Summary
Denne protokol beskriver en standardiseret evaluering af lægemiddelfølsomheder over for målrettede signalhæmmere i NSCLC-patientafledte organoidmodeller.
Abstract
Nye 3D-kræftorganoidkulturer afledt af kliniske patientprøver repræsenterer et vigtigt modelsystem til evaluering af intratumorheterogenitet og behandlingsrespons på målrettede hæmmere i kræft. Banebrydende arbejde inden for mave-tarm- og bugspytkirtelkræft har fremhævet løftet om patientafledte organoider (PTO'er) som et patient-nært-dyrkningssystem, hvor et stigende antal modeller dukker op. Tilsvarende har arbejdet i andre kræfttyper fokuseret på at etablere organoidmodeller og optimere kulturprotokoller. Især 3D-kræftorganoidmodeller opretholder den genetiske kompleksitet af originale tumorprøver og oversætter således tumorafledte sekventeringsdata til behandling med genetisk informerede målrettede terapier i en eksperimentel indstilling. Endvidere kan PPO'er fremme evalueringen af rationelle kombinationsbehandlinger for at overvinde resistensassocieret tilpasning af tumorer i fremtiden. Sidstnævnte fokuserer på intens forskningsindsats inden for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), da resistensudvikling i sidste ende begrænser behandlingssuccesen for målrettede hæmmere. En tidlig vurdering af terapeutisk målbare mekanismer ved hjælp af NSCLC PPO'er kan hjælpe med at informere rationelle kombinationsbehandlinger. Dette manuskript beskriver en standardiseret protokol til cellekulturpladebaseret vurdering af lægemiddelfølsomheder over for målrettede hæmmere i NSCLC-afledte 3D-PPO'er med potentiel tilpasningsevne til kombinationsbehandlinger og andre behandlingsmetoder.
Introduction
Personlige terapier mod onkogene drivere har revolutioneret kræftbehandlingen, forbedret patientens overlevelse og reduceret behandlingsmedierede bivirkninger1. Nylige fremskridt inden for molekylær diagnostik og sekventeringsteknologier har fremhævet kompleksiteten af humane tumorer, hvor rumlig og tidsmæssig heterogenitet påvirker behandlingsrespons2. Rekapitulerelse af disse subklonale forskelle i cellekulturmodeller har længe været begrænset til at undersøge udvalgte ændringer af interesse i ellers ensartede cellelinjer. Nyudviklede 3D BOB-modeller genereret af tumorbiopsier eller kirurgiske tumorresektioner giver mulighed for forbedret repræsentation af cellulær kompleksitet og signalering af krydstale inden for patientafledt tumorvæv3. Som sådan er tumororganoider afledt af gastrointestinal og bugspytkirtelkræft med succes blevet genereret og rekapitulere den genetiske mangfoldighed og determinanter for behandlingsrespons4,5,6. I forbindelse med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) anerkendes organoidudviklings- og etableringsudfordringer, og der er behov for optimering af dyrkningsteknikker og selektive mediefaktorer for at muliggøre en bredere og mere systematisk anvendelse af NSCLC-PDO'er i fremtiden7,8.
Udvikling af kombinatoriske terapier rettet mod resterende tumorceller, der modstår indledende lægemiddelbehandling, er afgørende for at hæmme resistensudvikling og i sidste ende for at forbedre patientens overlevelse9. I betragtning af organoidkulturernes arkitektoniske kompleksitet skal klassiske lægemiddelresponsparametre optimeres for at muliggøre nøjagtig og reproducerbar test af lægemiddelfølsomheder. Billeddannelsesbaserede udlæsninger10,11 og klassiske cellelevedygtighedsassays, der måler cellulær ATP-overflod6,12, blandt andre teknikker, er tilgængelige for at profilere lægemiddelresponser i BOB-kulturer. Her udvikler og beskriver vi en standardiseret protokol til evaluering af lægemiddelfølsomhed over for målrettet terapi mod kendte kliniske drivere i NSCLC BOB-modeller.
Protocol
For forskning på mennesker blev der opnået informeret samtykke, og vævsindsamling blev udført under UCSF Internal Review Board godkendte protokoller (IRB, protokol nr.: # 13-12492 eller CC # 17-23309). Etableringen af organoidkulturer fra afidentificerede kliniske prøver blev udført i samarbejde med forskningspartnere i henhold til tidligere offentliggjorte metoder13,14,15,16. Organoidkulturer blev hentet til vedligeholdelse og lægemiddeleskaleringseksperimenter ved passage tre eller senere. Alle følgende protokoller blev udført under aseptiske forhold i et laboratoriemiljø for pattedyrsvævskultur.
Figur 1: Protokolskematisk over arbejdsgange og kritiske trin i teknikken. (A) Eksperimentel arbejdsgang, herunder såning af organoider i 96-brøndsformat, behandling med lægemiddeleskalering 7 dage efter såning og luminescensbaseret celleoverlevelsesaflæsning 5 dage efter behandling ved hjælp af en ELISA-pladelæser. B) Et eksempelbillede af de EGFRdel19-positive TH107- og EGFRL858R-positive TH330 NSCLC-organoidkulturer. Originale kulturer, celler på tidspunktet for såning (dag 0) og organoider ved behandling starter 7 dage efter såning (dag 7) vises. Skalabjælke = 100 μm. Ændringer i organoiddiameter i løbet af den indledende 7-dages dyrkningsperiode kvantificeres og indikerer >2 gange stigning i organoidstørrelse. Relative foldændringer i størrelser på dag 7 sammenlignet med gennemsnitsstørrelsen på dag 0 er præsenteret under de repræsentative billeder. For TH107 observeres en foldændring på 2,38 over 7 dage, hvilket indikerer en fordoblingstid på 5,88 dage (141,12 timer). For TH330 observeres en foldændring på 2,41 over 7 dage, hvilket indikerer en fordoblingstid på 5,81 dage (139,42 timer). Kvantificering af ændringer i organoidstørrelse og statistisk evaluering præsenteres (højre). Statistisk signifikans beregnes ved uparret t-test, p < 0,0001. (C) Behandlingslayout for lægemiddeleskalering i organoid 96-brønds pladeformat. Antallet af tekniske replikater og eksemplariske doser er angivet, herunder en negativ kontrol. Skemaerne oprettes med BioRender, et webbaseret illustrationsværktøj. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Eksperimentelle præparater
- Forbered vækstmedium (GM) som tidligere rapporteret15: Dulbeccos modificerede Eagle's Medium/Hams næringsblanding F12 (DMEM/F-12) med L-alanyl-L-glutamin, suppleret med 100 U/ml penicillin/streptomycin, 10 mM HEPES, 25 nM hRspondin, 1x B27, 5 mM Nicotinamid, 1,25 mM N-Acetylcystein, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 μg/ml Primocin, 100 ng/ml hNoggin, 100 ng/ml hFGF-10, 25 ng/ml hFGF-7 (se materialetabellen).
BEMÆRK: Bland forsigtigt for at undgå skumdannelse og filtrer gennem et filtreringssystem på 0,22 μm. Varm medier til 37 °C inden for 1 time før brug. - Forbered medier med lav vækstfaktor (LGM) som tidligere rapporteret16 uden tilsætning af epidermal vækstfaktor (EGF): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's næringsblanding F12 (DMEM/F-12), suppleret med 1 mM HEPES, 1x L-alanyl-L-glutamin, 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamin, 10 mM Nicotinamid, 1 mM N-Acetylcystein, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng/ml hNoggin.
BEMÆRK: Bland forsigtigt for at undgå skumdannelse og filtrer gennem et 0,22 μm filter. Varm medier til 37 °C inden for 1 time før brug. - Optø BME2 (Reduceret vækstfaktor kældermembranekstrakt, type 2, se materialetabel) på is ved 4 °C natten over.
2. Generering af enkeltcellesuspension og såning af celler
- Dissociere nedsænket BME2-organoidkultur som beskrevet i følgende trin (2.1.1-2.1.6).
- Aspirer forsigtigt medier fra kulturpladerne. Undgå at røre ved den nedsænkede BME2-organoidkultur.
BEMÆRK: Medieaspiration kan udføres, som forskeren foretrækker, f.eks. med et grundlæggende væskeaspirationssystem eller ved hjælp af en pipette. Undgå at røre ved BME2 indlejrede organoider, da dette kan resultere i tab af organoid biomasse. - Trypsinize den nedsænkede BME2-organoidkultur med et egnet rekombinant enzym (se Tabel over materialer). I 6-brønds pladeformat tilsættes 2 ml pr. Brønd. Bryd BME2 mekanisk ved gentagne gange at pipettere op og ned. Inkuber plader ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i 5 min.
- Suspensionen overføres til et 15 ml centrifugerør og centrifuge ved 600 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer det rekombinante enzym omhyggeligt uden at røre ved organoidpillen.
BEMÆRK: Resterende BME2 kan være til stede. Gentag enzymets fordøjelse, hvis det er nødvendigt. - Resuspend organoidpillen i GM (trin 1.1). Tilsæt DNase I 1x 100 U/ml og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur (se Materialetabel).
- Centrifuge ved 600 x g i 3 min ved stuetemperatur. Pipette af medierne forsigtigt uden at røre ved organoidpillen og kassere. Resuspend i frisk GM.
- Aspirer forsigtigt medier fra kulturpladerne. Undgå at røre ved den nedsænkede BME2-organoidkultur.
- Såning af organoid enkeltcellesuspension
- Forvarm en ny sort, klarbundet 96-brønds plade ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i 10 minutter.
BEMÆRK: Brug af klare bundplader er afgørende for at overvåge organoidvækst og lægemiddelrespons. - Til optælling skal der fremstilles en 1:5 fortynding af cellesuspensionen i PBS (totalvolumen: 500 μL) og tæl cellesuspensionen ved hjælp af en celleanalysator (se Materialetabel).
BEMÆRK: Sørg for at gange med fortyndingsfaktoren (x 5) for at modtage den endelige cellekoncentration. Alternative tællemetoder såsom et hæmocytometer kan anvendes. Cellelevedygtighed bør overvåges ved hjælp af et levedygtighedsfarvningsassay (f.eks. Med Trypan Blue17). Ved hjælp af en celleanalysator vurderes levedygtigheden automatisk. Levedygtigheden af organoide enkeltcellesuspensioner som evalueret af celleanalysatoren bør være ≥95% (supplerende figur 1). - Beregn volumenet af cellesuspensionen, der er nødvendig for at frø til eksperimentet.
BEMÆRK: Såkoncentrationen er 1500 celler / μL BME2, med 5 μL BME2 nødvendig pr. Brønd (Samlet antal: 7500 celler / brønd). For en 96-brønds plade kræves 6 x 10E5 celler. Dette omfatter såning af 60 brønde med organoidkupler (4,5 x 10E5) og eksperimentelt overskud (beregning for i alt 80 brønde). - Forbered en alikvot cellesuspension i et 1,5 ml mikrocentrifugerør pr. Hver 96-brønds plade, der er planlagt til at blive podet, hvis flere 96-brøndsplader er inkluderet i eksperimentet.
BEMÆRK: Eksperimentelt overskud og separate alikvoter pr. Seedet 96-brønds plade er nødvendige for at tage højde for den øgede eksperimentelle bias på grund af håndtering af BME2. - Aliquotceller fra enkeltcellesuspensionen som beregnet (trin 2.2.3) efter omhyggelig resuspension ved pipettering op og ned. Pelletsceller ved 600 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt medier ved hjælp af en P200-pipette uden at røre ved cellepillen. Placer cellepiller på is kort tid (~ 1 min) og genophæng cellepillen i BME2.
BEMÆRK: Restmedier kan kompromittere BME2-struktur og stivhed. Pipette af alle medier omhyggeligt. Placer celler på is kort for at akklimatisere cellepillen og tillade celler at blive resuspended i BME2 uden at klumpe. Hold BME2 på is konstant, så den forbliver i flydende tilstand. For en 96-brønds plade er der brug for 400 μL BME2 til resuspension af cellepillen. Resuspend cellepiller omhyggeligt, undgå introduktion af bobler. - Vip din forvarmede sorte, klare bund 96-brønds plade mod dig. Pladeceller ved hjælp af 5 μL cellesuspension pr. brønd og podningscellekupler ved klokken 6 for hver brønd (figur 1A). Frø cellekuplerne i de resterende indre brønde (kolonner 2-10 og rækker B-G af en 96-brønds plade).
BEMÆRK: Omvendt pipettering18 anbefales ved håndtering af BME2. - Flyt ikke pladen med 96 brønde og inkuber nyfrøede cellekupler i cellekulturens laminære strømningshætte i 5 minutter ved stuetemperatur. Flyt derefter pladen til cellekulturinkubatoren og inkuber den i 10 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt forsigtigt 100 μL GM pr. brønd til alle brønde, der indeholder organoider (kolonne 2-10 og rækker B-G på en plade med 96 brønde). Der tilsættes 100 μL PBS til de ydre brønde ved pladens kant.
- Kultur BME2 indlejrede organoider i GM-medier ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i alt 7 dage. Undersøg regelmæssigt væksten af organoider under lysmikroskopet.
BEMÆRK: Der henvises til figur 1B og supplerende tabel 1 for et eksempel på den forventede vækstfremgang fra såning til behandlingsdagen. - Skift mediet en gang efter 3-4 dages kultur: Drej pladen med uret med 180 ° (organoider nu klokken 12), aspirer forsigtigt GM fra modsat position til organoidkuppel ved hjælp af et multikanalsapparat, hvis det er tilgængeligt, og tilsæt derefter frisk GM.
- Forvarm en ny sort, klarbundet 96-brønds plade ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i 10 minutter.
3. Lægemiddelbehandling
- Forbered en seriel lægemiddelfortynding i LGM til det valgte lægemiddel, f.eks. osimertinib, til behandling af EGFR-mutante NSCLC-organoider. Inkluder en negativ kontrol (LGM-medier + 0,1% DMSO). Forbered tilstrækkelige lægemiddelallikvoter af alle doser i henhold til antallet af brønde, der er podet plus eksperimentelt overskud.
BEMÆRK: En fortyndingsserie, der omfatter ≥8 doser og spænder fra 1 nM-10 μM, anbefales til målrettede hæmmere. - Drej organoidpladen med uret med 180° (organoider nu klokken 12). Aspirer forsigtigt GM ved hjælp af et flerkanalsapparat fortrinsvis.
BEMÆRK: Undgå at røre ved organoidkuplen, mens du aspirerer GM'en, da dette kan resultere i tab af organoid biomasse og slagresultater. - Tilsæt 100 μL kontrol (f.eks. LGM-medier + 0,1% DMSO) eller lægemiddelopløsning pr. Brønd.
BEMÆRK: Se figur 1C for lægemiddeleskaleringsbehandling skematisk i 96-brønds pladeformat. - Inkubere behandlede organoider ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i 5 dage.
4. Aflæsning ved luminescensbaseret overlevelsesassay
- Høst og overlevelse aflæsning
- Udfør overlevelsesassayet i henhold til Reference19.
- Optøningsreagens (se materialetabel) natten over ved 4 °C. Ligevægt reagens i et vandbad ved stuetemperatur i 30 minutter før brug og bland ved invertering.
- Tilsæt et lige stort volumen af reagenset til hver brønd (100 μL pr. Brønd). Bland grundigt ved at pibere op og ned, med pipettespidsen placeret på placeringen af den organoide kuppel. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Brug en flerkanalspipette til at overføre ca. 75% (150 μL) af lysatet (trin 4.1.1.2) til en ny hvid, uigennemsigtig bund 96-brønds plade.
BEMÆRK: Overførsel af 75% lysater til en ny plade sikrer fraværet af bobler i den senere udlæsning uden at påvirke assayfølsomheden. - Inkuber i yderligere 25 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Registrer luminescens ved hjælp af en ELISA-pladelæser (integrationstid 0,25-1 s/pr. brønd) (se Materialetabel).
- Gem data i et passende format, f.eks. en datatabel, der indeholder alle rå læsninger og registrering af pladelayoutet og de anvendte lægemidler.
- Udfør overlevelsesassayet i henhold til Reference19.
- Dataanalyse ved hjælp af statistisk analysesoftware (se tabel over materialer)
- Opret en ny XY-tabel, og indsæt data i et XY-format: Rækker (X) er negativ kontrol efterfulgt af eskalerende lægemiddeldoser med doser som log [Inhibitor] i molær koncentration. Kolonner (Y) er udlæsningsværdier, der indeholder replikater, der er stablet sammen med kolonner.
BEMÆRK: Koncentrationen af den negative kontrol skal angives som en minimal værdi (givet 0 er ikke mulig i logskala), f.eks. log [Inhibitor], M = -10. - Normaliser værdier ved at vælge Analysér > Normaliser og brug følgende parametre: normaliser hver underkolonne separat, Y = 0 som 0 %, "sidste værdi i hver underkolonne (eller først, alt efter hvad der er størst)" som 100 %, resulterer i procentdele, graf resultaterne.
- Tilpas ikke-lineær regressionskurve på normaliserede data ved at vælge Analysér > XY-analyser > Ikke-lineær regression > Dosisrespons - Hæmning > log (hæmmer) vs . normaliseret respons - Variabel hældning.
- Rapportér resultaterne som en tabel med IC50-værdier udsendt efter ikke-lineær regressionsanalyse og graf over responskurven, herunder normaliserede datapunkter som gennemsnitlig +/- standardafvigelse og monteret regressionskurve.
- Opret en ny XY-tabel, og indsæt data i et XY-format: Rækker (X) er negativ kontrol efterfulgt af eskalerende lægemiddeldoser med doser som log [Inhibitor] i molær koncentration. Kolonner (Y) er udlæsningsværdier, der indeholder replikater, der er stablet sammen med kolonner.
Representative Results
Der er konstateret betydelige udfordringer med at etablere NSCLC-organoider7. Det er således spændende at se det seneste arbejde med at etablere lungekræftorganoider og bruge dem til lægemiddelbehandlingsassays20,21,22. EGFR-mutationer tegner sig for 11,3 % af NSCLC-tilfældene23. Målrettet behandling med EGFR-hæmmere udgør førstelinjebehandlingsmuligheden i EGFR-mutant NSCLC og har forbedret den samlede overlevelses- og behandlingssikkerhed hos patienter24. Dette arbejde bestemte følsomheden over for den FDA-godkendte EGFR-tyrosinkinasehæmmer osimertinib24,25 i EGFR-mutante NSCLC-organoider. EGFR-mutante NSCLC-organoider blev genereret fra kirurgisk resektion eller tumorbiopsiprøver af NSCLC-patienter og bekræftet at have den indikerede onkogene mutation ved DNA-sekventering. Som beskrevet ovenfor blev EGFR-mutante NSCLC-organoidmodeller behandlet med eskalerende doser af osimertinib og BOB-levedygtighed vurderet ved luminescensbaseret celleoverlevelsesaflæsning fem dage efter behandlingsstart. Mens EGFR-mutant (EGFRdel19)-positive TH107-organoider viste følsomhed over for osimertinib-behandling med en halvmaksimal hæmmende koncentration (IC50) på 56 nM (figur 2A), var EGFR-mutant (EGFRL858R)-positive TH116-organoider resistente over for osimertinibbehandling med en IC50 på over 1 μM (figur 2B). Følsomheden af EGFRdel19-positiv TH107 NSCLC blev ledsaget af signifikante transkriptionelle ændringer, herunder en reduktion i ekspressionen af cellecyklus-associerede gensignaturer og en stigning i ekspressionen af apoptose-associerede gensignaturer (supplerende figur 2A,B). Som reference præsenteres responsdata for den følsomme EGFRdel19-positive NSCLC-cellelinje PC9 (figur 3A,B). Sidstnævnte omfatter overlevelsesanalyse til eskalerende doser af osimertinib ved hjælp af et 2D-luminescensbaseret overlevelsesassay (figur 3A) og undersøgelsen af signalundertrykkelse på niveauet af EGFR-MAPK-signalering af Western blot (figur 3B). Samlet set fremhæver disse data nøjagtigheden af den nuværende protokol til bestemmelse af lægemiddelrespons og skelnen mellem følsomme og resistente NSCLC BOB-modeller. Yderligere analyser af EGFRL858R-positiv TH116-organoid og tilgængelige kliniske prøver er nødvendige for at bestemme mulige resistensrelaterede ændringer.
Figur 2: Behandlingsresponskurve for EGFR-mutante NSCLC-organoidmodeller til osimertinib-eskalering. A) Osimertinib-respons i den følsomme EGFRdel19-positive TH107 NSCLC-organoidmodel. B) Osimertinib-respons i den resistente EGFRL858R-positive TH116 NSCLC-organoidmodel. Datapunkter præsenteres som normaliserede værdier, der viser den gennemsnitlige +/- standardafvigelse, med en ikke-lineær regressionskurve monteret gennem dataene. TH107, n = 6 tekniske replikater pr. datapunkt. TH116, n = 4 tekniske replikater pr. datapunkt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenlignende data for behandlingsresponset på osimertinib i en følsom EGFR-mutant NSCLC-cellelinje og organoidmodeller dyrket i forskellige medier. A) Osimertinib-respons i den følsomme EGFRdel19-positive NSCLC-cellelinje PC9, bestemt ved standard 2D-CTG-assay. (B) Signalundertrykkelse i PC9-cellerne ved to-dages behandling med osimertinib (2 μM). C) Osimertinib-respons i den følsomme EGFRL858R-positive TH330 NSCLC-organoidmodelkultur i LGM- og GM-medier. D) Osimertinib-respons i den resistente AZ021 NSCLC-organoidmodel i LGM- og GM-medier. Bekræftelse af den onkogene EGFRL858R-mutation i AZ021 mislykkedes og kan være årsag til manglen på osimertinib-respons. For A og C-D præsenteres datapunkter som normaliserede værdier, der viser den gennemsnitlige +/- standardafvigelse, med en ikke-lineær regressionskurve monteret gennem dataene. PC9, n = 3 tekniske replikater pr. datapunkt. TH330, n = 5 tekniske replikater pr. datapunkt. AZ021, n = 6 tekniske replikater pr. datapunkt. En Wilcoxon rangtest blev udført på normaliserede data for at bestemme den statistiske signifikans. For TH330 (C), LGM vs. GM, ** p = 0,0078. For AZ021 (D), LGM vs. GM, ns p = 0,0742. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Repræsentative celleanalysatorresultater til optælling og levedygtighedsvurdering af EGFR-mutante organoidmodeller. TH107 og TH107BC henviser til forskellige organoidmodeller og A og B til biologiske replikater. For hver model og biologisk replikat tælles tre tekniske replikater; alle viser ≥95% levedygtighed. Et repræsentativt billede under celletælling er præsenteret til højre, der viser robust levedygtighed og enkeltcelle dissociation. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Gensætberigelsesanalyse (GSEA) ved anvendelse af bulk-RNA-sekventeringsdata opnået for EGFR-mutante TH107 NSCLC-organoider, der sammenligner ubehandlet kontrol (DMSO) og celler behandlet med Osimertinib i 3 dage (OSI_D3). (A-B) Efter målrettet behandling vil følsomme celler gennemgå cellecyklus G1-anholdelse og ophøre med aktiv proliferation. Da ekspression af G2M-cellecyklusgener er forbundet med aktiv proliferation, forventes en nominel berigelse af ekspression i den ubehandlede kontrol (DMSO). For apoptoserelaterede gener forventes en nominel berigelse i behandlede celler (OSI_D3). Begge er blevet bekræftet i EGFR-mutant TH107 NSCLC-organoidmodellen behandlet med Osimertinib: (A) GSEA for Hallmark G2M-ekspressionssignatur (til venstre) viser berigelse i DMSO-behandlede celler. Nominel berigelsesscore (NES): +1.708, FDR < 0.0001. (B) GSEA for Hallmark Apoptose ekspressionssignatur (til højre) viser berigelse i Osimertinib-behandlede celler. NES: -1.075, FDR: ns, 0.3275. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Kombinatorisk lægemiddelbehandling i EGFR-mutant TH330-organoidmodel behandlet med Osimertinib-eskalering i nærvær af en anden additivhæmmer i en fast koncentration. Resistensrelaterede ændringer i EGFR-mutant NSCLC, dvs. SRC- og AXL-aktivering26,27,28, var farmakologiske målrettet ved kombinatorisk behandling med SRC-hæmmer Saracatinib (100 nM) eller AXL-hæmmer R428 (500 nM), n = 6 tekniske replikater pr. datapunkt. Begge kombinatoriske behandlinger resulterede i øget behandlingsrespons med betydning for kombinationen af Osimertinib med SRC-hæmmer Saracatinib. Statistisk signifikans blev evalueret af Wilcoxon rangtest: Osimertinib versus Osimertinib + Saracatinib, *p = 0,0195; Osimertinib vs. Osimertinib + R428, ns, p = 0,2500. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Ændring af organoidstørrelse fra såning (d0) til 7 dage efter behandling (d7). A) Vækstudvikling i EGFRdel19-positiv NSCLC-organoid TH107. B) Vækstudvikling inden for EGFRL858R-positiv NSCLC-organoid TH330. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Dette manuskript udvikler og beskriver en standardiseret protokol til vurdering af lægemiddelfølsomhed i NSCLC-afledte 3D BOB-modeller. Ud over lægemiddelfølsomhedsundersøgelser er der behov for yderligere karakterisering af tilgængelige organoidmodeller for at bestemme de underliggende årsager til forskelle i lægemiddelfølsomhed. Dette kan omfatte genetisk profilering af organoider og patientprøver og anden analyse til rådighed for organoider, såsom immunohistokemifarvning til differentieringsmarkører og generelle cellulære signalbiomarkører og fysiologi13,29.
Kritiske trin i protokollen
Protokollen, der er beskrevet heri, giver en standardiseret arbejdsgang, der muliggør nøjagtige og reproducerbare lægemiddelfølsomhedsanalyser, når de følges nøje. Der skal udvises særlig forsigtighed i følgende trin: TrypLE og DNAse I fordøjelse under generering af enkeltcellesuspensioner, såning af enkeltcellesuspensioner i BME2, overvågning af organoidvækst indtil behandling, medieændringer og forstyrrelse og lysis af BME2-indlejrede organoider under luminescensbaseret celleoverlevelsesudlæsning. (1) Mens yderligere DNAse I-fordøjelse efter TrypLE-baseret dissociation af organoider ikke er afgørende for at udvide organoidmodeller under regelmæssig dyrkningsvedligeholdelse, bør DNAse I-fordøjelsen ikke udelades ved podning til lægemiddeleskaleringsforsøg, da det sikrer bedre adskillelse af organoidklynger i enkeltcellesuspensioner og nøjagtig celletælling. (2) Såning af enkeltcellesuspension i BME2 udgør et kritisk trin i betragtning af størkningen af BME2 ved stuetemperatur. Således skal maksimalt 1-2 rækker sås på én gang, og prøver skal placeres på is, før yderligere rækker sås. Bemærk, at celler skal pipetteres op og ned, når såning fortsættes for at muliggøre en homogen cellesuspension. (3) Organoidvæksten skal overvåges nøje i løbet af 7-dages udvidelsen fra såning til behandling. Et eksempel på den forventede udvikling findes i figur 1B og supplerende tabel 1. Det bemærkes, at vurderingen af ændringer i organoidstørrelsen ved hjælp af lysfeltmikroskopi og billedanalyse som vist i figur 1B kan muliggøre en præcis evaluering af forskelle i organoidvækst og fordoblingstider. Fordoblingstider kan have indflydelse på lægemiddelresponser, som for nylig diskuteret i litteraturen30. Hvis den organoide væksthastighed overstiger det præsenterede eksempel betydeligt, kan en kortere ekspansionstid indtil behandlingens start og kortere behandlingsvarighed overvejes. (4) Desuden bør der være særlig forsigtighed ved skift af medier for at undgå aspirerende organoider. Såningspositionen af BME2-indlejrede organoider ved klokken 6 muliggør en sikker aspiration af medier, når pladerne drejes med uret med 180 °, og medier aspireres i den modsatte position af organoiderne. (5) Endelig er grundig lysis af BME2-indlejrede organoider under overlevelsesaflæsningen afgørende for at registrere nøjagtige resultater. I henhold til producentens anvisninger skal prøver pipetteres op og ned gentagne gange, ideelt set ved hjælp af ufiltrerede spidser, for at sikre korrekt lysis. Inkubationstider skal følges som beskrevet. Endvidere giver overførsel af 75% af lysatet (i stedet for det samlede volumen) til en hvid, uigennemsigtig bundplade med 96 brønde til den endelige udlæsning ved hjælp af en ELISA-pladelæser mulighed for en passende vurdering, da dette sikrer det samme volumen i hver brønd og fraværet af luftbobler, der kan indføres ved kraftig pipettering.
Det bemærkes, at profilering af lægemiddelresponser i BME2-indlejrede organoidkulturer kan vise en højere standardafvigelse end observeret i almindelige cellelinjekulturer (figur 2, figur 3A). Den højere standardafvigelse er baseret på flere faktorer, herunder en øget sandsynlighed for mindre variationer i såning ved arbejde med BME2 og forskelle i individuelle organoidvækstrater på tværs af brønde i løbet af den indledende 7-dages vækstperiode. Således bør der sås lig med eller mere end fire tekniske replikater pr. Lægemiddelkoncentration.
Vigtigst er det, at tilstedeværelsen af maligne celler, der bærer den onkogene drivermutation og begrænset forurening med normale luftvejsepitelceller, skal evalueres omhyggeligt. Udfordringer i NSCLC-etablering kan favorisere udvæksten af normale luftvejsepitelceller7. Kopinummerprofilering eller PCR- og sekventeringsbaserede tilgange til bekræftelse af tilstedeværelsen af de onkogene drivermutationer er de valgte metoder til at sikre kvaliteten af NSCLC-organoidkulturer.
Ændringer og fejlfinding af metoden
Medier og respektive vækstfaktorer tilføjet til grundlæggende medieløsninger kan påvirke lægemiddelresponset på målrettede hæmmere betydeligt. De aktiverer bypassreceptorer og signalveje, der påvirker og begrænser lægemiddelrespons (f.eks. FGF, HGF, EGF)26. Mens et vækstfaktorrigt og skræddersyet medie kan være optimalt til at udvide organoidkulturen, bør lægemiddeleskalering og følsomhedsvurderinger udføres i et reduceret vækstfaktormedie som beskrevet ovenfor. Dette er baseret på intern erfaring med at sammenligne forskellige medieformuleringer og lægemiddelresponsdata (figur 3C). Mens medieløsninger kan påvirke graden af følsomhed over for visse lægemidler og kan ændre IC50-værdier, er robuste fænotyper af følsomhed eller resistens tydelige uanset medieformulering (figur 3C,D). Derudover anbefales generel konsistens i medieformuleringen og profilering af lægemiddelresponser på tværs af organoidkulturer, og en lige eller mere end fire tekniske replikater pr. Koncentration skal podes. Dette er især vigtigt for benchmarkintervaller i følsomhed vs. modstand mod inhibitoren af interesse.
Begrænsninger af metoden
Protokollen, der præsenteres her, beskriver følsomheden af NSCLC 3D-kræftorganoidmodeller over for målrettede hæmmere, når patientafledte kræftceller dyrkes. Yderligere forsøg, herunder farmakodynamisk analyse vedrørende pathway hæmning og sekventering analyse for tilstedeværelsen af driver onkogen og sekundære mutationer, er nødvendige for en detaljeret karakterisering af lægemiddelresistens og følsomhed. Endvidere tages der ikke højde for tilskuerfaktorer såsom mikromiljømæssige stimuli afledt af interaktioner eller udskillede faktorer af ikke-kræftbystanderceller i tumormikromiljøet, og der er behov for nye protokoller, når der forsøges organoidmodeller med immun- eller stromalceller. Nyligt arbejde har fremhævet brugen af organoidmodeller til at rekapitulere tumormikromiljøinteraktioner og profilresponser på immun checkpoint-hæmmere, såsom anti-PD-L1-behandling13,31.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
3D-kræftorganoidmodeller rekapitulerer den genetiske mangfoldighed og determinanter for behandlingsrespons, der er til stede i den oprindelige tumor4,5,6. Især kan rumlig og tidsmæssig heterogenitet fremme tumorudvikling, og parallel fremkomst og sekventiel udvikling af tumorsubkloner kan forekomme32,33. Intratumorheterogenitet er signifikant for udvælgelsen af mere modstandsdygtige tumorceller under terapeutisk tryk9,34,35. Protokollen, der gives her, giver mulighed for en hurtig vurdering af følsomheder over for behandling med målrettede hæmmere i patientnærprøver. Organoidmodeller har således fordele i forhold til mere konventionelle homogene cellelinjemodeller, der mangler genetisk mangfoldighed eller langsigtede undersøgelser ved hjælp af cellelinjer eller patientafledte xenografts. Desuden tillader den nuværende protokol opskalering til flere behandlingsarme og kombinationsbehandlingsmetoder med få begrænsninger med hensyn til omkostninger og analytisk kapacitet. Som sådan giver tilføjelse af et andet lægemiddel af interesse i en fast dosis, samtidig med at den primært målrettede hæmmer eskaleres og sammenlignes med eskaleringen af den primært målrettede hæmmer alene, mulighed for effektivt at evaluere de potentielle kombinatoriske virkninger og med minimal yderligere biomasse, der kræves (supplerende figur 3). Sammenlignet med billeddannelsesbaserede vurderinger, der bruges til at overvåge organoidudvikling og lægemiddelrespons, har det luminescensbaserede celleoverlevelsesassay, der er beskrevet her, lignende følsomhed med minimalt udstyr og træning, der kræves.
Metodens betydning og potentielle anvendelsesmuligheder inden for specifikke forskningsområder
Udvikling af en standardiseret pipeline, der gør det muligt at etablere kræftorganoidmodeller fra patientprøver og den efterfølgende profilering af lægemiddelfølsomheder, har et betydeligt klinisk anvendelighedspotentiale. Ex vivo farmakologisk profilering har opnået anerkendelse ved påvisning af sårbarheder og resistente associerede træk i tumorer, der korrelerer med behandlingsrespons hos patienter36,37. Det er bemærkelsesværdigt, at ex vivo-profilering af lægemiddelfølsomheder kan hjælpe med behandlingsvalg i klinikken og design af rationelle kombinationsbehandlinger, der adresserer resistensmekanismer. Samlet set kan denne tilgang bidrage til at muliggøre forbedrede personlige strategier for molekylær terapi eller kombinatoriske behandlingsregimer. Sidstnævnte kan hjælpe med at målrette lægemiddeltolerance og resistensmekanismer tidligt og uddybe klinisk respons for at forbedre patientresultaterne i fremtiden.
Disclosures
T.G.B. er rådgiver for Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences og modtager forskningsmidler fra Novartis, Strategia, Kinnate og Revolution Medicines.
Acknowledgments
Vi takker laboratorierne Jeroen P Roose (UCSF) og Calvin J Kuo (Stanford) for deres input vedrørende organoidkultur og protokoludvikling. Vi takker endvidere Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) for protokoller og input fra prøveetablering. Dette forskningsprojekt blev gennemført med støtte fra NIH [U54CA224081]. F. Haderk blev støttet af Mildred Scheel postdoc-stipendiet fra den tyske kræfthjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
| 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
| 96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
| A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
| B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
| BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
| BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
| Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
| Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
| GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
| hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
| hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
| hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
| hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
| Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
| Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
| Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
| Multichannel pipette | |||
| N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
| Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
| Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
| Pipettes (different sizes) | |||
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
| SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
| Vacuum pump and tubing | |||
| Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |
References
- de Bono, J. S., Ashworth, A. Translating cancer research into targeted therapeutics. Nature. 467 (7315), 543-549 (2010).
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Dijkstra, K. K., et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Reports. 31 (5), 107588 (2020).
- Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Bivona, T. G., Doebele, R. C. A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers. Nature Medicine. 22 (5), 472-478 (2016).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Tashiro, T., et al. In vivo and ex vivo cetuximab sensitivity assay using three-dimensional primary culture system to stratify KRAS mutant colorectal cancer. PLoS One. 12 (3), 0174151 (2017).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Hysenaj, L., et al. SARS-CoV-2 infection studies in lung organoids identify TSPAN8 as novel mediator. bioRxiv. , (2021).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocol in Immunology. , Appendix 3, Appendix 3B (2001).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Promega Corporation. CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay. Promega Corporation. , (2021).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communication. 10 (1), 3991 (2019).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communication. 12 (1), 2581 (2021).
- Shi, R., et al. Organoid cultures as preclinical models of non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (5), 1162-1174 (2020).
- Collisson, E. A., et al. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511 (7511), 543-550 (2014).
- Ramalingam, S. S., et al. Overall Survival with Osimertinib in untreated, EGFR-mutated advanced NSCLC. New England Journal of Medicine. 382 (1), 41-50 (2019).
- Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 378 (2), 113-125 (2017).
- Rotow, J., Bivona, T. G. Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC. Nature Reviews Cancer. 17 (11), 637-658 (2017).
- Zhang, Z., et al. Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer. Nature Genetics. 44 (8), 852-860 (2012).
- Kanda, R., et al. Erlotinib resistance in lung cancer cells mediated by integrin β1/Src/Akt-driven bypass signaling. Cancer Research. 73 (20), 6243-6253 (2013).
- Bruun, J., et al. Patient-derived organoids from multiple colorectal cancer liver metastases reveal moderate intra-patient pharmacotranscriptomic heterogeneity. Clinical Cancer Research. 26 (15), 4107-4119 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Yuki, K., Cheng, N., Nakano, M., Kuo, C. J. Organoid models of tumor immunology. Trends in Immunology. 41 (8), 652-664 (2020).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Rambow, F., et al. Toward minimal residual disease-directed therapy in melanoma. Cell. 174 (4), 843-855 (2018).
- Marine, J. C., Dawson, S. J., Dawson, M. A. Non-genetic mechanisms of therapeutic resistance in cancer. Nature Reviews Cancer. 20 (12), 743-756 (2020).
- Frismantas, V., et al. Ex vivo drug response profiling detects recurrent sensitivity patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia. Blood. 129 (11), 26-37 (2017).
- Drusbosky, L. M., et al. Predicting response to BET inhibitors using computational modeling: A BEAT AML project study. Leukemia Research. 77, 42-50 (2019).
