Summary
Questo protocollo presenta come quantificare l'efficienza di trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando la PCR a goccia digitale (dd-PCR) insieme alla produzione di AAV su piccola scala, all'iniezione intravitreale, all'imaging retinico e all'isolamento del DNA genomico retinico.
Abstract
Molti laboratori di biologia cellulare retinica ora utilizzano abitualmente virus adeno-associati (AAV) per l'editing genetico e le applicazioni regolatorie. L'efficienza della trasduzione AAV è solitamente critica, il che influisce sui risultati sperimentali complessivi. Uno dei principali determinanti per l'efficienza di trasduzione è il sierotipo o la variante del vettore AAV. Attualmente, sono disponibili vari sierotipi e varianti AAV artificiali con diverse affinità con i recettori di superficie delle cellule ospiti. Per la terapia genica retinica, ciò si traduce in vari gradi di efficienza di trasduzione per diversi tipi di cellule retiniche. Inoltre, la via di iniezione e la qualità della produzione di AAV possono anche influenzare le efficienze di trasduzione AAV retinica. Pertanto, è essenziale confrontare l'efficienza di diverse varianti, lotti e metodologie. Il metodo digital droplet PCR (dd-PCR) quantifica gli acidi nucleici con elevata precisione e consente di eseguire la quantificazione assoluta di un dato target senza alcuno standard o riferimento. Utilizzando la dd-PCR, è anche possibile valutare le efficienze di trasduzione degli AAV mediante quantificazione assoluta dei numeri di copia del genoma AAV all'interno di una retina iniettata. Qui, forniamo un metodo semplice per quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nelle cellule retiniche utilizzando la dd-PCR. Con piccole modifiche, questa metodologia può anche essere la base per la quantificazione del numero di copie del DNA mitocondriale e per valutare l'efficienza dell'editing di base, fondamentale per diverse malattie della retina e applicazioni di terapia genica.
Introduction
I virus associati all'adeno (AAV) sono ora comunemente usati per una varietà di studi di terapia genica retinica. Gli AAV forniscono un modo sicuro ed efficiente di consegna genica con meno immunogenicità e meno integrazioni del genoma. L'ingresso di AAV nella cellula bersaglio avviene attraverso l'endocitosi, che richiede il legame di recettori e co-recettori sulla superficie cellulare1,2. Pertanto, l'efficienza di trasduzione degli AAV per diversi tipi di cellule dipende principalmente dal capside e dalle sue interazioni con i recettori delle cellule ospiti. Gli AAV hanno sierotipi e ogni sierotipo può avere tropismi cellulari / tissutali distinti ed efficienze di trasduzione. Esistono anche sierotipi e varianti AAV artificiali generati dalla modifica chimica del capside virale, dalla produzione di capsidi ibridi, dall'inserimento di peptidi, dal rimescolamento del capside, dall'evoluzione diretta e dalla mutagenesi razionale3. Anche piccoli cambiamenti nella sequenza aminoacidica o nella struttura del capside possono avere un'influenza sulle interazioni con i fattori delle cellule ospiti e provocare diversi tropismi4. Oltre alle varianti di capside, altri fattori come la via di iniezione e la variazione da lotto a lotto della produzione di AAV possono influenzare l'efficienza di trasduzione degli AAV nella retina neuronale. Pertanto, sono necessari metodi affidabili per il confronto dei tassi di trasduzione per diverse varianti.
La maggior parte dei metodi per determinare l'efficienza di trasduzione AAV si basa sull'espressione genica del reporter. Questi includono imaging fluorescente, immunoistochimica, western blot o analisi istochimica del prodotto del gene reporter5,6,7. Tuttavia, a causa del vincolo dimensionale degli AAV, non è sempre possibile includere geni reporter per monitorare l'efficienza di trasduzione. L'uso di promotori forti come l'ibrido CMV enhancer/chicken beta-actin o Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) come sequenza di stabilizzatori di mRNA complica ulteriormente il problema delle dimensioni8. Pertanto, sarà anche utile definire il tasso di trasduzione degli AAV iniettati con una metodologia più diretta.
La PCR a goccia digitale (dd-PCR) è una potente tecnica per quantificare il DNA bersaglio da piccole quantità di campioni. La tecnologia dd-PCR dipende dall'incapsulamento del DNA bersaglio e dalla miscela di reazione PCR da parte di goccioline d'olio. Ogni reazione dd-PCR contiene migliaia di goccioline. Ogni goccia viene elaborata e analizzata come reazione PCR indipendente9. L'analisi delle goccioline consente di calcolare il numero assoluto di copie delle molecole di DNA bersaglio in qualsiasi campione semplicemente utilizzando l'algoritmo di Poisson. Poiché l'efficienza di trasduzione degli AAV è correlata al numero di copie dei genomi AAV nella retina neuronale, abbiamo usato il metodo dd-PCR per quantificare i genomi AAV.
Qui, descriviamo una metodologia dd-PCR per calcolare l'efficienza di trasduzione di vettori AAV dal DNA genomico retinico6,10. In primo luogo, gli AAV che esprimono il reporter tdTomato sono stati generati utilizzando il protocollo su piccola scala e titered dal metodo dd-PCR11. In secondo luogo, gli AAV sono stati iniettati per via intravitreale nella retina neuronale. Per dimostrare l'efficienza di trasduzione, abbiamo prima quantificato l'espressione di tdTomato utilizzando la microscopia fluorescente e il software ImageJ. Questo è stato seguito dall'isolamento del DNA genomico per la quantificazione dei genomi AAV nelle retine iniettate utilizzando la dd-PCR. Il confronto dei livelli di espressione di tdTomato con i genomi AAV trasdotti quantificati dalla dd-PCR ha mostrato che il metodo dd-PCR ha quantificato accuratamente l'efficienza di trasduzione dei vettori AAV. I nostri protocolli hanno dimostrato una descrizione dettagliata di una metodologia basata su dd-PCR per quantificare le efficienze di trasduzione AAV. In questo protocollo, mostriamo anche il numero assoluto di genomi AAV che vengono trasdotti dopo iniezioni intravitreali semplicemente utilizzando il fattore di diluizione dopo l'isolamento del DNA genomico e i risultati della dd-PCR. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo potente, che sarebbe un'alternativa all'espressione del reporter per quantificare le efficienze di trasduzione dei vettori AAV nella retina.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati accettati dal comitato etico dell'Università Sabanci e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la dichiarazione di "The Association for Research in Vision and Ophthalmology" per l'uso di animali nella ricerca
1. Produzione AAV su piccola scala12
- Colture di cellule HEK293T utilizzando piastre da 15 cm in 10 ml completi di DMEM/10% FBS fino al 70-80% di confluenza.
- Preparare la miscela di trasfezione con 20 μg di plasmide helper (pHGT1-Adeno1), 7 μg di plasmide capside e 7 μg di vettore AAV2-CBA-tdTomato-WPRE e 136 μL di soluzione di PEI (1 mg/mL) in 5 mL di DMEM.
- Aggiungere la miscela di trasfezione preparata da 5 mL in una capsula di coltura cellulare contenente 10 mL di terreno di coltura e incubare le cellule trasfettate per 48-60 ore a 37 °C.
- Raccogliere il fluido a 48-60 ore dopo la trasfezione e digerirlo con DNasi I ad una concentrazione finale di 250 U/mL per 30 min a 37 °C.
- Centrifugare il mezzo digerito a 4000 x g,4 °C per 30 minuti e quindi filtrarlo con un filtro a siringa da 0,22 μm nella membrana di cellulosa rigenerata pre-bagnata per 100 kDa.
- Centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata a 4000 x g,4 °C per 30 min ed eliminare il mezzo.
- Lavare e centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata con PBS contenente 0,001% Pluronic F-68 tre volte a 4000 x g,4 °C per 30 min. Scartare il PBS ad ogni passaggio.
- Raccogliere AAV concentrati dalla parte superiore della membrana di cellulosa rigenerata e aliquota per ulteriori usi.
- Digerire 5 μL di AAV appena fatto con DNasi I (0,2U/μl) per 15 min a 37 °C per la titolazione. Segue un'incubazione di 10 minuti a 95 °C sia per inattivare la DNasi I che per degradare i capsidi virali.
- Preparare una diluizione seriale di 10 volte da AAV digeriti utilizzando lo 0,05% di Pluronic F-68. Utilizzare i primer AAV2-ITR e WPRE per la titolazione (Tabella 1). I titoli sono stati calcolati moltiplicando i risultati della dd-PCR con i fattori di diluizione. I risultati sono stati convertiti in copia del genoma / mL (GC / mL).
NOTA: le concentrazioni di AAV per la produzione di AAV su piccola scala dovrebbero essere di circa 1 x 1012 GC / mL. Questo protocollo non è applicabile per i ceppi AAV che non rilasciano in modo efficiente AAV in supporti come AAV213.
2. Iniezione intravitreale di AAV
-
Preparazione dell'attrezzatura
- Prima di iniziare, preparare una microsiringa da 10 μL con un ago smussato da 36 G. Risciacquare cinque volte con etOH al 70%, cinque volte in ddH2O e infine cinque volte con PBS.
- Caricare la quantità appropriata di AAV nella microsiringa per ogni iniezione.
- Preparare l'ago chirurgico (sutura, seta, 6/0), nastro, pinza e forbici.
-
Iniezione intravitreale
- Applicare 1 goccia di tropicamide allo 0,5% e al 2,5% di fenilefrina cloridrato (ad es. Midfrina) contenente collirio prima dell'anestesia per dilatare le pupille.
- Anestetizzare i topi con isoflurano 5% (1 L/min) e continuare con isoflurano all'1,5% (1 L/min) durante la procedura. Una piccola camera isoflurano viene utilizzata per la prima induzione.
- Verificare la profondità dell'anestesia con la perdita del riflesso di raddrizzamento, il riflesso di astinenza e la risposta al pizzico della coda.
- Applicare 0,3% di tobramicina e 0,1% di desametasone soluzione oftalmica sterile su ciascun occhio prima della procedura di iniezione. L'applicazione del collirio previene la secchezza ed esercita effetti antinfiammatori e antibatterici.
- Utilizzare il gancio chirurgico per stabilizzare la palpebra superiore. Tirare leggermente indietro per esporre la parte dorsale dell'occhio. Fissare il gancio alla panca per tenerlo in posizione.
- Rimuovere la congiuntiva (meno di 1 mm2) con le forbici dell'iride curva per esporre la sclera dell'occhio sotto il microscopio di dissezione. Utilizzare una siringa da insulina fresca e sterile (30 G) per perforare la sclera.
- Inserire l'ago della microsiringa attraverso la stessa puntura utilizzando un micromanipolatore. Posizionare la punta dell'ago dietro la lente al centro della oculare.
- Iniettare 1 μL di AAV2/BP2 e AAV2/PHP. Vettori S con concentrazioni di 1,63 x10 12 GC/mL e 1,7 x 1012 GC/mL lentamente nel vitreo dell'occhio. Il controllo del volume di iniezione viene eseguito manualmente. Lasciare l'ago in posizione per 1 minuto e prelevare lentamente l'ago.
- Rilasciare la palpebra e applicare un trattamento topico anti-infiammatorio e antibatterico con gel contenente lo 0,3% di tobramicina e lo 0,1% di desametasone sul oculare. Monitorare e valutare i topi nei giorni successivi in base al foglio di punteggio in termini di aspetto (occhi luminosi, pelo curato, curvatura), comportamento (attività, immobilizzazione, automutilazione) e peso corporeo su una scala da 0 a 3. Ogni condizione ha un punteggio da 0-3 e un punteggio totale di 3 o superiore è un criterio di terminazione.
- Metti gli animali nella gabbia dopo il recupero.
3. Imaging a fluorescenza e fondo oculare
- Filtrare il topo e dilatare la pupilla posizionando gocce di 0,5% di tropicamide e 2,5% di fenilefrina cloridrato in ciascun occhio.
- Anestetizzare l'animale con la procedura di cui sopra con isoflurano. Valutare attentamente la profondità dell'anestesia pizzicando le zampe.
- Posizionare il mouse sullo stadio di imaging e verificare la corretta dilatazione controllando attraverso la fotocamera del fondo oculare. Applicare gel topico (0,2% carbomer 980) sulla superficie degli occhi per proteggere gli occhi dalla disidratazione in anestesia e per utilizzarlo come gel di accoppiamento per l'imaging.
- Manipolare la fase di imaging per allinearla con il nasello dell'obiettivo. Regolare lo stage in base alle esigenze per centrare l'occhio del mouse. Una volta che l'occhio è centrato, sposta lentamente l'obiettivo fino a quando non entra in contatto con l'occhio.
- Eseguire l'imaging del fondo e della fluorescenza su entrambi gli occhi per seguire l'espressione di tdTomato a 1 settimana e 2 settimane dopo l'iniezione intravitreale (Figura 3B)14. Prendi immagini di fondo e fluorescenza con impostazioni identiche per il confronto dell'espressione del reporter.
4. Isolamento della retina
- Eutanasia degli animali dopo l'imaging del fondo e della fluorescenza mediante inalazione di CO2 per la raccolta della retina a 2 settimane di tempo.
- Sposta il bulbo oculare in avanti con l'aiuto di una pinza splitter da 13,5 cm.
- Rimuovere la lente insieme al vitreo rimanente applicando una leggera pressione con la pinza.
- Tagliare la connessione del bulbo oculare al nervo ottico con pinze curve di precisione e spremere delicatamente la retina con la stessa pinza curva.
- Trasferire le retine sezionate in un tubo di microcentrifuga.
- Snap congelare la retina posizionando i tubi nell'azoto liquido.
5. Isolamento del DNA genomico tissutale
- Isolare il DNA genomico con un kit di DNA genomico tissutale basato sulla digestione della proteinasi K commercializzato.
- Digerire la retina a 55 °C, 200 x g per 30 minuti con la Proteinasi K, già fornita nel kit.
- Eseguire la fase di incubazione della RNasi, le fasi di lavaggio con tampone di lavaggio I e II e infine la fase di eluizione secondo il protocollo del produttore.
- Aggiungere un ulteriore passaggio di centrifuga dopo l'ultimo lavaggio per rimuovere l'etanolo residuo.
- Misurare la concentrazione di DNA genomico e conservare i campioni a -20 °C.
6. Analisi PCR digitale a goccia di campioni di retina di topo per la quantificazione dei genomi virali
- Diluire i DNA genomici dalle retine iniettate in soluzione di F-68 pluronico allo 0,05% per raggiungere una concentrazione finale di 1 ng/μL per ciascun campione.
- Eseguire reazioni separate per WPRE e 18S utilizzando primer specifici target con una concentrazione finale di 125 nM per ciascun primer.
- Eseguire la generazione di goccioline in un mix di reazione PCR da 20 μL, tra cui 1 ng di DNA genomico, 125 nM primer e 2x evagreen supermix.
- Caricare la miscela di campioni nella parte centrale della cartuccia per la generazione di goccioline.
- Dopo aver effettuato il caricamento del campione sulla cartuccia, aggiungere 70 μL di olio di generazione di gocce nella fila inferiore della cartuccia.
- Mettere la guarnizione sopra la cartuccia e posizionarla nel generatore di gocce. Assicurarsi che non vi sia spazio tra la guarnizione e la cartuccia.
- Prelevare delicatamente circa 40 μL di goccioline che vengono generate nel pozzetto superiore. Aggiungere la soluzione di goccioline alla piastra di reazione PCR semi-gonna a 96 pozzetti.
- Sigillare la piastra PCR con il sigillante a piastre PCR utilizzando un foglio di tenuta in alluminio.
- Posizionare la piastra PCR in un termociclatore termosaldato a 96 pozzetti. Utilizzare il protocollo PCR; 95 °C per 5 min, 40 cicli di 95 °C per 30 s, 60 °C per 1 min, 4 °C per 5 min, 90 °C per 5 min e 4 °C di tenuta infinita. Applicare una velocità di rampa di 2 °C/s ad ogni ciclo per garantire che le goccioline raggiungano la temperatura corretta per ogni passo durante il ciclo
- Posizionare la piastra PCR nel lettore di gocce per quantificare le goccioline utilizzando il software dd-PCR. Un modello viene configurato utilizzando impostazioni specifiche per evagreen.
- Analizza i dati utilizzando un grafico grafico 1D con ciascun campione per l'intensità di fluorescenza rispetto al numero di goccioline. Il valore di soglia è disposto in modo che le goccioline sopra la soglia siano assegnate come positive e quelle inferiori come negative. Segue l'applicazione dell'algoritmo di Poisson per determinare la concentrazione iniziale del DNA bersaglio in unità di copie/μL. Il rapporto tra WPRE e 18S viene calcolato per misurare l'efficienza di trasduzione AAV.
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Representative Results
La produzione di AAV su piccola scala è un metodo veloce ed efficiente che fornisce vettori per iniezioni intravitreali (Figura 1). La produzione di AAV su piccola scala di solito fornisce titoli nell'intervallo 1 x 1012 GC / ml che è sufficiente per rilevare l'espressione del reporter nella retina (Figura 2). Il titering di AAV utilizzando dd-PCR dà risultati coerenti. I primer specifici ITR2 e WPRE vengono utilizzati di routine e la concentrazione iniziale di ciascuna molecola bersaglio è stata calcolata con il software dd-PCR modellando come distribuzione di Poisson. I calcoli sono stati finalizzati moltiplicando i fattori di diluizione e convertiti in copia del genoma per ml. Gli AAV prodotti per questo protocollo avevano titoli di 1,63 x 1012 GC / mL e 1,7x 1012 GC / ml per AAV2 / BP2 e AAV2 / PHP.S7,15, rispettivamente. Per confronto, sono stati utilizzati costrutti di espressione tdTomato identici per entrambi i ceppi. Abbiamo iniettato titoli approssimativamente uguali di AAV per la quantificazione dell'efficienza di trasduzione AAV. Dopo l'iniezione di 1 μL dalle suddette concentrazioni di AAV, gli animali sono stati ripresi a 1 settimana e 2 settimane. Un sistema di imaging a fondo e fluorescenza è stato utilizzato sia per AAV2 / BP2 che per AAV2 / PHP. S iniettato retine che generano profili di espressione reporter simili ad eccezione della retina #1 (Figura 3A,B). L'espressione di TdTomato è stata quantificata utilizzando il software ImageJ per il valore medio del grigio (intensità media di fluorescenza) al fine di confrontare l'efficienza di trasduzione e l'espressione del reporter (Figura 3A,B). Questa è fondamentalmente la somma dei valori di grigio di tutti i pixel nella selezione divisa per il numero di pixel16. Le immagini fluorescenti della Retina #1 hanno mostrato solo una piccola area di espressione di tdTomato, molto probabilmente a causa di riflusso o perdite dopo iniezioni intravitreali. Coerentemente con questa scoperta, l'intensità di fluorescenza della retina #1 era 0,9, che era la più bassa rispetto a tutte le retine che sono state iniettate e fotografate per via intravitreale. L'intensità media di fluorescenza era compresa tra 4 e 11. Ciò ha dimostrato che la quantificazione delle immagini fluorescenti dell'espressione di tdTomato ha avuto successo ed è correlata con le immagini mostrate (Figura 3A,B).
Dopo l'imaging delle retine, il DNA genomico è stato isolato dalle retine iniettate a 2 settimane. La dd-PCR è stata eseguita utilizzando primer WPRE per la quantificazione del genoma AAV. Mouse 18S è stato utilizzato per la normalizzazione dei genomi AAV al genoma del topo (Figura 3C)17. Coerentemente con l'intensità media di fluorescenza e le immagini, la retina #1 aveva un numero di copie del genoma AAV molto basso rispetto a 18S, 0,011 volte inferiore rispetto alla retina #2. Inoltre, le retine #2, 3, 4 e 5 danno differenze di livello di piega simili. Le differenze di piega rispetto alla retina #2 per le retine #3, 4 e 5 erano rispettivamente 1,75, 0,55 e 0,99. Tra questi, la retina #3 ha dato la più alta intensità fluorescente e il numero di copie del genoma AAV. Questo ha già dimostrato che la quantificazione dei genomi AAV trasdotti con dd-PCR è correlata con l'intensità della fluorescenza e quindi con l'espressione di tdTomato che si osserva. Il metodo dd-PCR ci ha anche permesso di fare la quantificazione assoluta degli AAV trasdotti. La quantificazione assoluta del genoma AAV totale per retina è stata calcolata semplicemente moltiplicando il numero totale identificato dalla dd-PCR e il fattore di diluizione per il DNA genomico. Ciò ha prodotto risultati simili rispetto all'efficienza di trasduzione del genoma AAV normalizzata 18S (Figura 3D).
Figura 1: Diagramma di flusso delle procedure sperimentali. La produzione di AAV su piccola scala è seguita dal titolo AAV basato su dd-PCR. Gli AAV vengono iniettati per via intravitreale nella retina adulta. Il follow-up degli animali è stato eseguito utilizzando un fondo oculare e un sistema di imaging fluorescente al fine di analizzare l'espressione del reporter. Le immagini di fondo e fluorescenti sono state scattate a 1 settimana e 2 settimane di tempo. Il DNA genomico viene isolato dalle retine iniettate per l'analisi con dd-PCR per quantificare il genoma AAV totale presente nelle retine iniettate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Titolo AAV con il metodo dd-PCR. ( A )Ilmetodo Dd-PCR beneficia di reazioni PCR incapsulate all'interno di una goccia. Dopo la reazione PCR utilizzando la chimica evagreen, sono state analizzate goccioline positive e negative per il gene bersaglio per determinare il numero assoluto di DNA bersaglio all'interno di una soluzione. (scatole rosse in goccioline verdi). (B) Dati rappresentativi dd-PCR per il titolo AAV. Diversi lotti di AAV sono stati titolati utilizzando primer ITR2. Le goccioline positive e negative sono separate sopra e sotto la soglia (linea viola). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione dei genomi AAV trasdotti nella retina mediante dd-PCR. Animali selvatici di 16 settimane sono stati iniettati per via intravitreale con AAV2/BP2 e AAV2/PHP. Vettori S con concentrazioni rispettivamente di 1,63 x10 12 GC/mL e 1,7x10 12 GC/mL. Entrambi gli AAV avevano lo stesso costrutto di espressione tdTomato e il volume di iniezione per tutti gli AAV era di 1 μL. Le retine iniettate (1-7) sono state seguite con l'imaging del fondo e della fluorescenza. Le immagini scattate sono state quantificate utilizzando il software Image J. Nonostante la differenza di capside, tutti gli animali avevano un valore di intensità media di fluorescenza(valore medio di grigio)compreso tra 4 e 11 tranne la retina #1 che aveva l'intensità più bassa, 0,9, e un'espressione tdTomato debole. Le colonne rosse e grigie sono AAV2/BP2 e AAV2/PHP. S iniettato retine, rispettivamente (A-B). La dd-PCR è stata eseguita utilizzando primer WPRE per il genoma AAV e primer 18S per la normalizzazione a 2 settimane. Retina # 1 ha anche mostrato numeri di copie AAV nettamente inferiori per copie 18S(C). Anche i genomi AAV totali per retina sono stati calcolati utilizzando il numero di copie WPRE e il fattore di diluizione per l'isolamento del DNA genomico (D). I quadrati rossi e grigi sono AAV2 / BP2 e AAV2 / PHP. S iniettato retine, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| ddPCR Primer | |
| ITR2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGAGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
Tabella 1: sequenze di primer dd-PCR. Sequenze di primer avanti e indietro per WPRE, ITR2 e mouse 18S.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo generato due vettori AAV che hanno diverse proteine del capside e poi li abbiamo titolati di conseguenza. Uno dei passaggi più cruciali di questo protocollo è quello di produrre quantità sufficienti di AAV che produrranno un'espressione reporter rilevabile dopo la trasduzione12,13.
Il titering degli AAV è anche un fattore importante per regolare i dosaggi di AAV per le iniezioni intravitreali. Una volta raggiunti questi importanti criteri, è possibile quantificare l'efficienza di trasduzione degli AAV mediante la metodologia dd-PCR.
Molti laboratori utilizzano il metodo quantitativo PCR (qPCR) per il titolo AAV. Il metodo di quantificazione assoluta basato su qPCR richiede una curva standard che presenta diluizioni di quantità note di DNA bersaglio18. Tuttavia, la dd-PCR non richiede una curva standard in quanto quantifica direttamente il numero totale di molecole bersaglio all'interno di un dato campione rilevando le goccioline positive che hanno almeno una copia del DNA bersaglio. Poiché la dd-PCR è un'analisi end-point e non è richiesta alcuna curva standard, i problemi di efficienza che si sono verificati durante la reazione qPCR sono meno preoccupanti per la dd-PCR come le PCR a bassa efficienza o la qualità delle curve standard 9. La metodologia dd-PCR può essere applicata a campioni già preparati per la qPCR. Come è già stato menzionato nella sezione Metodi per il titolo AAV, la dd-PCR richiede campioni diluiti. Questo è un passo critico poiché la concentrazione del campione dovrebbe essere regolata in modo che ci siano abbastanza goccioline negative per eseguire l'algoritmo di Poisson. In altre parole, non è possibile eseguire la reazione dd-PCR con campioni con concentrazioni troppo elevate di DNA bersaglio che non producono goccioline negative.
Sia per le misurazioni dell'efficienza di titering AAV che di trasduzione, è possibile utilizzare diversi set di obiettivi. Per il titolo AAV, utilizziamo principalmente primer specifici AAV2 ITR a causa della spina dorsale AAV2 nei nostri costrutti. È anche possibile utilizzare WPRE e altri bersagli specifici del gene a seconda del costrutto AAV che è stato analizzato.
Per valutare l'efficienza di trasduzione degli AAV nella retina neuronale, abbiamo applicato il metodo dd-PCR utilizzando campioni di retina intera per quantificare la quantità totale di genomi AAV per retina. Abbiamo valutato l'accuratezza della metodologia utilizzando un vettore AAV che esprime il reporter tdTomato. Confronto dei risultati della dd-PCR con i livelli di espressione di tdTomato correlati ad eccezione dei due valori anomali. Le retine #6 e #7 hanno prodotto copie del genoma AAV in eccesso nonostante mostrassero intensità di fluorescenza simili rispetto alle retine #2,3 4 o 5. Ciò può essere dovuto al fatto che queste retine hanno tassi di trasduzione più elevati con livelli di espressione limitati o possono in parte essere correlate a particelle AAV durature o DNA vettore all'interno della retina vitrea o neuronale19,20. Nel complesso, questo è stato l'unico fattore limitante per il nostro metodo e può essere facilmente identificato tra gli altri campioni. Abbiamo anche quantificato il numero totale di genomi AAV per retina, che era uno dei punti di forza di questa metodologia. Ciò consente il confronto dei dati tra diversi laboratori e lotti di animali. Pertanto, questo metodo può essere facilmente applicato per valutare l'efficienza di trasduzione di un nuovo sierotipo, variante o variazione da lotto a lotto per vettori AAV che non hanno espressione reporter e aiutarci a confrontare i dati in diverse impostazioni. Questo è fondamentale per i vettori AAV che non consentono l'espressione di un reporter a causa di vincoli di dimensione.
Questo metodo fornisce anche una base per altri tipi di saggi sensibili che utilizzano il DNA bersaglio. Utilizzando gli stessi protocolli, possiamo quantificare i numeri di copie del genoma mitocondriale con primer appropriati. Sono inoltre possibili ulteriori miglioramenti, tra cui la dissociazione della retina e le fasi di selezione della citometria a flusso per quantificare il DNA bersaglio in singole cellule o lotti di cellule. Inoltre, è anche possibile valutare l'efficienza di correzione dell'editing di base utilizzando questo metodo21,22, che è anche fondamentale per diverse malattie della retina e terapie geniche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Oezkan Keles, Josephine Jüttner e il Prof. Botond Roska, Istituto di Oftalmologia Molecolare e Clinica di Basilea, Complex Viruses Platform per il loro aiuto e supporto per la produzione di AAV. Vorremmo anche ringraziare il Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, l'Università della Pennsylvania per il ceppo AAV8 / BP2. Il lavoro sugli animali viene eseguito presso la struttura per animali della Gebze Technical University. Per questo, ringraziamo Leyla Dikmetas e il Prof. Uygar Halis Tazebay per l'assistenza tecnica e il supporto alla zootecnia. Vorremmo anche ringraziare la dottoressa Fatma Ozdemir per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è supportato da TUBITAK, grant numbers 118C226 e 121N275, e Sabanci University Integration grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
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