Summary
Denne protokollen beskriver en standardisert evaluering av legemiddelfølsomhet til målrettede signalhemmere i NSCLC pasientavledede organoidmodeller.
Abstract
Nye 3D kreft organoid kulturer avledet fra kliniske pasientprøver representerer et viktig modellsystem for å evaluere intratumor heterogenitet og behandlingsrespons på målrettede hemmere i kreft. Banebrytende arbeid innen gastrointestinale og bukspyttkjertelkreft har fremhevet løftet om pasientavledede organoider (PUD) som et pasient-proksimalt kultursystem, med et økende antall modeller som dukker opp. På samme måte har arbeid i andre krefttyper fokusert på å etablere organoidmodeller og optimalisere kulturprotokoller. Spesielt opprettholder 3D-kreftorganoidmodeller den genetiske kompleksiteten til originale tumorprøver og oversetter dermed tumoravledede sekvenseringsdata til behandling med genetisk informerte målrettede terapier i eksperimentelle omgivelser. Videre kan PUD-er fremme evaluering av rasjonelle kombinasjonsbehandlinger for å overvinne resistensrelatert tilpasning av svulster i fremtiden. Sistnevnte fokuserer på intens forskningsinnsats i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), da resistensutvikling til slutt begrenser behandlingssuksessen til målrettede hemmere. En tidlig vurdering av terapeutisk målrettede mekanismer ved bruk av NSCLC-PUD-er kan bidra til å informere rasjonelle kombinasjonsbehandlinger. Dette manuskriptet beskriver en standardisert protokoll for cellekulturens platebaserte vurdering av legemiddelfølsomhet til målrettede hemmere i NSCLC-avledede 3D-PUD-er, med potensiell tilpasningsevne til kombinasjonsbehandlinger og andre behandlingsmodaliteter.
Introduction
Personlige terapier mot onkogene sjåfører har revolusjonert kreftbehandling, forbedret pasientens overlevelse og redusert behandlingsmedierte bivirkninger1. Nylige fremskritt innen molekylær diagnostikk og sekvenseringsteknologier har fremhevet kompleksiteten i menneskelige svulster, med romlig og tidsmessig heterogenitet som påvirker behandlingsresponsen2. Recapitulating av disse subklonale forskjellene i cellekulturmodeller har lenge vært begrenset til å undersøke utvalgte endringer av interesse for ellers ensartede cellelinjer. Nyutviklede 3D PUD-modeller generert fra tumorbiopsier eller kirurgiske tumorreseksjoner gir mulighet for forbedret representasjon av cellulær kompleksitet og signal krysstale i pasientavledede tumorvev3. Som sådan har tumororganoider avledet fra gastrointestinal og bukspyttkjertelkreft blitt generert og rekapitulert det genetiske mangfoldet og determinanter for behandlingsrespons4,5,6. I ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) anerkjennes organoidutvikling og etableringsutfordringer, og optimalisering av kulturteknikker og selektive mediefaktorer er nødvendig for å muliggjøre bredere og mer systematisk bruk av NSCLC-PUD-er i fremtiden7,8.
Å utvikle kombinatoriske terapier rettet mot gjenværende tumorceller som tåler første legemiddelbehandling er avgjørende for å hemme resistensutvikling og til slutt forbedre pasientens overlevelse9. Gitt den arkitektoniske kompleksiteten til organoide kulturer, må klassiske legemiddelresponsparametere optimaliseres for å muliggjøre nøyaktig og reproduserbar testing av narkotikafølsomhet. Bildebaserte avlesninger10,11 og klassiske celle levedyktighetsanalyser som måler cellulær ATP-overflod6,12, blant andre teknikker, er tilgjengelige for å profilere narkotikaresponser i PUD-kulturer. Her utvikler og beskriver vi en standardisert protokoll for å evaluere legemiddelfølsomhet til målrettet terapi mot kjente kliniske drivere i NSCLC PUD-modeller.
Protocol
For forskning på mennesker ble informert samtykke innhentet og vevsinnsamling ble utført under UCSF Internal Review Board godkjente protokoller (IRB, protokollnr.: #13-12492, eller CC #17-23309). Etableringen av organoidkulturer fra avidentifiserte kliniske prøver ble utført i samarbeid med forskningspartnere i henhold til tidligere publiserte metoder13,14,15,16. Organoidkulturer ble hentet for vedlikeholds- og narkotikaeskaleringsforsøk ved passering tre eller senere. Alle følgende protokoller ble utført under aseptiske forhold i et pattedyr vev kultur laboratoriemiljø.
Figur 1: Protokollskjema for arbeidsflyt og kritiske trinn i teknikken. (A) Eksperimentell arbeidsflyt inkludert såing av organoider i 96-brønnsformat, behandling med legemiddeleskalering 7 dager etter sådd, og luminescensbasert celleoverlevelsesavlesning 5 dager etter behandling ved hjelp av en ELISA-plateleser. (B) Et eksempelbilde av de EGFRdel19-positive TH107- og EGFRL858R-positive TH330 NSCLC organoidkulturene. Opprinnelige kulturer, celler på tidspunktet for såing (dag 0), og organoider ved behandling starter 7 dager etter sådd (dag 7) vises. Skalastang = 100 μm. Endringer i organoid diameter over den første 7-dagers kulturperioden kvantifiseres og indikerer >2 ganger økning i organoidstørrelse. Relative foldendringer i størrelser på dag 7 sammenlignet med gjennomsnittlig størrelse på dag 0 presenteres under de representative bildene. For TH107 observeres en foldendring på 2,38 over 7 dager, noe som indikerer en doblingstid på 5,88 dager (141,12 timer). For TH330 observeres en foldeendring på 2,41 over 7 dager, noe som indikerer en doblingstid på 5,81 dager (139,42 timer). Kvantifisering av endringer i organoid størrelse og statistisk evaluering presenteres (høyre). Statistisk signifikans beregnes ved ubetalt t-test, p < 0,0001. (C) Behandlingsoppsett for legemiddeleskalering i organoid 96-brønns plateformat. Antall tekniske replikeringer og eksemplariske doser er indikert, inkludert en negativ kontroll. Skjemaene er opprettet med BioRender, et nettbasert illustrasjonsverktøy. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Eksperimentelle preparater
- Forbered vekstmedium (GM) som tidligere rapportert15: Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Hams næringsblanding F12 (DMEM/F-12) med L-alanyl-L-glutamin, supplert med 100 U/ml penicillin/streptomycin, 10 mM HEPES, 25 nM hRspondin, 1x B27, 5 mM Nikotinamid, 1,25 mM N-Acetylcysteine, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 μg/ml Primocin, 100 ng/ml hNoggin, 100 ng/ml hFGF- 25 ng/ml hFGF-7 (se Materialfortegnelser).
MERK: Bland forsiktig for å unngå skumming og filtrer gjennom et filtreringssystem på 0,22 μm. Varm medium til 37 °C innen 1 time før bruk. - Forbered medier med lav vekstfaktor (LGM) som tidligere rapportert16 uten tilsetning av epidermal vekstfaktor (EGF): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Hams næringsblanding F12 (DMEM/F-12), supplert med 1 mM HEPES, 1x L-alanyl-L-glutamin, 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 10 mM Nikotinamid, 1 mM N-Acetylcysteine, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng/ml hNoggin.
MERK: Bland forsiktig for å unngå skumming og filtrer gjennom et 0,22 μm filter. Varm medium til 37 °C innen 1 time før bruk. - Tine BME2 (Kjellermembranekstrakt med redusert vekstfaktor, type 2, se materialtabell) på is, ved 4 °C, over natten.
2. Genererer encellet suspensjon og såing av celler
- Ta avstand fra nedsenket BME2 organoidkultur som beskrevet i følgende trinn (2.1.1-2.1.6).
- Aspirer forsiktig medier fra kulturplatene. Unngå å berøre den nedsenkede BME2 organoidkulturen.
MERK: Media Aspiration kan gjøres som forskeren foretrekker, for eksempel med et grunnleggende væskeaspirasjonssystem eller ved hjelp av en pipette. Unngå å berøre BME2 innebygde organoider, da dette kan føre til tap av organoid biomasse. - Prøv den nedsenkede BME2 organoidkulturen med et egnet rekombinant enzym (se materialtabellen). I 6-brønns plateformat, tilsett 2 ml per brønn. Mekanisk bryte BME2 ved gjentatte ganger pipettering opp og ned. Inkuber plater ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i 5 min.
- Overfør suspensjonen til et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 600 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer det rekombinante enzymet forsiktig uten å berøre den organoide pelletsen.
MERK: Resterende BME2 kan være til stede. Gjenta om nødvendig enzymets fordøyelse. - Resuspend den organoid pellets i GM (trinn 1.1). Tilsett DNase I 1x 100 U/ml og inkuber i 5 min ved romtemperatur (se Materialliste).
- Sentrifuge ved 600 x g i 3 min ved romtemperatur. Pipette av mediet forsiktig uten å berøre organoid pellets og kaste bort. Resuspend i fersk GM.
- Aspirer forsiktig medier fra kulturplatene. Unngå å berøre den nedsenkede BME2 organoidkulturen.
- Såing av organoid encellet suspensjon
- Forvarm en ny svart, klar bunn 96-brønnsplate ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i 10 minutter.
MERK: Bruk av klare bunnplater er avgjørende for å overvåke organoid vekst og legemiddelrespons. - For telling, lag en 1:5 fortynning av cellefjæringen i PBS (totalt volum: 500 μL) og tell celleopphenget ved hjelp av en celleanalysator (se Materialtabell).
MERK: Sørg for å multiplisere med fortynningsfaktoren (x 5) for å få den endelige cellekonsentrasjonen. Alternative tellemetoder som hemocytometer kan brukes. Celle levedyktighet bør overvåkes ved hjelp av en levedyktig fargingsanalyse (f.eks. med Trypan Blue17). Ved hjelp av en celleanalysator vurderes levedyktigheten automatisk. Levedyktigheten til organoide encellede suspensjoner som evaluert av celleanalysatoren, bør være ≥95% (Supplerende figur 1). - Beregn volumet av celleopphenget som trengs for å frø for eksperimentet.
MERK: Såkonsentrasjonen er 1500 celler/μL BME2, med 5 μL BME2 nødvendig per brønn (Totalt antall: 7500 celler/brønn). For en 96-brønns plate er det nødvendig med 6 x 10E5 celler. Dette inkluderer såing av 60 brønner med organoidkupler (4,5 x 10E5) og eksperimentelt overskudd (beregning for totalt 80 brønner). - Forbered en aliquot cellefjæring i et 1,5 ml mikrosenterrør per hver 96-brønnsplate som er planlagt å bli sådd hvis flere 96-brønnsplater er inkludert i eksperimentet.
MERK: Eksperimentelt overskudd og separate aliquots per frø 96-brønnsplate er nødvendig for å ta hensyn til den økte eksperimentelle skjevheten på grunn av håndtering av BME2. - Aliquot-celler fra encellet suspensjon som beregnet (trinn 2.2.3) etter forsiktig resuspensjon ved pipettering opp og ned. Pelletsceller på 600 x g i 5 min ved romtemperatur. Fjern forsiktig medier ved hjelp av en P200-pipette uten å berøre cellepelleten. Plasser cellepellet på isen om kort tid (~1 min) og resuspend cellepelleten i BME2.
MERK: Restmedier kan kompromittere BME2-strukturen og stivheten. Pipette av alle medier nøye. Plasser celler på isen om kort tid for å akklimatisere cellepellet og la cellene bli resuspendert i BME2 uten klumping. Hold BME2 på is hele tiden for at den skal holde seg i flytende tilstand. For en 96-brønns plate er 400 μL BME2 nødvendig for resuspensering av cellepelleten. Resuspendcellepellets forsiktig, unngå innføring av bobler. - Vipp den forvarmede svarte, klare 96-brønnsplaten mot deg. Plateceller som bruker 5 μL celleoppheng per brønn og seedingcellekupler ved 6-tiden for hver brønn (figur 1A). Frø cellekuplene i de resterende indre brønnene (kolonne 2-10 og rad B-G av en 96-brønnsplate).
MERK: Omvendt pipettering18 anbefales ved håndtering av BME2. - Ikke flytt 96-brønnsplaten og inkuber ferske frøcellekupler i cellekulturens laminære strømningshette i 5 minutter ved romtemperatur. Flytt deretter platen til cellekulturinkubatoren og inkuber den i 10 min ved 37 °C.
- Tilsett forsiktig 100 μL GM per brønn til alle brønnene som inneholder organoider (kolonne 2-10 og rad B-G av en 96-brønnsplate). Tilsett 100 μL PBS til de ytre brønnene ved kanten av platen.
- Kultur BME2 innebygde organoider i GM-medier ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i totalt 7 dager. Inspiser veksten av organoider under lysmikroskopet regelmessig.
MERK: Se figur 1B og supplerende tabell 1 for et eksempel på forventet vekstfremdrift fra såing til behandlingsdagen. - Bytt media en gang etter 3-4 dager med kultur: roter platen med klokken med 180° (organoider nå ved 12-tiden), forsiktig aspirere GM fra motsatt posisjon til organoid kuppel ved hjelp av et flerkanalsapparat hvis tilgjengelig, og legg deretter til fersk GM.
- Forvarm en ny svart, klar bunn 96-brønnsplate ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i 10 minutter.
3. Narkotikabehandling
- Forbered en seriell legemiddelfortynning i LGM for det valgte stoffet, for eksempel osimertinib, for å behandle EGFR-mutante NSCLC-organoider. Inkluder en negativ kontroll (LGM-medier + 0,1 % DMSO). Forbered tilstrekkelige legemiddel aliquots av alle doser i henhold til antall brønner frø pluss eksperimentelt overskudd.
MERK: En fortynningsserie med ≥8 doser og fra 1 nM-10 μM anbefales for målrettede hemmere. - Roter organoidplaten med klokken med 180° (organoider nå ved 12-tiden). Forsiktig aspirere GM ved hjelp av et flerkanalsapparat helst.
MERK: Unngå å berøre organoidkuppelen mens du aspirerer GM, da dette kan føre til tap av organoid biomasse og effektresultater. - Tilsett 100 μL kontroll (f.eks. LGM media + 0,1% DMSO) eller legemiddelløsning per brønn.
MERK: Se figur 1C for skjematisk legemiddeleskaleringsbehandling i 96-brønns plateformat. - Inkuber behandlede organoider ved 37 °C i cellekulturinkubatoren i 5 dager.
4. Avlesning ved luminescensbasert overlevelsesanalyse
- Avlesning av innhøsting og overlevelse
- Utfør overlevelsesanalysen i henhold til Referanse19.
- Tine reagens (se Materialliste) over natten ved 4 °C. Likevekt reagens i et vannbad ved romtemperatur i 30 minutter før bruk og bland ved invertering.
- Tilsett et likt volum av reagenset til hver brønn (100 μL per brønn). Bland grundig ved å pipettere opp og ned, med pipettespissen plassert i posisjonen til organoidkuppelen. Inkuber i 5 min ved romtemperatur i mørket.
- Bruk en flerkanals pipette og overfør ca. 75 % (150 μL) av lysatet (trinn 4.1.1.2) til en ny hvit, ugjennomsiktig bunnplate på 96 brønner.
MERK: Overføring av 75 % av lysates til en ny plate sikrer fravær av bobler i den senere avlesningen uten at det påvirker analysefølsomheten. - Inkuber i ytterligere 25 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Registrer luminescens ved hjelp av en ELISA-plateleser (integrasjonstid 0,25-1 s/per brønn) (se Materialfortegnelse).
- Lagre data i et passende format, for eksempel en datatabell som inneholder alle rålesninger og opptak av plateoppsettet og stoffene som brukes.
- Utfør overlevelsesanalysen i henhold til Referanse19.
- Dataanalyse ved hjelp av statistisk analyseprogramvare (se Materialfortegnelser)
- Lag en ny XY-tabell og sett inn data i et XY-format: Rader (X) er negativ kontroll etterfulgt av eskalerende legemiddeldoser, med doser som logg [Inhibitor] i Molar konsentrasjon. Kolonner (Y) er avlesningsverdier som inkluderer repliker stablet sammen med kolonner.
MERK: Konsentrasjonen av den negative kontrollen bør angis som en minimal verdi (gitt 0 er ikke mulig i loggskala), for eksempel logg [Inhibitor], M = -10. - Normaliser verdier ved å velge Analyser > Normaliser og bruk følgende parametere: normaliser hver delkolonne separat, Y = 0 som 0 %, "siste verdi i hver delkolonne (eller først avhengig av hva som er større)" som 100 %, resulterer i prosenter, graf resultatene.
- Tilpass ikke-lineær regresjonskurve på normaliserte data ved å velge Analyser > XY-analyser > Ikke-lineær regresjon > Doserespons - Hemming > logg (hemmer) vs . normalisert respons - Variabel helling.
- Rapportresultater som en tabell med IC50-verdier som er utdelt etter ikke-lineær regresjonsanalyse og diagram over responskurve, inkludert normaliserte datapunkter som gjennomsnittlig +/- standardavvik og montert regresjonskurve.
- Lag en ny XY-tabell og sett inn data i et XY-format: Rader (X) er negativ kontroll etterfulgt av eskalerende legemiddeldoser, med doser som logg [Inhibitor] i Molar konsentrasjon. Kolonner (Y) er avlesningsverdier som inkluderer repliker stablet sammen med kolonner.
Representative Results
Det er registrert betydelige utfordringer med å etablere NSCLC-organoider7. Dermed er det spennende å se nyere arbeid med å etablere lungekreftorganoider og bruke dem til legemiddelbehandlingsanalyser20,21,22. EGFR-mutasjoner står for 11,3% av NSCLC-tilfeller23. Målrettet behandling med EGFR-hemmere representerer førstelinjebehandlingsalternativet i EGFR-mutant NSCLC og har forbedret den totale overlevelses- og behandlingssikkerheten hos pasienter24. Dette arbeidet bestemte følsomheten til den FDA-godkjente EGFR tyrosinkinasehemmeren osimertinib24,25 i EGFR-mutant NSCLC organoider. EGFR-mutante NSCLC organoider ble generert fra kirurgisk reseksjon eller tumorbiopsiprøver av NSCLC-pasienter og bekreftet å huse den angitte onkogene mutasjonen ved DNA-sekvensering. Som beskrevet ovenfor ble EGFR-mutante NSCLC organoidmodeller behandlet med eskalerende doser av osimertinib og PUD-levedyktighet vurdert ved luminescensbasert celleoverlevelsesavlesning fem dager etter behandlingsstart. Mens EGFR-mutant (EGFRdel19)-positive TH107-organoider viste følsomhet overfor osimertinibbehandling med en halvmaksimert hemmende konsentrasjon (IC50) på 56 nM (figur 2 EGFR-mutant (EGFRL858R)-positive TH116 organoider var resistente mot osimertinibbehandling med en IC50 på over 1 μM (figur 2B). Følsomheten til EGFRdel19-positiv TH107 NSCLC ble ledsaget av betydelige transkripsjonsendringer, inkludert en reduksjon i uttrykket av cellesyklusrelaterte gensignaturer og en økning i uttrykket av apoptose-tilknyttede gensignaturer (supplerende figur 2A, B). Som referanse presenteres responsdata for den sensitive EGFRdel19-positive NSCLC-cellelinjen PC9 (figur 3A,B). Sistnevnte inkluderer overlevelsesanalyse for å eskalere doser av osimertinib med en 2D luminescensbasert overlevelsesanalyse (figur 3A) og studiet av signalundertrykking på nivået av EGFR-MAPK-signalering av vestlig blotter (figur 3B). Samlet sett fremhever disse dataene nøyaktigheten av den nåværende protokollen for å bestemme legemiddelrespons og skille mellom sensitive og resistente NSCLC PUD-modeller. Ytterligere analyser av EGFRL858R-positiv TH116 organoid og tilgjengelige kliniske prøver er nødvendig for å bestemme mulige resistensrelaterte endringer.
Figur 2: Behandlingsresponskurve for EGFR-mutante NSCLC organoidmodeller til osimertinib-eskalering. (A) Osimertinib respons i den sensitive EGFRdel19-positive TH107 NSCLC organoid modell. (B) Osimertinib-respons i den resistente EGFRL858R-positive TH116 NSCLC organoidmodellen. Datapunkter presenteres som normaliserte verdier som viser gjennomsnittlig +/- standardavvik, med en ikke-lineær regresjonskurve montert gjennom dataene. TH107, n = 6 tekniske replikerer per datapunkt. TH116, n = 4 tekniske replikerer per datapunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenlignende data for behandlingsresponsen på osimertinib i en sensitiv EGFR-mutant NSCLC-cellelinje og organoidmodeller dyrket i forskjellige medier. (A) Osimertinib-respons i den sensitive EGFRdel19-positive NSCLC-cellelinjen PC9, bestemt av standard 2D-CTG-analyse. (B) Signalisering av undertrykkelse i PC9-cellene ved to-dagers behandling med osimertinib (2 μM). (C) Osimertinib respons i sensitiv EGFRL858R-positiv TH330 NSCLC organoid modellkultur i LGM og GM media. (D) Osimertinib-respons i den resistente AZ021 NSCLC organoidmodellen i LGM- og GM-medier. Bekreftelse av den onkogene EGFRL858R-mutasjonen i AZ021 mislyktes og kan være årsakssammenheng for mangel på osimertinibrespons. For A og CD presenteres datapunkter som normaliserte verdier som viser gjennomsnittlig +/- standardavvik, med en ikke-lineær regresjonskurve montert gjennom dataene. PC9, n = 3 tekniske replikeringer per datapunkt. TH330, n = 5 tekniske replikeringer per datapunkt. AZ021, n = 6 tekniske replikerer per datapunkt. En Wilcoxon-rangeringstest ble utført på normaliserte data for å bestemme den statistiske betydningen. For TH330 (C), LGM vs. GM, ** p = 0,0078. For AZ021 (D), LGM vs. GM, ns p = 0,0742. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Representative celleanalysatorresultater for telling og levedyktighetsvurdering av EGFR-mutante organoidmodeller. TH107 og TH107BC refererer til ulike organoidmodeller og A og B til biologiske replikeringer. For hver modell og biologiske replikering telles tre tekniske repliker; alle viser ≥95% levedyktighet. Et representativt bilde under celletelling presenteres til høyre, og viser robust levedyktighet og encellet dissosiasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Gensettberikelsesanalyse (GSEA) ved hjelp av bulk RNA-sekvenseringsdata innhentet for EGFR-mutant TH107 NSCLC-organoider, som sammenligner ubehandlet kontroll (DMSO) og celler behandlet med Osimertinib i 3 dager (OSI_D3). (A-B) Ved målrettet behandling vil sensitive celler gjennomgå cellesyklus G1 arrestasjon og opphøre aktiv spredning. Som et uttrykk for G2M cellesyklusgener er forbundet med aktiv spredning, forventes en nominell berikelse av uttrykk i ubehandlet kontroll (DMSO). For apoptoserelaterte gener forventes en nominell berikelse i behandlede celler (OSI_D3). Begge er bekreftet i den EGFR-mutante TH107 NSCLC organoid-modellen behandlet med Osimertinib: (A) GSEA for Hallmark G2M uttrykkssignatur (venstre) viser berikelse i DMSO-behandlede celler. Nominell berikelsespoeng (NES): +1,708, FDR < 0,0001. (B) GSEA for Hallmark Apoptosis uttrykk signatur (høyre) viser berikelse i Osimertinib-behandlede celler. NES: -1.075, FDR: ns, 0.3275. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Kombinatorisk legemiddelbehandling i EGFR-mutant TH330 organoidmodell behandlet med Osimertinib-eskalering i nærvær av en annen additiv hemmer ved en fast konsentrasjon. Resistensrelaterte endringer i EGFR-mutant NSCLC, det vil si SRC- og AXL-aktivering26,27,28, var farmakologisk målrettet ved kombinatorisk behandling med SRC-hemmer Saracatinib (100 nM) eller AXL-hemmer R428 (500 nM), n = 6 tekniske replikeringer per datapunkt. Begge kombinatoriske behandlinger resulterte i økt behandlingsrespons, med betydning for kombinasjonen av Osimertinib med SRC-hemmer Saracatinib. Statistisk signifikans ble evaluert av Wilcoxon rangeringstest: Osimertinib versus Osimertinib + Saracatinib, *p = 0,0195; Osimertinib vs. Osimertinib + R428, ns, p = 0,2500. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Endring av organoid størrelse fra såing (d0) til 7 dager etter behandling (d7). (A) Vekstutvikling i EGFRdel19-positiv NSCLC organoid TH107. (B) Vekstutvikling i EGFRL858R-positiv NSCLC organoid TH330. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Dette manuskriptet utvikler og beskriver en standardisert protokoll for vurdering av legemiddelfølsomhet i NSCLC-avledede 3D PUD-modeller. I tillegg til legemiddelfølsomhetsstudier er det nødvendig med ytterligere karakterisering av tilgjengelige organoidmodeller for å bestemme de underliggende årsakene til forskjeller i legemiddelfølsomhet. Dette kan omfatte genetisk profilering av organoider og pasientprøver og annen analyse tilgjengelig for organoider, for eksempel immunhiistokjemifarging for differensieringsmarkører og generelle cellulære signalbiomarkører og fysiologi13,29.
Kritiske trinn i protokollen
Protokollen som er skissert her, gir en standardisert arbeidsflyt som muliggjør nøyaktige og reproduserbare legemiddelfølsomhetsanalyser når de følges nøye. Spesiell forsiktighet bør tas i følgende trinn: TrypLE og DNAse I fordøyelse under generering av encellede suspensjoner, såing av encellede suspensjoner i BME2, overvåking av organoid vekst til behandling, medieforandringer og forstyrrelser og lysis av BME2 innebygde organoider under luminescensbasert celleoverlevelsesavlesning. (1) Mens ytterligere DNAse I fordøyelse etter TrypLE-basert dissosiasjon av organoider ikke er avgjørende for å utvide organoidmodeller under regelmessig kulturvedlikehold, bør DNAse I fordøyelsen ikke utelates ved såing for narkotikaeskaleringsforsøk, da det sikrer bedre separasjon av organoidklynger i encellede suspensjoner og nøyaktig celletelling. (2) Såing av encellet suspensjon i BME2 representerer et kritisk skritt gitt størkning av BME2 ved romtemperatur. Dermed må maksimalt 1-2 rader frøs samtidig, og prøver bør plasseres på is før flere rader blir sådd. Vær oppmerksom på at celler må pipettes opp og ned når sådd fortsetter å tillate en homogen celleoppheng. (3) Organoid vekst må overvåkes nøye under 7-dagers ekspansjon fra såing til behandling. Et eksempel på forventet utvikling er gitt i figur 1B og supplerende tabell 1. Vær oppmerksom på at vurdering av endringer i organoid størrelse ved brightfield-mikroskopi og bildeanalyse som presentert i figur 1B kan muliggjøre en presis evaluering av forskjeller i organoid vekst og dobling av tider. Dobling av tidene kan ha innvirkning på narkotikaresponsen, som nylig omtalt i litteraturen30. Hvis den organoide vekstraten overstiger det presenterte eksemplet betydelig, kan en kortere ekspansjonstid til behandlingsstart og kortere behandlingsvarighet vurderes. (4) I tillegg bør det utvises spesiell forsiktighet ved bytte av medier for å unngå aspirerende organoider. Såingsposisjonen til BME2 innebygde organoider ved 6-tiden tillater en sikker aspirasjon av medier når platene dreies med klokken med 180° og media aspireres i motsatt posisjon av organoidene. (5) Endelig er grundig lysis av BME2 innebygde organoider under overlevelsesavlesningen viktig for å registrere nøyaktige resultater. I henhold til produsentens instruksjoner bør prøvene pipettes opp og ned gjentatte ganger, ideelt ved hjelp av ufiltrerte spisser, for å sikre riktig lysis. Inkubasjonstider bør følges som beskrevet. Videre overfører 75% av lysatet (i stedet for det totale volumet) til en hvit, ugjennomsiktig bunn 96-brønnsplate for den endelige avlesningen ved hjelp av en ELISA-plateleser gir en passende vurdering, da dette sikrer samme volum i hver brønn og fraværet av luftbobler som kan introduseres ved kraftig pipettering.
Vær oppmerksom på at profilering av legemiddelresponser i BME2-innebygde organoidkulturer kan vise et høyere standardavvik enn observert i vanlige cellelinjekulturer (figur 2, figur 3A). Det høyere standardavviket er basert på flere faktorer, inkludert økt sannsynlighet for mindre variasjoner i såing i arbeid med BME2 og forskjeller i individuelle organoid vekstrater på tvers av brønner i løpet av den første 7-dagers vekstperioden. Dermed bør like eller mer enn fire tekniske repliker per legemiddelkonsentrasjon bli sådd.
Viktigst av alt, tilstedeværelsen av ondartede celler som bærer den onkogene drivermutasjonen og begrenset forurensning av normale epitelceller i luftveiene, må vurderes nøye. Utfordringer i NSCLC-etablissementet kan favorisere utveksten av normale epitelceller i luftveiene7. Kopinummerprofilering eller PCR- og sekvenseringsbaserte tilnærminger for å bekrefte tilstedeværelsen av de onkogene drivermutasjonene er de valgte metodene for å sikre kvaliteten på NSCLC organoidkulturer.
Endringer og feilsøking av metoden
Medier og respektive vekstfaktorer som legges til grunnleggende medieløsninger, kan ha betydelig innvirkning på legemiddelresponsen på målrettede hemmere. De aktiverer bypass-reseptorer og signalveier som påvirker og begrenser legemiddelresponsen (f.eks. FGF, HGF, EGF)26. Mens en vekstfaktorrik og skreddersydd media kan være optimal for å utvide organoidkulturen, bør narkotikaeskalering og følsomhetsvurderinger utføres i et redusert vekstfaktormedium, som beskrevet ovenfor. Dette er basert på intern erfaring med å sammenligne ulike medieformuleringer og legemiddelresponsdata (figur 3C). Mens medieløsninger kan påvirke graden av følsomhet for visse legemiddelbehandlinger og kan endre IC50-verdier, er robuste fenotyper av følsomhet eller resistens tydelig uavhengig av medieformulering (figur 3C,D). I tillegg anbefales generell konsistens i medieformuleringen og profilering av legemiddelresponser på tvers av organoidkulturer, og en lik eller mer enn fire tekniske replikerer per konsentrasjon må frøes. Dette er spesielt viktig for referanseområdene i sensitivitet kontra. motstand for inhibitor av interesse.
Begrensninger ved metoden
Protokollen som presenteres her beskriver følsomheten til NSCLC 3D kreft organoid modeller til målrettede hemmere når pasientavledede kreftceller dyrkes. Ytterligere eksperimenter, inkludert farmakodynamisk analyse om banehemming og sekvenseringsanalyse for tilstedeværelsen av driver oncogene og sekundære mutasjoner, er nødvendig for en detaljert karakterisering av legemiddelresistens og følsomhet. Videre er det ikke gjort rede for tilskuerfaktorer som mikromiljøstimuli avledet fra interaksjoner eller utskilte faktorer av ikke-kreft-tilskuerceller i tumormikromiljøet, og nye protokoller er nødvendig når kokulturorganoidmodeller med immun- eller stromalceller forsøkes. Nyere arbeid har fremhevet bruken av organoidmodeller for å rekapitulere tumormikromiljøinteraksjoner og profilresponser på immunkontrollpunkthemmere, for eksempel anti-PD-L1-behandling13,31.
Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende / alternative metoder
3D kreft organoid modeller rekapitulere genetisk mangfold og determinanter av behandlingsrespons tilstede i den opprinnelige svulsten4,5,6. Spesielt kan romlig og temporal heterogenitet fremme tumorutvikling, og parallell fremvekst og sekvensiell utvikling av tumor subclones kan forekomme32,33. Intratumor heterogenitet er viktig for valg av mer elastiske tumorceller under terapeutisk trykk9,34,35. Protokollen som er gitt her tillater en rask vurdering av følsomheter for behandling med målrettede hemmere i pasient-proksimale prøver. Dermed har organoidmodeller fordeler i forhold til mer konvensjonelle homogene cellelinjemodeller som mangler genetisk mangfold eller langsiktige studier ved hjelp av cellelinjer eller pasientavledede xenografter. Videre tillater den nåværende protokollen skalering av opptil flere behandlingsvåpen og kombinasjonsbehandlingsmetoder med få begrensninger når det gjelder kostnads- og analysekapasitet. Som sådan, å legge til et annet stoff av interesse ved en fast dose mens du eskalerer den primært målrettede inhibitoren og sammenligner den med eskaleringen av den primært målrettede inhibitoren alene, gjør det mulig å effektivt evaluere de potensielle kombinatoriske effektene og med minimal ekstra biomasse som kreves (Supplerende figur 3). Sammenlignet med bildebaserte vurderinger som brukes til å overvåke organoid utvikling og legemiddelrespons, har den luminescensbaserte celleoverlevelsesanalysen beskrevet her lignende følsomhet med minimalt utstyr og opplæring som kreves.
Viktigheten og potensielle anvendelser av metoden på spesifikke forskningsområder
Utvikling av en standardisert rørledning som gjør det mulig å etablere kreftorganoidmodeller fra pasientprøver og den påfølgende legemiddelfølsomhetsprofileringen har et betydelig klinisk anvendbarhetspotensial. Ex vivo farmakologisk profilering har fått anerkjennelse i å oppdage sårbarheter og resistente assosierte egenskaper i svulster, korrelerer med behandlingsrespons hos pasienter36,37. Eks vivoprofilering av legemiddelfølsomheter kan være viktig, og kan hjelpe til med behandlingsvalg i klinikken og utformingen av rasjonelle kombinasjonsbehandlinger som omhandler resistensmekanismer. Samlet sett kan denne tilnærmingen bidra til å muliggjøre forbedrede personlige strategier for molekylær terapi eller kombinatoriske behandlingsregimer. Sistnevnte kan bidra til å målrette narkotikatoleranse og resistensmekanismer tidlig og utdype klinisk respons for å forbedre pasientresultatene i fremtiden.
Disclosures
T.G.B. er rådgiver for Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences, og mottar forskningsmidler fra Novartis, Strategia, Kinnate og Revolution Medicines.
Acknowledgments
Vi takker laboratoriene til Jeroen P Roose (UCSF) og Calvin J Kuo (Stanford) for deres innspill om organoid kultur og protokollutvikling. Vi takker videre Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) for protokoller og innspill til prøvebedrifter. Dette forskningsprosjektet ble gjennomført med støtte fra NIH [U54CA224081]. F. Haderk ble støttet av Mildred Scheel postdoktorstipend fra den tyske krefthjelpen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
| 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
| 96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
| A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
| B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
| BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
| BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
| Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
| Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
| GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
| hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
| hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
| hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
| hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
| Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
| Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
| Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
| Multichannel pipette | |||
| N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
| Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
| Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
| Pipettes (different sizes) | |||
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
| SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
| Vacuum pump and tubing | |||
| Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |
References
- de Bono, J. S., Ashworth, A. Translating cancer research into targeted therapeutics. Nature. 467 (7315), 543-549 (2010).
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Dijkstra, K. K., et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Reports. 31 (5), 107588 (2020).
- Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Bivona, T. G., Doebele, R. C. A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers. Nature Medicine. 22 (5), 472-478 (2016).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Tashiro, T., et al. In vivo and ex vivo cetuximab sensitivity assay using three-dimensional primary culture system to stratify KRAS mutant colorectal cancer. PLoS One. 12 (3), 0174151 (2017).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Hysenaj, L., et al. SARS-CoV-2 infection studies in lung organoids identify TSPAN8 as novel mediator. bioRxiv. , (2021).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocol in Immunology. , Appendix 3, Appendix 3B (2001).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Promega Corporation. CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay. Promega Corporation. , (2021).
- Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communication. 10 (1), 3991 (2019).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communication. 12 (1), 2581 (2021).
- Shi, R., et al. Organoid cultures as preclinical models of non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (5), 1162-1174 (2020).
- Collisson, E. A., et al. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511 (7511), 543-550 (2014).
- Ramalingam, S. S., et al. Overall Survival with Osimertinib in untreated, EGFR-mutated advanced NSCLC. New England Journal of Medicine. 382 (1), 41-50 (2019).
- Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 378 (2), 113-125 (2017).
- Rotow, J., Bivona, T. G. Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC. Nature Reviews Cancer. 17 (11), 637-658 (2017).
- Zhang, Z., et al. Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer. Nature Genetics. 44 (8), 852-860 (2012).
- Kanda, R., et al. Erlotinib resistance in lung cancer cells mediated by integrin β1/Src/Akt-driven bypass signaling. Cancer Research. 73 (20), 6243-6253 (2013).
- Bruun, J., et al. Patient-derived organoids from multiple colorectal cancer liver metastases reveal moderate intra-patient pharmacotranscriptomic heterogeneity. Clinical Cancer Research. 26 (15), 4107-4119 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Yuki, K., Cheng, N., Nakano, M., Kuo, C. J. Organoid models of tumor immunology. Trends in Immunology. 41 (8), 652-664 (2020).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
- Rambow, F., et al. Toward minimal residual disease-directed therapy in melanoma. Cell. 174 (4), 843-855 (2018).
- Marine, J. C., Dawson, S. J., Dawson, M. A. Non-genetic mechanisms of therapeutic resistance in cancer. Nature Reviews Cancer. 20 (12), 743-756 (2020).
- Frismantas, V., et al. Ex vivo drug response profiling detects recurrent sensitivity patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia. Blood. 129 (11), 26-37 (2017).
- Drusbosky, L. M., et al. Predicting response to BET inhibitors using computational modeling: A BEAT AML project study. Leukemia Research. 77, 42-50 (2019).
