Summary
该协议描述了NSCLC患者衍生类器官模型中靶向信号传导抑制剂药物敏感性的标准化评估。
Abstract
源自临床患者标本的新型3D癌症类器官培养物是评估肿瘤内异质性和治疗对癌症靶向抑制剂的治疗反应的重要模型系统。胃肠道癌和胰腺癌的开创性工作凸显了患者源性类器官（PDO）作为患者近距离培养系统的前景，越来越多的模型正在出现。同样，其他癌症类型的工作集中在建立类器官模型和优化培养方案上。值得注意的是，3D癌症类器官模型保持了原始肿瘤标本的遗传复杂性，从而将肿瘤衍生的测序数据转化为实验环境中具有遗传信息的靶向治疗。此外，PDO可能会促进对合理联合治疗的评估，以克服未来肿瘤的耐药性相关适应。后者专注于非小细胞肺癌（NSCLC）的密集研究工作，因为耐药性的发展最终限制了靶向抑制剂的治疗成功。使用NSCLC PDO对治疗靶向机制的早期评估可能有助于为合理的联合治疗提供信息。本手稿描述了一种标准化方案，用于基于细胞培养板评估NSCLC衍生的3D PDO中靶向抑制剂的药物敏感性，具有对联合治疗和其他治疗方式的潜在适应性。
Introduction
针对致癌驱动因素的个性化治疗彻底改变了癌症治疗，提高了患者生存率并减少了治疗介导的副作用1。分子诊断和测序技术的最新进展凸显了人类肿瘤的复杂性，其空间和时间异质性影响治疗反应2。长期以来，在细胞培养模型中概括这些亚克隆差异仅限于研究在其他均匀的细胞系中感兴趣的选择改变。由肿瘤活检或手术肿瘤切除产生的新开发的3D PDO模型可以改善患者衍生肿瘤组织内细胞复杂性和信号串扰的表示3。因此，源自胃肠癌和胰腺癌的肿瘤类器官已经成功生成并概括了治疗反应的遗传多样性和决定因素4，5，6。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，类器官的发育和建立存在挑战已得到承认，并且需要优化培养技术和选择性培养基因子，以便将来更广泛，更系统地使用NSCLC PDO7，8。
开发针对经得起初始药物治疗的残留肿瘤细胞的组合疗法对于抑制耐药性发展并最终提高患者生存率至关重要9。鉴于类器官培养的结构复杂性，需要优化经典的药物反应参数，以便对药物敏感性进行准确和可重复的测试。基于成像的读数10，11 和测量细胞ATP丰度的经典细胞活力测定6，12以及其他技术可用于分析PDO培养物中的药物反应。在这里，我们开发和描述了一种标准化方案，以评估针对NSCLC PDO模型中已知临床驱动因素的靶向治疗的药物敏感性。
Protocol
对于人类受试者研究，根据UCSF内部审查委员会批准的协议（IRB，协议号：#13-12492或CC#17-23309）获得知情同意并进行组织收集。根据先前发表的方法，与研究伙伴合作，从去识别的临床标本中建立类器官培养物13，14，15，16。取回类器官培养物，以便在第三代或之后进行维持和药物升级实验。以下所有方案均在无菌条件下在哺乳动物组织培养实验室环境中进行。
图1： 该技术的工作流程和关键步骤的协议示意图。（A）实验工作流程包括以96孔形式接种类器官，在接种后7天用药物升级处理，以及使用ELISA读板仪治疗后5天基于发光的细胞存活读数。（B） EGFRdel19 阳性 TH107 和 EGFRL858R 阳性 TH330 NSCLC 类器官培养物的示例图像。显示原始培养物，接种时的细胞（第0天）和接种后7天（第7天）开始治疗的类器官。比例尺 = 100 μm。对初始 7 天培养期间类器官直径的变化进行定量，表明类器官大小增加 >2 倍。与第0天的平均大小相比，第7天的大小的相对折叠变化显示在代表性图像下方。对于TH107，在7天内观察到2.38的折叠变化，表明加倍时间为5.88天（141.12小时）。对于TH330，在7天内观察到2.41的折叠变化，表明加倍时间为5.81天（139.42小时）。给出了类器官大小变化的定量和统计评估（右图）。统计显著性通过不成对 t 检验计算， p < 0.0001。（C）以类器官96孔板形式进行药物升级的处理布局。指示技术重复次数和示例剂量，包括阴性对照。原理图是使用BioRender（一种基于Web的插图工具）创建的。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 实验准备
- 如前所述制备生长培养基（GM）15：杜尔贝克改良鹰培养基/火腿营养混合物F12（DMEM/F-12）与L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，补充100 U/mL青霉素/链霉素、10 mM HEPES、25 nM hRspondin、1x B27、5 mM烟酰胺、1.25 mM N-乙酰半胱氨酸、500 nM A-8301、500 nM SB202190、50 μg/mL普瑞莫辛、100 ng/mL hNoggin、100 ng/mL hFGF-10、 25 ng / mL hFGF-7（见 材料表）。
注意：轻轻混合以避免起泡，并通过0.22μm过滤系统过滤。使用前1小时内将培养基加热至37°C。 - 制备先前报道的低生长因子培养基（LGM）16 ，不添加表皮生长因子（EGF）：Advanced Dulbecco的改良鹰培养基/火腿营养混合物F12（DMEM / F-12），补充1 mM HEPES，1x L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，1x青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺，1 mM N-乙酰半胱氨酸，1x B27，500 nM A-8301，100 ng / mL hNoggin。
注意：轻轻混合以避免起泡，并通过0.22μm过滤器过滤。使用前1小时内将培养基加热至37°C。 - 在冰上解冻BME2（还原生长因子基底膜提取物，类型2，见 材料表），在4°C下过夜。
2. 生成单细胞悬浮液和细胞接种
- 解离浸没的BME2类器官培养物，如以下步骤（2.1.1-2.1.6）所述。
- 小心地从培养皿中吸出培养基。避免接触浸没的 BME2 类器官培养物。
注意：培养基抽吸可以根据研究人员的意愿进行，例如，使用基本的液体抽吸系统或使用移液器。避免触摸BME2嵌入的类器官，因为这可能导致类器官生物量的损失。 - 用合适的重组酶对浸没的BME2类器官培养物进行胰蛋白酶消化（ 材料表）。在6孔板格式中，每孔添加2 mL。通过反复上下移液来机械地分解BME2。将板在细胞培养箱中孵育37°C5分钟。
- 将悬浮液转移到15mL离心管中，并在室温下以600× g 离心5分钟。
- 小心地吸出重组酶而不接触类器官沉淀。
注意：可能存在残留的 BME2。如果需要，重复酶消化。 - 将类器官沉淀重悬于GM中（步骤1.1）。加入DNase I 1x 100 U / mL，在室温下孵育5分钟（见 材料表）。
- 在室温下以600× g 离心3分钟。小心移液介质，不要接触类器官沉淀并丢弃。重悬于新鲜转基因。
- 小心地从培养皿中吸出培养基。避免接触浸没的 BME2 类器官培养物。
- 类器官单细胞悬浮液的接种
- 在细胞培养箱中，在37°C下预热新的黑色透明底96孔板10分钟。
注意：使用透明底板对于监测类器官生长和药物反应至关重要。 - 为了计数，准备PBS中细胞悬浮液的1：5稀释液（总体积：500μL），并使用细胞分析仪计数细胞悬浮液（见 材料表）。
注意：确保乘以稀释因子（x 5）以接收最终的细胞浓度。可以使用其他计数方法，例如血细胞计数器。应使用活力染色法（例如，使用台盼蓝17）监测细胞活力。使用细胞分析仪，自动评估活力。细胞分析仪评估的类器官单细胞悬浮液的活力应≥95%（补充图1）。 - 计算实验接种所需的细胞悬浮液的体积。
注意：接种浓度为1500个细胞/ μL BME2，每孔需要5μL BME2（总数：7500个细胞/孔）。对于一个96孔板，需要6 x 10E5细胞。这包括播种60个具有类器官圆顶（4.5 x 10E5）和实验剩余（计算总共80个孔）的孔。 - 如果实验中包括多个96孔板，则每个计划接种的每个96孔板在1.5mL微量离心管中制备一等分试样的细胞悬浮液。
注意：每个接种的96孔板需要实验剩余和单独的等分试样，以解释由于处理BME2而增加的实验偏倚。 - 从单细胞悬浮液中等分细胞，如上下移液后仔细重悬后（步骤2.2.3）。在室温下以600× g 沉淀细胞5分钟。使用P200移液器小心取出培养基，不要接触细胞沉淀。将细胞沉淀置于冰上短时间（约1分钟），并将细胞沉淀重悬于BME2中。
注：残留介质可能会影响 BME2 结构和刚度。小心移液所有培养基。将细胞放在冰上以适应细胞沉淀，并允许细胞重悬于BME2中而不会结块。将BME2不断保持在冰上，使其保持液态。对于一个96孔板，需要400μL BME2用于细胞沉淀的重悬。小心地重悬细胞沉淀，避免引入气泡。 - 将预热的黑色透明底 96 孔板朝向您倾斜。每孔使用5μL细胞悬浮液并在每个孔的6点钟位置接种细胞圆顶（图1A）。 将细胞圆顶接种在剩余的内孔中（柱2-10和96孔板的行B-G）。
注：处理 BME2 时，建议进行反向移液18 。 - 不要移动96孔板，并在室温下将新接种的细胞圆顶在细胞培养层流罩中孵育5分钟。然后将板移至细胞培养箱并在37°C下孵育10分钟。
- 小心地将每孔100μLGM加入到所有含有类器官的孔中（96孔板的柱2-10和行B-G）。向板边缘的外孔中加入100μLPBS。
- 在细胞培养箱中，在37°C的GM培养基中培养BME2包埋的类器官共7天。定期在光学显微镜下检查类器官的生长。
注：请参阅 图1B 和 补充表1 ，了解从播种到治疗当天的预期生长进展示例。 - 培养3-4天后更换培养基一次：顺时针旋转板180°（类器官现在在12点钟位置），使用多通道装置（如果有的话）小心地将GM从相反位置吸入类器官圆顶，然后加入新鲜的GM。
- 在细胞培养箱中，在37°C下预热新的黑色透明底96孔板10分钟。
3. 药物治疗
- 在LGM中制备连续药物稀释液，用于治疗EGFR突变型NSCLC类器官，用于治疗选择的药物，例如osimertinib。包括阴性对照（LGM 培养基 + 0.1% DMSO）。根据播种的孔数加上实验余量，制备所有剂量的足够药物等分试样。
注意：对于靶向抑制剂，建议使用包括≥8剂量和1 nM-10μM范围的稀释系列。 - 将类器官板顺时针旋转180°（类器官现在位于12点钟位置）。优选使用多通道设备小心地吸出GM。
注意：避免在吸气GM时触摸类器官圆顶，因为这可能导致类器官生物量损失和撞击结果。 - 每孔加入100μL对照（例如，LGM培养基+ 0.1%DMSO）或药物溶液。
注：请参阅 图1C ，了解96孔板格式的药物升级处理示意图。 - 将处理过的类器官在细胞培养箱中孵育37°C5天。
4. 通过基于发光的生存测定进行读数
- 收获和生存读数
- 根据参考文献19进行生存测定。
- 解冻试剂（见 材料表）在4°C下过夜。 使用前在室温下的水浴中平衡试剂30分钟，并通过倒置混合。
- 向每个孔中加入等体积的试剂（每孔100μL）。通过上下移液彻底混合，将移液器吸头放置在类器官圆顶的位置。在室温下在黑暗中孵育5分钟。
- 使用多通道移液器，将约75%（150μL）的裂解物（步骤4.1.1.2）转移到新的白色，不透明底部96孔板中。
注意：将75%的裂解物转移到新板可确保在以后的读数中没有气泡，而不会影响测定灵敏度。 - 在黑暗中的室温下再孵育25分钟。
- 使用ELISA读板器记录发光（积分时间0.25-1 s /孔）（见 材料表）。
- 以适当的格式保存数据，例如，包含所有原始读取和记录的板布局和所用药物的数据表。
- 根据参考文献19进行生存测定。
- 使用统计分析软件进行数据分析（见 材料表）
- 创建一个新的XY表并以XY格式插入数据：行（X）是阴性对照，然后是递增的药物剂量，剂量以摩尔浓度为对数[抑制剂]。列 （Y） 是读出值，其中包含与列一起堆叠的仿行。
注意：阴性对照的浓度应指示为最小值（给定0在对数标度中是不可能的），例如，对数[抑制剂]，M = -10。 - 通过选择 “分析”>规范化 并使用以下参数来规范化值：分别规范化每个子列，Y = 0 为 0%，“每个子列中的最后一个值（或第一个，以较大者为准）”为 100%，结果为百分比，绘制结果。
- 通过选择 “分析> XY 分析”来拟合归一化数据上的非线性回归曲线 > 非线性回归 > 剂量反应 - 抑制>对数（抑制剂） 与 归一化反应 - 可变斜率。
- 将结果报告为非线性回归分析后输出的 IC50 值表和响应曲线图，包括归一化数据点作为平均 +/- 标准差和拟合回归曲线。
- 创建一个新的XY表并以XY格式插入数据：行（X）是阴性对照，然后是递增的药物剂量，剂量以摩尔浓度为对数[抑制剂]。列 （Y） 是读出值，其中包含与列一起堆叠的仿行。
Representative Results
已经注意到在建立NSCLC类器官方面存在相当大的挑战7。因此，很高兴看到最近的工作建立了肺癌类器官并将其用于药物治疗测定20，21，22。EGFR突变占NSCLC病例的11.3%23。EGFR抑制剂靶向治疗是EGFR突变型NSCLC的一线治疗选择，提高了患者的总体生存率和治疗安全性24。这项工作确定了FDA批准的EGFR酪氨酸激酶抑制剂osimertinib24，25在EGFR突变型NSCLC类器官中的敏感性。EGFR突变型NSCLC类器官由NSCLC患者的手术切除或肿瘤活检标本产生，并通过DNA测序证实含有指示的致癌突变。如上所述，EGFR突变型NSCLC类器官模型在治疗开始后五天通过基于发光的细胞存活读数评估的osimertinib和PDO活力的递增剂量进行处理。虽然EGFR突变体（EGFRdel19）阳性TH107类器官对osimertinib治疗表现出敏感性，半最大抑制浓度（IC50）为56 nM（图2A），但EGFR突变体（EGFRL858R）阳性TH116类器官对IC50大于1μM的osimertinib治疗具有抗药性（图2B）。EGFRdel19阳性TH107 NSCLC的敏感性伴随着显着的转录变化，包括细胞周期相关基因特征表达的减少和细胞凋亡相关基因特征表达的增加（补充图2A，B）。作为参考，给出了敏感的EGFRdel19阳性NSCLC细胞系PC9的响应数据（图3A，B）。后者包括通过基于2D发光的生存测定法对osimertinib增加剂量的存活分析（图3A）和通过蛋白质印迹在EGFR-MAPK信号传导水平上的信号抑制研究（图3B）。总体而言，该数据突出了当前方案在确定药物反应和区分敏感和耐药NSCLC PDO模型方面的准确性。需要进一步分析EGFRL858R阳性TH116类器官和可用的临床标本，以确定可能的耐药性相关改变。
图2：EGFR突变型NSCLC类器官模型对osimertinib升级的治疗反应曲线。 （A）敏感的EGFRdel19阳性TH107 NSCLC类器官模型中的Osimertinib反应。（B）奥西替尼在耐药EGFRL858R阳性TH116 NSCLC类器官模型中的反应。数据点显示为显示平均值 +/- 标准差的归一化值，并通过数据拟合非线性回归曲线。TH107， n = 每个数据点 6 次技术重复。TH116， n = 每个数据点 4 次技术复制。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在不同培养基中培养的敏感EGFR突变体NSCLC细胞系和类器官模型中对osimertinib的治疗反应的比较数据。 （A）敏感的EGFRdel19阳性NSCLC细胞系PC9中的Osimertinib反应，通过标准2D-CTG测定测定。（B）用osimertinib（2μM）处理两天后PC9细胞中的信号抑制。（C）在LGM和GM培养基中敏感的EGFRL858R阳性TH330 NSCLC类器官模型培养物中的Osimertinib反应。（D）奥西替尼在LGM和GM培养基中的耐药AZ021 NSCLC类器官模型中的反应。AZ021 中致癌性 EGFRL858R 突变的确认失败，可能是导致奥西替尼反应不足的原因。对于 A 和 C-D，数据点显示为显示均值 +/- 标准差的归一化值，并通过数据拟合非线性回归曲线。PC9， n = 每个数据点 3 次技术复制。TH330， n = 每个数据点 5 次技术复制。AZ021， n = 每个数据点 6 个技术复制。对归一化数据执行 Wilcoxon 秩检验以确定统计显著性。对于 TH330 （C），LGM 与 GM，** p = 0.0078。对于 AZ021 （D），LGM 与GM， ns p = 0.0742. 请点击此处查看此图的放大版本。
补充图1：用于EGFR突变类器官模型计数和活力评估的代表性细胞分析仪结果。 TH107和TH107BC是指不同的类器官模型，A和B是指生物复制。对于每个模型和生物重复，计算三个技术重复;均显示≥95%的生存能力。右侧显示细胞计数期间的代表性图像，显示强大的活力和单细胞解离。 请点击此处下载此文件。
补充图2： 使用EGFR突变体TH107 NSCLC类器官获得的批量RNA测序数据的基因集富集分析（GSEA），比较未处理的对照（DMSO）和用Osimertinib处理3天的细胞（OSI_D3）。（A-B）在靶向治疗后，敏感细胞将经历细胞周期G1停滞并停止活性增殖。由于G2M细胞周期基因的表达与主动增殖相关，因此预计在未经处理的对照（DMSO）中表达的名义富集。对于细胞凋亡相关基因，预计在处理过的细胞（OSI_D3）中进行名义富集。两者都已在用Osimertinib处理的EGFR突变体TH107 NSCLC类器官模型中得到证实：（A）GSEA用于Hallmark G2M表达特征（左）显示DMSO处理细胞中的富集。名义浓缩得分（NES）：+1.708，FDR<0.0001。（B）GSEA用于Hallmark Apoptosis表达签名（右）显示Osimertinib处理的细胞中的富集。NES： -1.075， FDR： ns， 0.3275. 请点击此处下载此文件。
补充图3： 在固定浓度存在第二种添加剂抑制剂的情况下，用Osimertinib升级处理的EGFR突变体TH330类器官模型的组合药物治疗。 EGFR突变型NSCLC中的耐药性相关改变，即SRC和AXL激活26，27，28，通过与SRC抑制剂Saracatinib（100 nM）或AXL抑制剂R428（500 nM）组合治疗，每个数据点 n = 6个技术重复。两种联合治疗均导致治疗反应增加，对Osimertinib与SRC抑制剂Saracatinib的组合具有重要意义。通过Wilcoxon秩检验评估统计学意义：奥西替尼与奥西替尼+沙拉卡替尼，*p = 0.0195;奥西替尼 vs.Osimertinib + R428， ns， p = 0.2500. 请点击此处下载此文件。
补充表1：类器官大小从接种（d0）到治疗后7天（d7）的变化。 （A）EGFRdel19阳性NSCLC类器官TH107的生长发育。（B）EGFRL858R阳性NSCLC类器官TH330的生长发育。 请点击此处下载此表格。
Discussion
本手稿开发并描述了一种用于评估NSCLC衍生的3D PDO模型中药物敏感性的标准化方案。除了药物敏感性研究外，还需要进一步表征可用的类器官模型，以确定药物敏感性差异的根本原因。这可能包括类器官和患者标本的遗传分析以及可用于类器官的其他分析，例如用于分化标志物的免疫组织化学染色以及一般细胞信号传导生物标志物和生理学13，29。
协议中的关键步骤
本文概述的方案提供了一个标准化的工作流程，在仔细遵循时允许准确和可重复的药物敏感性分析。在以下步骤中应特别注意：在单细胞悬浮液生成期间消化TrypLE和DNAse I，在BME2中接种单细胞悬浮液，监测类器官生长直至治疗，培养基变化，以及在基于发光的细胞存活读数期间BME2嵌入的类器官的破坏和裂解。（1）虽然在基于TrypLE的类器官解离后额外的DNAse I消化对于在常规培养维持期间扩展类器官模型不是必需的，但在药物升级实验播种时不应省略DNAse I消化，因为它确保了将类器官簇更好地分离成单细胞悬浮液和准确的细胞计数。（2）鉴于BME2在室温下凝固，在BME2中接种单细胞悬浮液是一个关键步骤。因此，一次最多需要播种1-2行，并且在播种其他行之前应将样品放在冰上。值得注意的是，当继续接种时，需要上下移液细胞，以允许均匀的细胞悬浮液。（3）从播种到处理的7天扩增期间，需要仔细监测类器官的生长。 图1B 和 补充表1给出了预期发展的示例。值得注意的是，如图 1B 所示，通过明场显微镜和图像分析评估类器官大小的变化，可以精确评估类器官生长和倍增时间的差异。倍增时间可对药物反应产生影响，正如文献中最近讨论的那样30。如果类器官生长速率显着超过所提出的示例，则可以考虑缩短直到治疗开始的扩张时间和更短的治疗持续时间。（4）此外，更换培养基时应特别注意，以避免吸入类器官。BME2嵌入的类器官的接种位置位于6点钟位置，当板顺时针旋转180°并且培养基在类器官的相反位置被吸入时，可以安全地吸入培养基。（5）最后，在生存读数期间彻底裂解BME2包埋的类器官对于记录准确的结果至关重要。根据制造商的说明，样品应反复上下移液，最好使用未过滤的吸头，以确保适当的裂解。应按所述遵循孵育时间。此外，使用ELISA板读数器将75%的裂解物（而不是总体积）转移到白色，不透明底部的96孔板进行最终读数，可以进行适当的评估，因为这可以确保每个孔中的相同体积并且没有可以通过剧烈移液引入的气泡。
值得注意的是，BME2包埋类器官培养物中的药物反应分析可能显示比常规细胞系培养物中观察到的更高的标准偏差（图2， 图3A）。较高的标准偏差基于几个因素，包括使用BME2时播种微小变化的可能性增加，以及在最初的7天生长期内孔中单个类器官生长速率的差异。因此，应接种每个药物浓度等于或超过四个的技术重复。
最重要的是，必须仔细评估携带致癌驱动突变的恶性细胞的存在以及正常气道上皮细胞的有限污染。建立NSCLC的挑战可能有利于正常气道上皮细胞的生长7。拷贝数分析或基于PCR和测序的方法来确认是否存在致癌驱动突变是确保NSCLC类器官培养质量的首选方法。
方法的修改和故障排除
添加到基本培养基溶液中的培养基和相应的生长因子可显著影响药物对靶向抑制剂的反应。它们激活影响和限制药物反应的旁路受体和信号通路（例如，FGF，HGF，EGF）26。虽然生长因子丰富且量身定制的培养基可能是扩大类器官培养的最佳选择，但如上所述，应在减少生长因子培养基中进行药物升级和敏感性评估。这是基于比较不同培养基配方和药物反应数据的内部经验（图3C）。虽然培养基溶液可以影响对某些药物治疗的敏感性程度，并且可以改变IC50 值，但无论培养基配方如何，敏感性或耐药性的稳定表型都是显而易见的（图3C，D）。此外，建议在类器官培养物中培养基配方和分析药物反应时保持一般一致性，并且需要接种每个浓度相同或超过四个技术重复。这对于基准测试灵敏度 与对感兴趣的抑制剂的耐药性。
该方法的局限性
这里介绍的方案描述了培养患者来源的癌细胞时NSCLC 3D癌症类器官模型对靶向抑制剂的敏感性。需要进行其他实验，包括关于通路抑制的药效学分析和对驱动癌基因和继发性突变存在的测序分析，以详细表征耐药性和敏感性。此外，旁观者因素，例如来自肿瘤微环境中非癌旁观者细胞相互作用或分泌因子的微环境刺激，不考虑旁观者因素，并且在尝试与免疫或基质细胞共培养类器官模型时需要新的方案。最近的工作强调了使用类器官模型来概括肿瘤微环境相互作用和剖析对免疫检查点抑制剂（如抗PD-L1治疗）的反应13，31。
该方法相对于现有/替代方法的重要性
3D癌症类器官模型概括了原始肿瘤中存在的遗传多样性和治疗反应的决定因素4，5，6。值得注意的是，时空异质性可以促进肿瘤进化，并且肿瘤亚克隆的平行出现和顺序发展可以发生32，33。肿瘤内异质性对于在治疗压力下选择更具弹性的肿瘤细胞具有重要意义9，34，35。此处提供的方案允许快速评估患者近端样本中靶向抑制剂治疗的敏感性。因此，类器官模型比缺乏遗传多样性或使用细胞系或患者来源的异种移植物进行长期研究的更传统的同质细胞系模型具有优势。此外，目前的方案允许扩大到多个治疗组和联合治疗方法，在成本和分析能力方面几乎没有限制。因此，以固定剂量添加第二种感兴趣的药物，同时升级主要靶向抑制剂并将其与主要靶向抑制剂的单独升级进行比较，可以有效地评估潜在的组合效应，并且所需的额外生物量最少（补充图3）。与用于监测类器官发育和药物反应的基于成像的评估相比，这里描述的基于发光的细胞存活测定具有相似的灵敏度，只需最少的设备和培训。
该方法在特定研究领域的重要性和潜在应用
开发一个标准化的管道，允许从患者标本和随后的药物敏感性分析中建立癌症类器官模型，具有显着的临床适用性潜力。 离体 药理学分析在检测肿瘤中的脆弱性和耐药相关特征方面已获得认可，与患者的治疗反应相关36，37。值得注意的是，药物敏感性的 离体 分析可能有助于临床中的治疗选择和设计解决耐药机制的合理组合治疗。总体而言，这种方法可以帮助改善分子治疗或组合治疗方案的个性化策略。后者可能有助于早期靶向药物耐受性和耐药机制，并加深临床反应，以改善未来的患者预后。
Disclosures
T.G.B.是Array Biopharma，Revolution Medicines，Novartis，AstraZeneca，Takeda，Springworks，Jazz Pharmaceuticals，Relay Therapeutics，Rain Therapeutics，Engine Biosciences的顾问，并获得Novartis，Strategia，Kinnate和Revolution Medicines的研究资助。
Acknowledgments
我们感谢Jeroen P Roose（UCSF）和Calvin J Kuo（斯坦福大学）的实验室在类器官培养和方案开发方面的意见。我们进一步感谢Oghenekevwe M. Gbenedio（Roose实验室，UCSF）的实验方案和样本建立投入。该研究项目是在NIH [U54CA224081]的支持下进行的。F. Haderk得到了德国癌症援助组织Mildred Scheel博士后奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
| 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
| 96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
| A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
| B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
| BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
| BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
| Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
| Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
| GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
| hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
| hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
| hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
| hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
| Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
| Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
| Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
| Multichannel pipette | |||
| N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
| Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
| Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
| Pipettes (different sizes) | |||
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
| SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
| Vacuum pump and tubing | |||
| Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |
References
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