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Cancer Research

प्रोफाइलिंग ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स में लक्षित उपचारों के लिए संवेदनशीलता

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63039
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Medicine, University of California, San Francisco, 2Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 3Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco

Summary

यह प्रोटोकॉल एनएससीएलसी रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड मॉडल में लक्षित सिग्नलिंग अवरोधकों के लिए दवा संवेदनशीलता के मानकीकृत मूल्यांकन का वर्णन करता है।

Abstract

नैदानिक रोगी के नमूनों से व्युत्पन्न उपन्यास 3 डी कैंसर ऑर्गेनोइड संस्कृतियां कैंसर में लक्षित अवरोधकों के लिए इंट्राट्यूमर विषमता और उपचार प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करती हैं। गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल और अग्नाशय के कैंसर में अग्रणी काम ने रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) के वादे को रोगी-निकटवर्ती संस्कृति प्रणाली के रूप में उजागर किया है, जिसमें उभरते हुए मॉडल की बढ़ती संख्या है। इसी तरह, अन्य कैंसर प्रकारों में काम ने ऑर्गेनोइड मॉडल स्थापित करने और संस्कृति प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। विशेष रूप से, 3 डी कैंसर ऑर्गेनोइड मॉडल मूल ट्यूमर नमूनों की आनुवंशिक जटिलता को बनाए रखते हैं और इस प्रकार एक प्रयोगात्मक सेटिंग में आनुवंशिक रूप से सूचित लक्षित उपचारों के साथ उपचार में ट्यूमर-व्युत्पन्न अनुक्रमण डेटा का अनुवाद करते हैं। इसके अलावा, पीडीओ भविष्य में ट्यूमर के प्रतिरोध से जुड़े अनुकूलन को दूर करने के लिए तर्कसंगत संयोजन उपचारों के मूल्यांकन को बढ़ावा दे सकते हैं। उत्तरार्द्ध गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) में गहन अनुसंधान प्रयासों पर केंद्रित है, क्योंकि प्रतिरोध विकास अंततः लक्षित अवरोधकों की उपचार सफलता को सीमित करता है। एनएससीएलसी पीडीओ का उपयोग करके चिकित्सीय रूप से लक्षित तंत्र का प्रारंभिक मूल्यांकन तर्कसंगत संयोजन उपचारों को सूचित करने में मदद कर सकता है। यह पांडुलिपि एनएससीएलसी-व्युत्पन्न 3 डी पीडीओ में लक्षित अवरोधकों के लिए दवा संवेदनशीलता के सेल संस्कृति प्लेट-आधारित मूल्यांकन के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है, जिसमें संयोजन उपचार और अन्य उपचार के तरीकों के लिए संभावित अनुकूलन क्षमता होती है।

Introduction

ऑन्कोजेनिक ड्राइवरों के खिलाफ व्यक्तिगत उपचारों ने कैंसर के उपचार में क्रांति ला दी है, रोगी के अस्तित्व में सुधार किया है और उपचार-मध्यस्थता दुष्प्रभावों को कम किया है। आणविक निदान और अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति ने मानव ट्यूमर की जटिलता पर प्रकाश डाला है, जिसमें स्थानिक और अस्थायी विषमता उपचार प्रतिक्रिया को प्रभावित करती है2। सेल संस्कृति मॉडल में इन subclonal मतभेदों recapitulating लंबे समय से अन्यथा समान सेल लाइनों में ब्याज के चयनित परिवर्तनों की जांच करने के लिए सीमित किया गया है। ट्यूमर बायोप्सी या सर्जिकल ट्यूमर लकीरों से उत्पन्न नव विकसित 3 डी पीडीओ मॉडल सेलुलर जटिलता के बेहतर प्रतिनिधित्व और रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऊतक 3 के भीतर क्रॉसस्टॉक सिग्नलिंग के लिए अनुमति देते हैं। इस प्रकार, जठरांत्र संबंधी और अग्नाशय के कैंसर से व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स सफलतापूर्वक उत्पन्न हुए हैं और आनुवंशिक विविधता और उपचार प्रतिक्रिया के निर्धारकों को फिर से शुरू करते हैं4,5,6। गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) में, ऑर्गेनोइड विकास और स्थापना चुनौतियों को स्वीकार किया जाता है, और भविष्य में एनएससीएलसी पीडीओ के व्यापक और अधिक व्यवस्थित उपयोग को सक्षम करने के लिए संस्कृति तकनीकों और चयनात्मक मीडिया कारकों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है7,8।

अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित करने वाले संयोजी उपचारों को विकसित करना जो प्रारंभिक दवा उपचार का सामना करते हैं, प्रतिरोध विकास को रोकने और अंततः रोगी के अस्तित्व में सुधार करने के लिए आवश्यक है। ऑर्गेनोइड संस्कृतियों की वास्तुकला जटिलता को देखते हुए, शास्त्रीय दवा प्रतिक्रिया मापदंडों को दवा संवेदनशीलता के सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परीक्षण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है। इमेजिंग-आधारित readouts10,11 और शास्त्रीय सेल व्यवहार्यता assays सेलुलर एटीपी बहुतायत को मापने6,12, अन्य तकनीकों के बीच, पीडीओ संस्कृतियों में प्रोफ़ाइल दवा प्रतिक्रियाओं के लिए उपलब्ध हैं। यहां, हम एनएससीएलसी पीडीओ मॉडल में ज्ञात नैदानिक ड्राइवरों के खिलाफ लक्षित चिकित्सा के लिए दवा संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित और वर्णन करते हैं।

Protocol

मानव विषयों के अनुसंधान के लिए, सूचित सहमति प्राप्त की गई थी और यूसीएसएफ आंतरिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल (आईआरबी, प्रोटोकॉल नंबर: # 13-12492, या सीसी # 17-23309) के तहत ऊतक संग्रह किया गया था। डी-आइडेंटिफाइड नैदानिक नमूनों से ऑर्गेनोइड संस्कृतियों की स्थापना पहले प्रकाशित तरीकों के अनुसार अनुसंधान भागीदारों के सहयोग से की गई थी13,14,15,16। ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को मार्ग तीन या बाद में रखरखाव और दवा वृद्धि प्रयोगों के लिए पुनर्प्राप्त किया गया था। सभी निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक स्तनधारी ऊतक संस्कृति प्रयोगशाला वातावरण में एसेप्टिक परिस्थितियों के तहत किए गए थे।

Figure 1
चित्रा 1: वर्कफ़्लो के प्रोटोकॉल योजनाबद्ध और तकनीक में महत्वपूर्ण चरणों. (ए) प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो जिसमें 96-अच्छी तरह से प्रारूप में ऑर्गेनोइड्स की सीडिंग, सीडिंग के 7 दिनों के बाद दवा वृद्धि के साथ उपचार, और एलिसा प्लेट रीडर का उपयोग करके उपचार के 5 दिन बाद ल्यूमिनेसेंस-आधारित सेल उत्तरजीविता रीडआउट शामिल है। (बी) EGFRdel19-सकारात्मक TH107 और EGFRL858R-सकारात्मक TH330 NSCLC ऑर्गेनोइड संस्कृतियों की एक उदाहरण छवि। मूल संस्कृतियों, सीडिंग के समय कोशिकाओं (दिन 0), और उपचार में organoids 7 दिन के बाद शुरू (दिन 7) सीडिंग दिखाया जाता है। स्केल बार = 100 μm. प्रारंभिक 7-दिवसीय संस्कृति अवधि में ऑर्गेनोइड व्यास में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित की जाती है और ऑर्गेनोइड आकार में >2 गुना वृद्धि का संकेत मिलता है। दिन 0 पर औसत आकार की तुलना में दिन 7 पर आकारों में सापेक्ष गुना परिवर्तन प्रतिनिधि छवियों के नीचे प्रस्तुत किए गए हैं। TH107 के लिए, 7 दिनों में 2.38 का गुना परिवर्तन मनाया जाता है, जो 5.88 दिनों (141.12 h) के दोहरीकरण समय को दर्शाता है। TH330 के लिए, 7 दिनों में 2.41 का एक गुना परिवर्तन मनाया जाता है, जो 5.81 दिनों (139.42 घंटे) के दोहरीकरण समय को दर्शाता है। ऑर्गेनोइड आकार और सांख्यिकीय मूल्यांकन में परिवर्तन का परिमाणीकरण प्रस्तुत किया गया है (दाएं)। सांख्यिकीय महत्व की गणना अनपेयर्ड टी-टेस्ट, पी < 0.0001 द्वारा की जाती है। (सी) ऑर्गेनोइड 96-वेल प्लेट प्रारूप में दवा वृद्धि के लिए उपचार लेआउट। तकनीकी प्रतिकृतियों और अनुकरणीय खुराक की संख्या को इंगित किया जाता है, जिसमें एक नकारात्मक नियंत्रण भी शामिल है। Schematics BioRender, एक वेब आधारित चित्रण उपकरण के साथ बनाया गया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. प्रयोगात्मक तैयारी

  1. विकास माध्यम (जीएम) तैयार करें जैसा कि पहले बताया गया था15: ड्यूलबेको के संशोधित ईगल के मध्यम / हैम के पोषक तत्व मिश्रण F12 (DMEM / F-12) एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन के साथ, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 एमएम एचईपीईएस, 25 एनएम एचआरस्पून्डिन, 1x बी 27, 5 एमएम निकोटीनामाइड, 1.25 एमएम एन-एसिटाइलसिस्टीन, 1.25 एमएम एन-एसिटाइलसिस्टीन के साथ पूरक, 1.25 एम-एम-एसिटाइलसिस्टीन, 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 ng/mL hFGF-7 ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एक 0.22 μm फ़िल्टरिंग सिस्टम के माध्यम से foaming और फ़िल्टर से बचने के लिए धीरे से मिश्रण. उपयोग करने से पहले 1 घंटे के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म मीडिया।
  2. एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) के अलावा के बिना पहले रिपोर्ट किए गए कम विकास कारक मीडिया (एलजीएम) तैयार करें: उन्नत ड्यूलबेको के संशोधित ईगल के मध्यम / हैम के पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (डीएमईएम / एफ -12), 1 एमएम एचईपीईएस, 1x एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन, 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन, 10 एमएम निकोटीनामाइड, 1 एमएम एन-एसिटाइलसिस्टीन, 10 एम एम एन-एसिटाइलसिस्टीन, 10 एम 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
    नोट: एक 0.22 μm फिल्टर के माध्यम से foaming और फ़िल्टर से बचने के लिए धीरे से मिश्रण. उपयोग करने से पहले 1 घंटे के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म मीडिया।
  3. Thaw BME2 (कम विकास कारक तहखाने झिल्ली निकालें, प्रकार 2, सामग्री की तालिका देखें) बर्फ पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर, रात भर.

2. एकल सेल निलंबन और कोशिकाओं के सीडिंग उत्पन्न

  1. जलमग्न BME2 ऑर्गेनोइड संस्कृति को अलग करें जैसा कि निम्नलिखित चरणों (2.1.1-2.1.6) में वर्णित है।
    1. ध्यान से संस्कृति प्लेटों से मीडिया aspirate. जलमग्न BME2 ऑर्गेनोइड संस्कृति को छूने से बचें।
      नोट: मीडिया आकांक्षा के रूप में किया जा सकता है क्योंकि शोधकर्ता पसंद करता है, उदाहरण के लिए, एक बुनियादी तरल पदार्थ आकांक्षा प्रणाली के साथ या एक पिपेट का उपयोग करके। BME2 एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स को छूने से बचें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड बायोमास का नुकसान हो सकता है।
    2. एक उपयुक्त पुनः संयोजक एंजाइम के साथ जलमग्न BME2 ऑर्गेनोइड संस्कृति को ट्रिप्सिनाइज़ करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 6-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में, प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल जोड़ें। यंत्रवत् BME2 को बार-बार ऊपर और नीचे पिपेट करके तोड़ दें। 5 मिनट के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    3. निलंबन को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 600 x g पर 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में स्थानांतरित करें।
    4. ऑर्गेनोइड गोली को छूने के बिना पुनः संयोजक एंजाइम को ध्यान से एस्पिरेट करें।
      नोट: अवशिष्ट BME2 मौजूद हो सकता है। यदि आवश्यक हो तो एंजाइम पाचन को दोहराएं।
    5. जीएम (चरण 1.1) में organoid गोली resuspend. DNase I 1x 100 U/mL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 600 x g पर सेंट्रीफ्यूज। organoid गोली को छूने और त्यागने के बिना मीडिया को ध्यान से बंद पिपेट। ताजा जीएम में फिर से निलंबित.
  2. ऑर्गेनोइड एकल-कोशिका निलंबन का बीज बोना
    1. पूर्व गर्मी एक नया काला, स्पष्ट नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए.
      नोट: स्पष्ट नीचे प्लेटों का उपयोग करना ऑर्गेनोइड विकास और दवा की प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए आवश्यक है।
    2. गिनती के लिए, पीबीएस (कुल मात्रा: 500 μL) में सेल निलंबन का 1: 5 कमजोर पड़ने की तैयारी करें और सेल विश्लेषक का उपयोग करके सेल निलंबन की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट:: अंतिम कक्ष एकाग्रता प्राप्त करने के लिए तनुकरण कारक (x 5) द्वारा गुणा करने के लिए सुनिश्चित करें। हेमोसाइटोमीटर जैसे वैकल्पिक गणना विधियों का उपयोग किया जा सकता है। सेल व्यवहार्यता एक व्यवहार्यता धुंधला परख (उदाहरण के लिए, Trypan Blue17 के साथ) का उपयोग कर निगरानी की जानी चाहिए. एक सेल विश्लेषक का उपयोग करके, व्यवहार्यता स्वचालित रूप से मूल्यांकन किया जाता है। सेल विश्लेषक द्वारा मूल्यांकन किए गए ऑर्गेनोइड सिंगल-सेल सस्पेंशन की व्यवहार्यता ≥95% होनी चाहिए (पूरक चित्रा 1)।
    3. प्रयोग के लिए बीज के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना करें।
      नोट: सीडिंग एकाग्रता 1500 कोशिकाओं / μL BME2 है, जिसमें 5 μL BME2 प्रति अच्छी तरह से आवश्यक है (कुल संख्या: 7500 कोशिकाएं / एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, 6 x 10E5 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसमें ऑर्गेनोइड गुंबदों (4.5 x 10E5) और प्रयोगात्मक अधिशेष (कुल 80 कुओं के लिए गणना) के साथ 60 कुओं की सीडिंग शामिल है।
    4. प्रत्येक 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रति 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन का एक एलीकोट तैयार करें, यदि कई 96-अच्छी तरह से प्लेटों को प्रयोग में शामिल किया जाता है तो सीडेड होने की योजना बनाई गई है।
      नोट: प्रयोगात्मक अधिशेष और अलग-अलग एलीकोट प्रति सीडेड 96-वेल प्लेट को BME2 को संभालने के कारण बढ़े हुए प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह के लिए खाते की आवश्यकता होती है।
    5. एकल-सेल निलंबन से एलीकोट कोशिकाओं की गणना के रूप में (चरण 2.2.3) ऊपर और नीचे pipetting द्वारा सावधानीपूर्वक resuspension के बाद। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 600 x g पर गोली कोशिकाएं। ध्यान से सेल गोली को छूने के बिना एक P200 पिपेट का उपयोग कर मीडिया को निकालें. जल्द ही बर्फ पर सेल गोली जगह (~ 1 मिनट) और BME2 में सेल गोली resuspend.
      नोट:: अवशिष्ट मीडिया BME2 संरचना और कठोरता समझौता कर सकते हैं। सभी मीडिया को सावधानी से बंद कर दें। सेल गोली acclimate करने के लिए जल्द ही बर्फ पर कोशिकाओं को जगह और कोशिकाओं को clumping के बिना BME2 में resuspended किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। बीएमई 2 को तरल अवस्था में रहने के लिए लगातार बर्फ पर रखें। एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, सेल गोली के पुन: निलंबन के लिए 400 μL BME2 की आवश्यकता होती है। फिर से निलंबित सेल छर्रों ध्यान से, बुलबुले की शुरूआत से बचने.
    6. अपने पूर्व-गर्म काले, स्पष्ट-नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट को अपनी ओर झुकाएं। प्लेट कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के 5 μL का उपयोग करती हैं और प्रत्येक अच्छी तरह से 6 बजे की स्थिति में सेल गुंबदों को सीडिंग करती हैं (चित्रा 1 ए)।  शेष आंतरिक कुओं में सेल गुंबदों को बीज दें (कॉलम 2-10 और 96-अच्छी तरह से प्लेट के बी-जी को पंक्तियां)।
      नोट:: रिवर्स pipetting18 BME2 हैंडलिंग करते समय अनुशंसित है।
    7. 96-अच्छी तरह से प्लेट को स्थानांतरित न करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेल संस्कृति लैमिनर प्रवाह हुड में ताजा बीज वाले सेल गुंबदों को इनक्यूबेट करें। फिर प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में ले जाएं और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. ध्यान से ऑर्गेनोइड्स युक्त सभी कुओं में प्रति अच्छी तरह से जीएम के 100 μL जोड़ें (कॉलम 2-10 और 96-वेल प्लेट की पंक्तियों बी-जी)। प्लेट के रिम पर बाहरी कुओं में पीबीएस के 100 μL जोड़ें।
    9. संस्कृति BME2 एम्बेडेड organoids जीएम मीडिया में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कुल 7 दिनों के लिए. नियमित रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड्स के विकास का निरीक्षण करें।
      नोट: कृपया सीडिंग से उपचार के दिन तक अपेक्षित विकास प्रगति के एक उदाहरण के लिए चित्र 1B और अनुपूरक तालिका 1 देखें।
    10. संस्कृति के 3-4 दिनों के बाद एक बार मीडिया बदलें: प्लेट को 180 डिग्री (अब 12 बजे की स्थिति में ऑर्गेनोइड्स) द्वारा दक्षिणावर्त घुमाएं, यदि उपलब्ध हो तो मल्टीचैनल उपकरण का उपयोग करके ऑर्गेनोइड गुंबद के विपरीत स्थिति से जीएम को ध्यान से एस्पिरेट करें, और फिर ताजा जीएम जोड़ें।

3. दवा उपचार

  1. पसंद की दवा के लिए एलजीएम में एक सीरियल ड्रग कमजोर पड़ने की तैयारी करें, उदाहरण के लिए, ओसिमेर्टिनिब, ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड्स का इलाज करने के लिए। एक नकारात्मक नियंत्रण (LGM मीडिया + 0.1% DMSO) शामिल करें। सीडेड कुओं की संख्या के अनुसार सभी खुराकों के पर्याप्त दवा एलीकोट तैयार करें और प्रयोगात्मक अधिशेष।
    नोट: लक्षित अवरोधकों के लिए ≥8 खुराक और 1 nM-10 μM से लेकर एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला की सिफारिश की जाती है।
  2. ऑर्गेनोइड प्लेट को 180 डिग्री तक दक्षिणावर्त घुमाएं (ऑर्गेनोइड्स अब 12 बजे की स्थिति में)। ध्यान से aspirate जीएम एक multichannel उपकरण अधिमानतः का उपयोग कर.
    नोट: जीएम aspirating जबकि organoid गुंबद को छूने से बचें के रूप में यह organoid बायोमास और प्रभाव परिणामों के नुकसान में परिणाम में परिणाम हो सकता है.
  3. नियंत्रण के 100 μL जोड़ें (उदाहरण के लिए, LGM मीडिया + 0.1% DMSO) या दवा समाधान प्रति अच्छी तरह से।
    नोट: कृपया 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में दवा वृद्धि उपचार योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1C को देखें।
  4. 5 दिनों के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इलाज किए गए ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें।

4. luminescence-आधारित उत्तरजीविता परख द्वारा Readout

  1. फसल और उत्तरजीविता रीडआउट
    1. Reference19 के अनुसार उत्तरजीविता परख प्रदर्शन.
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में थाव अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें)। उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पानी के स्नान में अभिकर्मक को संतुलित करें और उलटा करके मिलाएं।
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से अभिकर्मक की एक समान मात्रा जोड़ें (100 μL प्रति अच्छी तरह से)। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, पिपेट टिप organoid गुंबद की स्थिति में रखा के साथ. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      3. एक multichannel पिपेट का उपयोग करते हुए, लगभग 75% (150 μL) lysate (चरण 4.1.1.2) को एक नए सफेद, अपारदर्शी-नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।
        नोट: एक नई प्लेट के लिए lysates के 75% स्थानांतरण परख संवेदनशीलता को प्रभावित किए बिना बाद में readout में बुलबुले की अनुपस्थिति सुनिश्चित करता है.
      4. अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 25 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. एक एलिसा प्लेट रीडर (एकीकरण समय 0.25-1 s / प्रति अच्छी तरह से) का उपयोग करके luminescence रिकॉर्ड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. एक उपयुक्त प्रारूप में डेटा को सहेजें, उदाहरण के लिए, एक डेटा तालिका जिसमें प्लेट लेआउट और उपयोग की जाने वाली दवाओं के सभी कच्चे पढ़ने और रिकॉर्डिंग शामिल हैं।
  2. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण ( सामग्री की तालिका देखें)
    1. एक नया XY-तालिका बनाएँ और एक XY प्रारूप में डेटा डालें: पंक्तियाँ (X) नकारात्मक नियंत्रण हैं, जिसके बाद दवा की खुराक बढ़ जाती है, जिसमें दाढ़ एकाग्रता में लॉग [अवरोधक] के रूप में खुराक होती है। स्तंभ (Y) रीडआउट मान होते हैं जिनमें स्तंभों के साथ स्टैक किए गए प्रतिकृतियाँ शामिल होती हैं.
      नोट:: नकारात्मक नियंत्रण की एकाग्रता को न्यूनतम मान के रूप में इंगित किया जाना चाहिए (दिया गया 0 लॉग स्केल में संभव नहीं है), उदाहरण के लिए, लॉग [अवरोधक], एम = -10।
    2. विश्लेषण का चयन करके मानों को सामान्यीकृत करें > और निम्न पैरामीटर का उपयोग करके मानों को सामान्य करें: प्रत्येक उप-स्तंभ को अलग-अलग सामान्य करें, Y = 0 को 0% के रूप में, "प्रत्येक उप-कॉलम में अंतिम मान (या पहले, जो भी बड़ा हो)" 100% के रूप में, प्रतिशत में परिणाम, परिणामों को ग्राफ़ करें।
    3. गैर-रैखिक प्रतिगमन > खुराक प्रतिक्रिया > विश्लेषण > XY विश्लेषण का चयन करके सामान्यीकृत डेटा पर गैर-रैखिक प्रतिगमन वक्र को फिट करें - लॉग (अवरोधक) बनाम सामान्यीकृत प्रतिक्रिया > निषेध - चर ढलान।
    4. गैर-रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण और प्रतिक्रिया वक्र के ग्राफ के बाद आउटपुट किए गए IC50 मानों की तालिका के रूप में परिणामों की रिपोर्ट करें, जिसमें माध्य +/- मानक विचलन और फिट प्रतिगमन वक्र के रूप में सामान्यीकृत डेटा बिंदु शामिल हैं।

Representative Results

एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड्स की स्थापना में काफी चुनौतियों को नोट किया गया है7। इस प्रकार, फेफड़ों के कैंसर ऑर्गेनोइड्स की स्थापना और दवा उपचार के लिए उनका उपयोग करने के लिए हाल के काम को देखना रोमांचक है20,21,22। ईजीएफआर-म्यूटेशन एनएससीएलसी मामलों के 11.3% के लिए जिम्मेदार है23। ईजीएफआर अवरोधकों के साथ लक्षित उपचार ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी में पहली पंक्ति के उपचार विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है और रोगियों में समग्र अस्तित्व और उपचार सुरक्षा में सुधार हुआ है24। इस काम ने ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड्स में एफडीए-अनुमोदित ईजीएफआर टायरोसिन किनेज इनहिबिटर ओसिमर्टिनिब 24,25 के प्रति संवेदनशीलता निर्धारित की। ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड्स एनएससीएलसी रोगियों के सर्जिकल लकीर या ट्यूमर बायोप्सी नमूनों से उत्पन्न हुए थे और डीएनए अनुक्रमण द्वारा इंगित ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन को हार्बर करने की पुष्टि की गई थी। जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड मॉडल को उपचार दीक्षा के पांच दिन बाद ल्यूमिनेसेंस-आधारित सेल उत्तरजीविता रीडआउट द्वारा मूल्यांकन किए गए ओसिमर्टिनिब और पीडीओ व्यवहार्यता की बढ़ती खुराक के साथ इलाज किया गया था। जबकि EGFR उत्परिवर्ती (EGFRdel19)-सकारात्मक TH107 ऑर्गेनोइड्स ने 56 nM (चित्रा 2A), EGFR-उत्परिवर्ती (EGFRL858R) के आधे-अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) के साथ osimertinib उपचार के प्रति संवेदनशीलता दिखाई- सकारात्मक TH116 ऑर्गेनोइड्स 1 μM (चित्रा 2B) से अधिक के IC50 के साथ osimertinib उपचार के लिए प्रतिरोधी थे। EGFRdel19-positive TH107 NSCLC की संवेदनशीलता महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों के साथ थी, जिसमें सेल चक्र से जुड़े जीन हस्ताक्षरों की अभिव्यक्ति में कमी और एपोप्टोसिस से जुड़े जीन हस्ताक्षरों की अभिव्यक्ति में वृद्धि (पूरक चित्रा 2ए, बी) शामिल थी। एक संदर्भ के रूप में, संवेदनशील EGFRdel19-सकारात्मक NSCLC सेल लाइन PC9 के लिए प्रतिक्रिया डेटा प्रस्तुत किया गया है (चित्रा 3A, B)। उत्तरार्द्ध में एक 2 डी luminescence-आधारित उत्तरजीविता परख (चित्रा 3A) द्वारा osimertinib की बढ़ती खुराक के लिए उत्तरजीविता विश्लेषण और पश्चिमी धब्बा (चित्रा 3 बी) द्वारा ईजीएफआर-एमएपीके सिग्नलिंग के स्तर पर सिग्नलिंग दमन का अध्ययन शामिल है। कुल मिलाकर, यह डेटा दवा की प्रतिक्रिया का निर्धारण करने और संवेदनशील और प्रतिरोधी एनएससीएलसी पीडीओ मॉडल के बीच अंतर करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की सटीकता पर प्रकाश डालता है। EGFRL858R-positive TH116 organoid और उपलब्ध नैदानिक नमूनों के आगे के विश्लेषण संभावित प्रतिरोध से जुड़े परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं।

Figure 2
चित्रा 2: EGFR-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड मॉडल के उपचार प्रतिक्रिया वक्र osimertinib वृद्धि के लिए। (ए) संवेदनशील EGFRdel19-सकारात्मक TH107 एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड मॉडल में Osimertinib प्रतिक्रिया। (बी) प्रतिरोधी EGFRL858R-सकारात्मक TH116 एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड मॉडल में Osimertinib प्रतिक्रिया। डेटा बिंदुओं को सामान्यीकृत मानों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है जो माध्य +/- मानक विचलन दिखाते हैं, जिसमें डेटा के माध्यम से एक गैर-रैखिक प्रतिगमन वक्र फिट होता है। TH107, n = 6 तकनीकी प्रतिकृति प्रति डेटा बिंदु. TH116, n = 4 तकनीकी प्रतिकृति प्रति डेटा बिंदु. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक संवेदनशील ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी सेल लाइन और विभिन्न मीडिया में सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड मॉडल में ओसिमर्टिनिब के उपचार की प्रतिक्रिया के लिए तुलनात्मक डेटा। (ए) संवेदनशील EGFRdel19-सकारात्मक एनएससीएलसी सेल लाइन PC9 में Osimertinib प्रतिक्रिया, मानक 2 डी-सीटीजी परख द्वारा निर्धारित. (बी) Osimertinib (2 μM) के साथ दो दिन के उपचार पर PC9 कोशिकाओं में सिग्नलिंग दमन। (ग) एलजीएम और जीएम मीडिया में संवेदनशील ईजीएफआरएल858आर-पॉजिटिव टीएच330 एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड मॉडल संस्कृति में ओसिमर्टिनिब प्रतिक्रिया। (डी) एलजीएम और जीएम मीडिया में प्रतिरोधी AZ021 एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड मॉडल में Osimertinib प्रतिक्रिया। AZ021 में ऑन्कोजेनिक EGFRL858R उत्परिवर्तन की पुष्टि विफल रही और osimertinib प्रतिक्रिया की कमी के लिए प्रेरक हो सकता है। ए और सी-डी के लिए, डेटा बिंदुओं को सामान्यीकृत मानों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जो माध्य +/- मानक विचलन दिखाते हैं, जिसमें डेटा के माध्यम से एक गैर-रैखिक प्रतिगमन वक्र फिट होता है। PC9, n = 3 तकनीकी प्रति डेटा बिंदु प्रतिकृति। TH330, n = 5 तकनीकी प्रतिकृति प्रति डेटा बिंदु. AZ021, n = 6 तकनीकी प्रतिकृति प्रति डेटा बिंदु. सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए सामान्यीकृत डेटा पर एक विलकॉक्सन रैंक परीक्षण किया गया था। TH330 (C) के लिए, LGM बनाम GM, ** p = 0.0078. AZ021 (डी) के लिए, LGM बनाम। जीएम, एनएस पी = 0.0742। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: ईजीएफआर-उत्परिवर्ती ऑर्गेनोइड मॉडल की गिनती और व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए प्रतिनिधि सेल विश्लेषक परिणाम। TH107 और TH107BC विभिन्न ऑर्गेनोइड मॉडल और ए और बी को जैविक प्रतिकृतियों के लिए संदर्भित करते हैं। प्रत्येक मॉडल और जैविक प्रतिकृति के लिए, तीन तकनीकी प्रतिकृतियों की गणना की जाती है; सभी ≥95% व्यवहार्यता दिखाते हैं। सेल गिनती के दौरान एक प्रतिनिधि छवि दाईं ओर प्रस्तुत की जाती है, जो मजबूत व्यवहार्यता और एकल-सेल पृथक्करण दिखाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए) ईजीएफआर-उत्परिवर्ती TH107 एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड्स के लिए प्राप्त बल्क आरएनए अनुक्रमण डेटा का उपयोग करके, अनुपचारित नियंत्रण (डीएमएसओ) और 3 दिनों (OSI_D3) के लिए ओसिमेर्टिनिब के साथ इलाज की गई कोशिकाओं की तुलना करता है। (A-B) लक्षित उपचार पर, संवेदनशील कोशिकाएं सेल चक्र जी 1 गिरफ्तारी से गुजरेंगी और सक्रिय प्रसार को रोक देंगी। जैसा कि जी 2 एम सेल चक्र जीन की अभिव्यक्ति सक्रिय प्रसार से जुड़ी हुई है, अनुपचारित नियंत्रण (डीएमएसओ) में अभिव्यक्ति के नाममात्र संवर्धन की उम्मीद है। एपोप्टोसिस से संबंधित जीनों के लिए, उपचारित कोशिकाओं (OSI_D3) में नाममात्र संवर्धन की उम्मीद है। दोनों को ईजीएफआर-उत्परिवर्ती टीएच 107 एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड मॉडल में पुष्टि की गई है जो ओसिमेर्टिनिब के साथ इलाज किया गया है: (ए) हॉलमार्क जी 2 एम अभिव्यक्ति हस्ताक्षर (बाएं) के लिए जीएसईए डीएमएसओ-उपचारित कोशिकाओं में संवर्धन दिखाता है। नाममात्र संवर्धन स्कोर (एनईएस): +1.708, FDR < 0.0001. (बी) हॉलमार्क एपोप्टोसिस अभिव्यक्ति हस्ताक्षर (दाएं) के लिए जीएसईए ओसिमरटिनिब-उपचारित कोशिकाओं में संवर्धन दिखाता है। एनईएस: -1.075, FDR: एनएस, 0.3275. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 3: EGFR-उत्परिवर्ती TH330 organoid मॉडल में combinatorial दवा उपचार एक निश्चित एकाग्रता पर एक दूसरे additive अवरोधक की उपस्थिति में Osimertinib वृद्धि के साथ इलाज किया। ईजीएफआर-उत्परिवर्ती एनएससीएलसी में प्रतिरोध से जुड़े परिवर्तन, यानी, एसआरसी और एएक्सएल सक्रियण 26,27,28, एसआरसी अवरोधक साराकाटिनिब (100 एनएम) या एएक्सएल अवरोधक आर 428 (500 एनएम), एन = 6 प्रति डेटा बिंदु तकनीकी प्रतिकृतियों के साथ संयुक्त उपचार द्वारा लक्षित औषधीय थे। दोनों संयुक्त उपचारों के परिणामस्वरूप उपचार की प्रतिक्रिया में वृद्धि हुई, जिसमें एसआरसी अवरोधक साराकाटिनिब के साथ ओसिमर्टिनिब के संयोजन के लिए महत्व था। सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन विलकॉक्सन रैंक परीक्षण द्वारा किया गया था: Osimertinib बनाम Osimertinib + Saracatinib, * p = 0.0195; Osimertinib बनाम। Osimertinib + R428, ns, p = 0.2500. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: बीज बोने (डी 0) से 7 दिनों के बाद उपचार (डी 7) तक ऑर्गेनोइड आकार में परिवर्तन। (ए) ईजीएफआरडेल 19-पॉजिटिव एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड टीएच 107 में वृद्धि विकास। (ख) ईजीएफआरएल858आर-पॉजिटिव एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड टीएच330 में वृद्धि विकास। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह पांडुलिपि एनएससीएलसी-व्युत्पन्न 3 डी पीडीओ मॉडल में दवा संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित और वर्णन करती है। दवा संवेदनशीलता अध्ययन के अलावा, दवा संवेदनशीलता में अंतर के अंतर्निहित कारणों को निर्धारित करने के लिए उपलब्ध ऑर्गेनोइड मॉडल के आगे लक्षण वर्णन की आवश्यकता है। इसमें ऑर्गेनोइड्स और रोगी के नमूनों की आनुवंशिक प्रोफाइलिंग और ऑर्गेनोइड्स के लिए उपलब्ध अन्य विश्लेषण शामिल हो सकते हैं, जैसे कि भेदभाव मार्करों और सामान्य सेलुलर सिग्नलिंग बायोमाकर्स और फिजियोलॉजी 13,29 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक मानकीकृत वर्कफ़्लो प्रदान करता है जो सावधानीपूर्वक पालन किए जाने पर सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य दवा संवेदनशीलता विश्लेषण की अनुमति देता है। निम्नलिखित चरणों में विशेष देखभाल की जानी चाहिए: एकल-सेल निलंबन की पीढ़ी के दौरान TrypLE और DNAse I पाचन, BME2 में एकल-सेल निलंबन की सीडिंग, उपचार तक ऑर्गेनोइड विकास की निगरानी, मीडिया परिवर्तन, और ल्यूमिनेसेंस-आधारित सेल उत्तरजीविता रीडआउट के दौरान BME2 एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स के विघटन और लाइसिस। (1) जबकि TrypLE-आधारित ऑर्गेनोइड्स के पृथक्करण के बाद अतिरिक्त DNAse I पाचन नियमित संस्कृति रखरखाव के दौरान ऑर्गेनोइड मॉडल का विस्तार करने के लिए आवश्यक नहीं है, DNAse I पाचन को दवा वृद्धि प्रयोगों के लिए सीडिंग करते समय छोड़ा नहीं जाना चाहिए क्योंकि यह एकल-सेल निलंबन और सटीक सेल गिनती में ऑर्गेनोइड समूहों का बेहतर अलगाव सुनिश्चित करता है। (2) BME2 में एकल-सेल निलंबन की सीडिंग कमरे के तापमान पर BME2 के ठोसीकरण को देखते हुए एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करती है। इस प्रकार, अधिकतम 1-2 पंक्तियों को एक बार में बीज देने की आवश्यकता होती है, और अतिरिक्त पंक्तियों को बीजित करने से पहले नमूनों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। ध्यान दें, कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पाइप करने की आवश्यकता होती है जब एक सजातीय सेल निलंबन के लिए अनुमति देने के लिए सीडिंग जारी रखी जाती है। (3) बीज बोने से उपचार के लिए 7-दिवसीय विस्तार के दौरान ऑर्गेनोइड विकास की सावधानीपूर्वक निगरानी करने की आवश्यकता है। अपेक्षित विकास का एक उदाहरण चित्र 1B और अनुपूरक तालिका 1 में दिया गया है। ध्यान दें, ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण द्वारा ऑर्गेनोइड आकार में परिवर्तन का आकलन करना जैसा कि चित्रा 1 बी में प्रस्तुत किया गया है, ऑर्गेनोइड विकास और दोहरीकरण समय में अंतर के सटीक मूल्यांकन की अनुमति दे सकता है। दोहरीकरण समय दवा प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव डाल सकता है, जैसा कि हाल ही में साहित्य 30 में चर्चा की गई है। यदि ऑर्गेनोइड विकास दर प्रस्तुत उदाहरण से काफी अधिक है, तो उपचार की शुरुआत तक एक छोटा विस्तार समय और कम उपचार अवधि पर विचार किया जा सकता है। (4) इसके अलावा, एस्पिरेटिंग ऑर्गेनोइड्स से बचने के लिए मीडिया को बदलते समय विशेष देखभाल की जानी चाहिए। 6 बजे की स्थिति में BME2 एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स की सीडिंग स्थिति मीडिया की एक सुरक्षित आकांक्षा के लिए अनुमति देती है जब प्लेटों को 180 डिग्री तक दक्षिणावर्त बदल दिया जाता है और मीडिया ऑर्गेनोइड्स की विपरीत स्थिति में एस्पिरेटेड होता है। (5) अंत में, जीवित रहने के रीडआउट के दौरान BME2 एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स की पूरी तरह से लाइसिस सटीक परिणाम रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, नमूनों को बार-बार ऊपर और नीचे पाइप किया जाना चाहिए, आदर्श रूप से अनफ़िल्टर्ड युक्तियों का उपयोग करके, उचित लाइसिस सुनिश्चित करने के लिए। इनक्यूबेशन बार का पालन किया जाना चाहिए जैसा कि वर्णित है। इसके अलावा, एलिसा प्लेट रीडर का उपयोग करके अंतिम रीडआउट के लिए एक सफेद, अपारदर्शी-नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट में लिसेट के 75% (कुल मात्रा के बजाय) को स्थानांतरित करना एक उपयुक्त मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, क्योंकि यह प्रत्येक अच्छी तरह से एक ही मात्रा और हवा के बुलबुले की अनुपस्थिति का आश्वासन देता है जिसे जोरदार पिपेटिंग द्वारा पेश किया जा सकता है।

ध्यान दें, BME2-एम्बेडेड ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में दवा प्रतिक्रियाओं की प्रोफाइलिंग नियमित सेल लाइन संस्कृतियों (चित्रा 2, चित्रा 3 ए) में देखे जाने की तुलना में एक उच्च मानक विचलन दिखा सकती है। उच्च मानक विचलन कई कारकों पर आधारित है, जिसमें बीएमई 2 के साथ काम करते समय सीडिंग में मामूली भिन्नताओं की बढ़ती संभावना और प्रारंभिक 7-दिवसीय विकास अवधि में कुओं में व्यक्तिगत ऑर्गेनोइड विकास दर में अंतर शामिल है। इस प्रकार, प्रति दवा एकाग्रता के बराबर या चार से अधिक तकनीकी प्रतिकृतियों को बीज दिया जाना चाहिए।

सबसे महत्वपूर्ण बात, सामान्य वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं द्वारा ऑन्कोजेनिक ड्राइवर उत्परिवर्तन और सीमित संदूषण को ले जाने वाली घातक कोशिकाओं की उपस्थिति का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए। एनएससीएलसी स्थापना में चुनौतियां सामान्य वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के विकास का पक्ष ले सकती हैं7। ऑन्कोजेनिक ड्राइवर उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए कॉपी नंबर प्रोफाइलिंग या पीसीआर- और अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण एनएससीएलसी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए पसंद के तरीके हैं।

विधि के संशोधन और समस्या निवारण
बुनियादी मीडिया समाधानों में जोड़े गए मीडिया और संबंधित विकास कारक लक्षित अवरोधकों के लिए दवा की प्रतिक्रिया को काफी प्रभावित कर सकते हैं। वे बाईपास रिसेप्टर्स और सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करते हैं जो दवा की प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैं और सीमित करते हैं (उदाहरण के लिए, एफजीएफ, एचजीएफ, ईजीएफ)26। जबकि एक विकास-कारक समृद्ध और अनुरूप मीडिया ऑर्गेनोइड संस्कृति के विस्तार के लिए इष्टतम हो सकता है, दवा वृद्धि और संवेदनशीलता मूल्यांकन को कम विकास-कारक मीडिया में किया जाना चाहिए, जैसा कि ऊपर उल्लिखित है। यह विभिन्न मीडिया योगों और दवा प्रतिक्रिया डेटा (चित्रा 3 सी) की तुलना में आंतरिक अनुभव पर आधारित है। जबकि मीडिया समाधान कुछ दवा उपचार के प्रति संवेदनशीलता की डिग्री को प्रभावित कर सकते हैं और IC50 मूल्यों को स्थानांतरित कर सकते हैं, संवेदनशीलता या प्रतिरोध के मजबूत फेनोटाइप मीडिया सूत्रीकरण (चित्रा 3 सी, डी) के बावजूद स्पष्ट हैं। इसके अलावा, मीडिया फॉर्मूलेशन में सामान्य स्थिरता और ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में दवा प्रतिक्रियाओं को प्रोफाइल करने की सिफारिश की जाती है, और प्रति एकाग्रता के बराबर या चार से अधिक तकनीकी प्रतिकृतियों को सीड करने की आवश्यकता होती है। यह संवेदनशीलता बनाम में बेंचमार्क रेंज के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। ब्याज के अवरोधक के लिए प्रतिरोध।

विधि की सीमाएँ
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एनएससीएलसी 3 डी कैंसर ऑर्गेनोइड मॉडल की संवेदनशीलता का वर्णन करता है लक्षित अवरोधकों के लिए जब रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जाता है। अतिरिक्त प्रयोगों, जिसमें ड्राइवर ऑन्कोजीन और माध्यमिक उत्परिवर्तन की उपस्थिति के लिए मार्ग निषेध और अनुक्रमण विश्लेषण के बारे में फार्माकोडायनेमिक विश्लेषण शामिल है, दवा प्रतिरोध और संवेदनशीलता के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में गैर-कैंसर बाईस्टैंडर कोशिकाओं द्वारा इंटरैक्शन या स्रावित कारकों से प्राप्त माइक्रोएनवायरमेंटल उत्तेजनाओं जैसे बायस्टैंडर कारकों का हिसाब नहीं दिया जाता है, और उपन्यास प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जब प्रतिरक्षा या स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति ऑर्गेनोइड मॉडल का प्रयास किया जाता है। हाल के काम ने ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट इंटरैक्शन और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट इनहिबिटर के लिए प्रोफ़ाइल प्रतिक्रियाओं को दोहराने के लिए ऑर्गेनोइड मॉडल के उपयोग पर प्रकाश डाला है, जैसे कि एंटी-पीडी-एल 1 उपचार 13,31।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व
3 डी कैंसर organoid मॉडल आनुवंशिक विविधता और मूल ट्यूमर 4,5,6 में मौजूद उपचार प्रतिक्रिया के निर्धारकों recapitulate. विशेष रूप से, स्थानिक और अस्थायी विषमता ट्यूमर के विकास को बढ़ावा दे सकती है, और समानांतर उद्भव और ट्यूमर सबक्लोन्स का अनुक्रमिक विकास 32,33 हो सकता है। इंट्राट्यूमर विषमता चिकित्सीय दबाव 9,34,35 के तहत अधिक लचीला ट्यूमर कोशिकाओं के चयन के लिए महत्वपूर्ण है। यहां प्रदान किया गया प्रोटोकॉल रोगी-निकटतम नमूनों में लक्षित अवरोधकों के साथ उपचार के लिए संवेदनशीलता के तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस प्रकार, ऑर्गेनोइड मॉडल में अधिक पारंपरिक सजातीय सेल लाइन मॉडल पर लाभ होते हैं, जिनमें आनुवंशिक विविधता या सेल लाइनों या रोगी-व्युत्पन्न का उपयोग करके दीर्घकालिक अध्ययन की कमी होती है। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल लागत और विश्लेषणात्मक क्षमता के बारे में कुछ सीमाओं के साथ उपचार और संयोजन उपचार दृष्टिकोण के कई हथियारों तक स्केलिंग की अनुमति देता है। इस प्रकार, मुख्य रूप से लक्षित अवरोधक को बढ़ाते हुए एक निश्चित खुराक पर ब्याज की दूसरी दवा जोड़ना और इसकी तुलना मुख्य रूप से लक्षित अवरोधक की वृद्धि से करना अकेले संभावित संयुक्त प्रभावों का कुशलतापूर्वक मूल्यांकन करने और न्यूनतम अतिरिक्त बायोमास की आवश्यकता के साथ करने की अनुमति देता है (पूरक चित्रा 3)। इमेजिंग-आधारित आकलन की तुलना में ऑर्गेनोइड विकास और दवा प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है, यहां वर्णित ल्यूमिनेसेंस-आधारित सेल उत्तरजीविता परख में न्यूनतम उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता के साथ समान संवेदनशीलता है।

विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों में विधि का महत्व और संभावित अनुप्रयोग
एक मानकीकृत पाइपलाइन विकसित करना जो रोगी के नमूनों से कैंसर ऑर्गेनोइड मॉडल स्थापित करने की अनुमति देता है और बाद की दवा संवेदनशीलता प्रोफाइलिंग में महत्वपूर्ण नैदानिक प्रयोज्यता क्षमता होती है। पूर्व विवो औषधीय प्रोफाइलिंग ने ट्यूमर में कमजोरियों और प्रतिरोधी-संबद्ध विशेषताओं का पता लगाने में मान्यता प्राप्त की है, जो रोगियों में उपचार की प्रतिक्रिया से संबंधित है36,37। महत्वपूर्ण रूप से, दवा संवेदनशीलता के पूर्व विवो प्रोफाइलिंग क्लिनिक में उपचार चयन और प्रतिरोध तंत्र को संबोधित करने वाले तर्कसंगत संयोजन उपचारों के डिजाइन में सहायता कर सकते हैं। कुल मिलाकर, यह दृष्टिकोण आणविक चिकित्सा या संयुक्त उपचार regimens के लिए बेहतर व्यक्तिगत रणनीतियों को सक्षम करने में मदद कर सकता है। उत्तरार्द्ध दवा सहिष्णुता और प्रतिरोध तंत्र को लक्षित करने में मदद कर सकता है और भविष्य में रोगी परिणामों में सुधार करने के लिए नैदानिक प्रतिक्रिया को गहरा कर सकता है।

Disclosures

टी.जी.B सरणी बायोफार्मा, क्रांति दवाओं, नोवार्टिस, एस्ट्राजेनेका, टेकेडा, स्प्रिंगवर्क्स, जैज फार्मास्यूटिकल्स, रिले थेरेप्यूटिक्स, रेन थेरेप्यूटिक्स, इंजन बायोसाइंसेज के लिए एक सलाहकार है, और नोवार्टिस, स्ट्रैटेजिया, किनेट और क्रांति दवाओं से अनुसंधान धन प्राप्त करता है।

Acknowledgments

हम जेरोन पी रूज (यूसीएसएफ) और केल्विन जे कुओ (स्टैनफोर्ड) की प्रयोगशालाओं को ऑर्गेनोइड संस्कृति और प्रोटोकॉल विकास के बारे में उनके इनपुट के लिए धन्यवाद देते हैं। हम आगे प्रोटोकॉल और नमूना स्थापना इनपुट के लिए Oghenekevwe एम Gbenedio (रूज लैब, UCSF) धन्यवाद. यह शोध परियोजना एनआईएच [U54CA224081] के समर्थन के साथ आयोजित की गई थी। एफ Haderk जर्मन कैंसर सहायता से Mildred Scheel पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes
15 mL centrifuge tubes
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane Corning 430773 for both media
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate Corning 3904
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate Corning 3917
A-8301 Tocris Bioscience 293910 for both media
Advanced DMEM/F-12 Gibco 12634010 for LGM
B27 Life Technologies 12587010 for both media
BioRender 2021 https://biorender.com/ online scientific illustration software
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) R&D Systems 353301002
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9682 3D-CTG readout reagent
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes
Deoxyribonuclease I (DNAse I) ThermoFisher Scientific 18047019
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution Corning MT21031CV
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco 10565018 for GM
GlutaMax Gibco 35050061 for LGM
GraphPad Prism software (version 9.2.0) GraphPad statistical analysis software
HEPES Gibco 15630080 for both media
hFGF-10 PeproTech 100-26-100ug for GM
hFGF-7 PeproTech 100-19-50ug for GM
hNoggin PeproTech 120-10C-100ug for both media
hRspondin PeproTech 120-38-100ug for GM
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) ThermoFisher Scientific 2149P-05-HR
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) ThermoFisher Scientific 2069-05-HR
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) ThermoFisher Scientific 2179-HR
Multichannel pipette
N-Acetylcysteine Fisher Scientific 50-424-777 for both media
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G for both media
Osimertinib Selleck Checm S7297
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Gibco 10378016 for LGM
Penicillin/Streptomycin Cytiva HyClone SV30010 for GM
Pipettes (different sizes)
Plate reader Molecular Devices SpectraMax M5 equipment, alternative readers may be used
Primocin Invivogen ant-pm-1 for GM
SB202190 Selleck Chem S1077 for GM
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604021
Vacuum pump and tubing
Vi-CELL XR Cell Analyzer Beckman Coulter Vi-CELL XR cell analyzer / counter

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 177 Organoid फेफड़ों organoid पीडीओ एनएससीएलसी फेफड़ों के कैंसर osimertinib EGFR लक्षित अवरोधक प्रतिरोध
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Barbosa Rabago, D., Blakely, C. M.,… More

Barbosa Rabago, D., Blakely, C. M., Haderk, F., Bivona, T. G. Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids. J. Vis. Exp. (177), e63039, doi:10.3791/63039 (2021).

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