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).
- Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. Diffraction before destruction. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313 (2014).
- Kisselman, G., et al. X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).
- Liang, M., et al. Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).
- Perry, S. L., et al. In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device. Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).
- Ren, Z., et al. Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature. Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).
- Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).
- Ren, Z., et al. An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature. IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).
- Croes, G. A. A method for solving traveling salesman problems. Operations Research. 6, 791-812 (1958).
- Bandara, S., et al. Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118 (2021).
- Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).
- Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome. Nature. 479, 428-432 (2011).
- Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).
- Zeng, X., et al. Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8. Nature Plants. 1, 14006 (2015).
- Wang, M., et al. Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex. Biochemistry. 50, 581-590 (2011).
- Rodgrs, D. W. Cryocrystallography. Structure. 2, 1135-1140 (1994).
- Zhao, F. -Z., et al. A guide to sample delivery systems for serial crystallography. TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).
