Summary
Användningen av fotodegraderbara hydrogeler för att isolera bakterieceller genom att använda ett högupplöst ljus pattering verktyg rapporteras. Viktiga experimentella procedurer, resultat och fördelar med processen ses över. Metoden möjliggör snabb och billig isolering av riktade bakterier som visar sällsynta eller unika funktioner från heterogena samhällen eller populationer.
Abstract
Biologer har länge försökt förstå förhållandet mellan fenotyp och genotyp. För att bättre förstå denna koppling är det viktigt att utveckla praktisk teknik som kopplar mikroskopisk cellscreening med cellisolering vid hög renhet för nedströms genetisk analys. Här beskrivs användningen av fotodegraderbara poly (etylenglykol) hydrogeler för screening och isolering av bakterier med unika tillväxtfenotyper från heterogena cellpopulationer. Metoden bygger på att kapsla in eller fånga celler med hydrogelen, följt av kultur, mikroskopisk screening, sedan användning av ett högupplöst ljusmönsterverktyg för spatiotemporal kontroll av hydrogelnedbrytning och frisättning av valda celler i en lösning för hämtning. Genom att använda olika ljusmönster kan man kontrollera den extraherade cellens morfologi, och mönster som ringar eller kors kan användas för att hämta celler med minimal direkt UV-ljusexponering för att minska DNA-skador på isolaten. Dessutom ger ljusmönsoneringsverktyget en justerbar ljusdos för att uppnå olika nedbrytnings- och cellfrisättningshastigheter. Det möjliggör nedbrytning vid hög upplösning, vilket möjliggör cellhämtning med rumslig precision i mikronskala. Här demonstreras användningen av detta material för att screena och hämta bakterier från både bulkhydrogeler och mikrofabricerade lab-on-a-chip-enheter. Metoden är billig, enkel och kan användas för vanliga och framväxande tillämpningar inom mikrobiologi, inklusive isolering av bakteriestammar med sällsynta tillväxtprofiler från mutanta bibliotek och isolering av bakteriella konsortier med framväxande fenotyper för genomiska karakteriseringar.
Introduction
Isolering av celler med unika beteenden från en komplex och heterogen miljö är grundläggande för att få genetisk information i biologi1. Inom mikrobiologi blir valet och isoleringen av sällsynta eller unika mikrober efter observation viktigt i många tillämpningar som kräver en koppling mellan genomisk information och observerbar fenotypisk information. Dessa applikationer inkluderar att välja fenotypiskt sällsynta stammar från mutanta bibliotek2, välja keystone mikroorganismer från komplexa mikrobiella samhällen3,4, och välja fenotypiskt sällsynta men viktiga bakterier från isogenic populationer. Isolering av livskraftiga men icke-okrturerbara celler (VBNC) från en bakteriepopulation är ett viktigt exempel på den senare, där celler med VBNC-fenotypen ofta är dolda i bakteriepopulationer vid 1:102 till 1:105 förhållanden5,6. På grund av de utbredda svårigheterna i bakterieisolering är mycket fortfarande okänt om många fenotypiskt sällsynta mikroorganismer. Dessa begränsningar betonar behovet av cellisoleringstekniker för att först identifiera målcellen eller cellerna från en blandning och sedan hämta och isolera dem för nedströms molekylär analys7.
Några av de vanligaste metoderna för cellisolering inkluderar flödescytometri och fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS)8,immunomagnetisk separation9,10och mikrofluidik11. Även om dessa isoleringsmetoder har högt värde, har de också nackdelar som begränsar deras användning. FACS kan till exempel tillhandahålla rutinmässig mikrobiell isolering på encellsnivå för uppföljande genomisk analys3 men begränsas ofta av dess tillgänglighet och kostnad, liksom nedströmsföroreningsproblem11. Mikrofluidbaserade metoder såsom mikrofluidisk flödescytometri har fått mycket uppmärksamhet, vilket jämfört med konventionell flödescytometri möjliggör en betydande minskning av den provvolym som krävs12. Separation och hämtning av en enskild eller liten samlingar av celler från mikrofluidiska enheter är dock ofta ett utmanande problem som vanligtvis kräver en mer komplex installation och enhetsdesign13. Många mikrofluidiska metoder karakteriserar genetiskt celler innan de matas in och observeras i en enhet14, vilket begränsar antalet unika arter som observeras när de utför en funktionell skärm. Med tanke på dessa begränsningar krävs ytterligare innovation av både metoder och material som är praktiska för cellscreening och isolering för utbredd användning i många laboratorier.
Detta dokument presenterar en ny, materialbaserad metod för bakteriescreening och isolering. Metoden använder fotodegraderbara hydrogeler för cellinkapsling, kultur, mikroskopisk observation och frisättning på begäran och återvinning av riktade bakterier med unika fenotyper. Hydrogeler är konstruerade för att innehålla 10 nm maskstorlek, där varje tvärlänk innehåller o-nitrobenzyl grupper15. Materialet kapslar in eller fångar celler för observation samtidigt som det möjliggör diffusion av näringsämnen och avfallsprodukter till och från celler för odling. Genom att utsätta materialet för en mönstrad 365 nm UV-ljuskälla genom ett upprätt mikroskop möjliggör lokal nedbrytning av hydrogelen genom fotokelavage av o-nitrobenzylgrupper16, 17. Nedbrytning utlöser selektiv frisättning av celler för återvinning för nedströms analys, inklusive genomisk och, potentiellt, proteomisk och transkriptomisk analys. Den experimentella installationen och protokollet är relativt enkla, billiga och translationella till mikrobiologiska laboratorier. Det kräver endast cellinkapsling genom hydrogelbildning, observation av fångade celler med ett upprätt ljusfält och fluorescensmikroskop och belysning av celler av intresse med en mönstrad UV-ljuskälla för hämtning.
En viktig fördel med denna materialbaserade metod för screening är dess anpassningsförmåga till olika screeningformat. I sitt mest grundläggande format kan materialet användas för screening genom att kapsla in en heterogen cellsamling i bulkhydrogeler. Celler observeras sedan för önskad fenotyp, och enskilda celler av intresse tas bort för genomisk karakterisering. I mer genomarbetade format kan materialet också integreras i lab-on-a-chip-enheter för att ge exakt cellutlösning och hämtning från önskade områden av enheten. Båda formaten beskrivs här, och båda har möjliggjort nyligen ny mikrobiell screening och urvalsapplikationer17,18,19. Metoden demonstreras här med modell gramnegativa organismer (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) och en modell Grampositiv organism (Bacillus subtilis) och har lätt utvidgats till en mängd andra bakterier.
Protocol
1. Bakteriestammar och kulturprotokoll
- Streak kolonier av bakterier på agar plattor kompletteras med lämpliga tillväxtmedier. I denna rapport odlas B. subtilis (stam 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) på ATGN (0,079 M KH2PO4,0,015 M (NH4)2SO4, 0,6 mM MgSO4·7H 2 O, 0,06 mM CaCl 2 ·2H 2 O, 0,6 mM MgSO 4 ·7H 2 O, 0,06 mM CaCl 2 ·2H 2 O, 0,6 mM MgSO 4 ·7H 2 O, 0,06 mM CaCl 2 ·2H 2 O, 0,6 mM MgSO 4 ·7H 2 O, 0,06 mM CaCl 2 ·2H 2 O, 0,6 mM MgSO 4 ·7H 2 O, 0,06 mM CaCl 2 ·2H 2 O, 0,6 mM MgSO 4 ·7H 2 O, 0,06 mM CaCl 2 ·2H 2 O, 0,6 mM MgSO 4 ·7H 2 O, 0,06 mM CaCl 2·2H 2O, 0,6 mM MgSO 4 ·7H2O, 0,06 mM CaCl2·2 H2O, 0.125 M FeSO4· 7H2O, 28 mM glukos, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L agar) agarplattor kompletterade med 100 μg/mL spectinomycin och E. coli (stam 25922, ATCC) på ATGN agarplattor kompletterade med 100 μg/mL ampicillin.
OBS: Tidigare rapporter om hydrogel inkapsling och frisättning med dessa material från Fattahi et al.19 istället används A. tumefaciens C58 celler - Välj önskade kolonier från ATGN-agarplattor och börja övernatta kulturer. För E. coli- och B. subtilisstammar som används här, odla vid 37 °C medan du skakar vid 215 varv/min i ATGN flytande medium i 24 timmar. Förvara cellkulturerna i 50% glycerol vid -80 °C tills framtida användning.
- Plocka kolonier av båda stammarna från glycerollager med sterila inokuleringsöglor och inkubera i ATGN flytande medier i 24 h vid 37 °C och 215 rpm.
2. Beredning av det material som behövs för hydrogelbildning
- Fotodegradabel PEG-o-NB-diacrylate syntes
OBS: Den interna syntesen av PEG- o-NB-diacrylate har beskrivits väl och tidigare rapporterats16,17. Alternativt, eftersom syntesen är rutinmässig, kan den outsourcas från en kemisk syntesanläggning. - Buffert för korslänkning
- Ta receptet på det valda mediet för bakteriestammen och förbered media med 2x näringsämnen. Tillsätt fosfat, t.ex. NaH2PO4, till mediet till en slutlig koncentration på 100 mM. Justera sedan pH-värdet till 8 med 5 M NaOH (aq).
- Sterilisera buffertlösningen och förvara den vid -20 °C tills vidare.
OBS: Utelämna eventuella övergångsmetaller som finns i media, eftersom dessa metaller katalyserar oxidationen av tioolerna till disulfider.
- PEG-o-NB-diacrylate lösning
- För varje mg alikvot PEG-o-NB-diacrylate (3 400 Da molekylvikt) pulver, tillsätt 3,08 μL ultrapure vatten för att nå 49 mM koncentration av PEG-o-NB-diacrylate (98 mM akrylatkoncentration).
- Virvel lösningen tills den är väl blandad och förvara denna lösning vid -20 °C tills vidare användning.
- 4-arm PEG-tioollösning
- För 4-arm PEG-tiool (10 000 Da molekylvikt) beredning, tillsätt 4 μL ultrapure vatten per mg pulver för att nå en koncentration på 20 mM (80 mM tiolkoncentration).
- Virvel denna lösning tills den är väl blandad och förvara denna lösning vid -20 °C tills vidare användning.
3. Beredning av perfluoralkylerade (icke-reaktiva) täcksläp
- Placera upp till 5 glasrutschbanor (25 mm x 75 mm x 1 mm) inuti en bildsändare med polypropylen. Sonikera bilderna med en 2% (w/v) tvättmedelslösning(Materialtabell) i 20 min.
- Skölj rutschkanorna tre gånger med ultrapure vatten och sonikera sedan rutschkanorna i vatten i 20 min. Torka bilderna med en ström av N2.
- Plasmaren (se Materialtabell) på båda sidor av glasglasen enligt protokollet i avsnitt 4.1 i 2 min.
- Placera tillbaka de plasmarengjorda bilderna i bildutskicket och fyll behållaren med en 0,5 % (v/v) lösning av triklor(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluoroktyl)silan i toluen. Låt dessa glasrutschbanor funktionaliseras i 3 timmar vid rumstemperatur (RT).
- När bilderna har funktionaliserats sköljer du bilderna i bildutskicket, först med toluen och nästa etanol (tre gånger med varje lösningsmedel). Torka sedan varje funktionaliserad bild med en ström av N2.
4. Beredning av tioolfunktionaliserade (bas) täckslipar
- Rengöring av glasöverdragen med hjälp av en plasmarengörare
- Placera 18 mm x 18 mm täcken i en Petri-skål. Placera sedan Petri-skålen i en plasmarengörarekammare och slå på plasmarensarens kraft.
- Slå på vakuumpumpen för att rensa luften i kammaren tills tryckmätaren avläser 400 mTorr.
- Öppna mätventilen för att släppa in luft i kammaren tills tryckmätaren når ett jämnt tryck (800-1000 mTorr). Välj sedan RF med "Hi" -läge och exponera täckena i 3 min.
- Stäng av RF-läget och vakuumpumpen efter 3 minuter.
- Ta ut Petri-skålen ur kammaren, vänd täcksläparna och placera dem tillbaka i kammaren för att plasma exponera den andra sidan av glasets täckglas.
- Upprepa steg 4.1.2-4.1.4 för att plasma rengöra den obehandlade sidan av glasöverdraget.
- När du har slutfört processen, ta bort Petri-skålen från kammaren och stäng av plasmarengöraren och dammsugaren.
- Rengöring och hydroxylering av täckena med piranhalösning
OBS: Standard piranha rengöringsprotokoll kan användas för att rengöra och hydroxilate glas glider. Piranha-lösningen är en 30:70 (v/v) blandning av H2O2 och H2SO4. Alternativa metoder för rengöring av glasöverdrag kan också användas.
VARNING: Piranha-lösningen är starkt frätande och explosiv med organiska lösningsmedel och bör hanteras med stor försiktighet. Lämpliga säkerhets- och inneslutningsåtgärder bör vidtas, såsom användning av lämplig personlig skyddsutrustning (labbrock, kemiskt resistent förkläde, skyddsglasögon, ansiktsskydd, syrabeständiga butylhandskar). Alla glas och arbetsytor som kommer i kontakt med piranhalösning ska vara rena, torra och fria från organiska rester före användning. Piranha-lösningen får aldrig förvaras i en delvis stängd eller sluten behållare.- Placera en ren 100 mm x 50 mm glasfat på en magnetomrörare med justerbar omrörning under en rökhuv och tillsätt 14 ml H2SO4 till skålen.
- Placera försiktigt en liten, teflonbelagd magnetisk omrörningsstång med teflonbelagda tångar inuti skålen. Vrid sedan omröraren långsamt för att undvika att stänka syran.
- Tillsätt sedan försiktigt 6 ml H2O2 till skålen och låt lösningen blandas väl.
- Stäng av omröraren och ta sedan bort omrörsstången från skålen med tången. Placera sedan försiktigt täcksläparna inuti skålen med tångarna och ställ in temperaturen på 60–80 °C.
- Efter 30 minuter, ta försiktigt bort täcksläckorna med tångarna och dränk dem i avjoniserat vatten (DI) vatten två gånger för att tvätta bort rest piranha-lösningen.
- Efter sköljning med vatten, förvara täckena i DI-vatten på RT tills vidare användning.
- Stäng av kokplattan och låt piranhalösningen svalna.
- För att kassera piranhalösningen, placera försiktigt glasfatet på 100 mm x 50 mm som innehåller den kylda pirayalösningen i en större, tom glasbägare som är minst 1,5 L i volym. Tillsätt sedan 1 L vatten för att späda och tillsätt natriumbikarbonatpulver för att neutralisera. Observera att natriumbikarbonat kommer att orsaka bubblande och värmegenerering och bör tillsättas mycket långsamt, annars kan bubblande leda till stänk av syran. När ytterligare tillsats av natriumbikarbonat inte orsakar bubblande, kontrollera pH med pH-papper för att kontrollera att det har neutraliserats. När lösningen är neutraliserad och kyld kan den hällas ner i diskbänken.
- Thiolfunktionalisering av täcksliparna
- Förbered en 5% (v/v) lösning på 269 mM (3-mercaptopropyl) trimetoxisalan (MPTS) lösning i torr toluen.
- Tillsätt 10 ml av lösningen till enskilda koniska centrifugrör på 50 ml och placera ett rengjort täckglas i varje rör och dränk det i lösningen.
OBS: Ett täckslip per 50 ml rör används för att säkerställa att båda sidor av substratet ingjuts utan att störas av andra substrat. - Efter 4 h, tvätta varje täckben (fyra tvättar per täckslip) med toluen, en 1:1 (v/v) etanol: toluenblandning och etanol.
OBS: Detta görs genom att nedsänka varje täckslip sekventiellt i koniska centrifugrör som innehåller de nämnda lösningarna. - Efter sköljning av substratet, dränk dem i etanol och förvara dem vid 4 °C tills vidare användning.
OBS: Beroende på antalet täcken kan denna metod bli mödosam på grund av att man behandlar täckslipar en i taget. För flera täcken kan Columbia-burkar som passar flera täcken samtidigt användas.
5. Tillverkning av kiselmikrobrunnmatriser
- Parylenbeläggning: Använd standardprotokollet som beskrivs i tidigare forskningsartiklar20,21 för att belägga kiselplattor med parylen.
- Mikrotillverkning: Följ det protokoll som beskrivs av Barua etal.18 för att konstruera och tillverka mikrobrunnmatrisen(kompletterande figur 1).
OBS: Standard fotolitografiska tekniker som beskrivs av Timm et al.17 tillämpades för att tillverka microwell matriser på parylen-belagda kiselplattor.
6. Hydrogelbildning
- Bulkhydrogelbildning på glasöverdrag
- Hydrogelprekursorlösning: Tillsätt 12,5 μL av tvärbindningsbufferten till ett 0,5 mL mikrocentrifugerör,följt av 5,6 μL PEG- o-NB-diacrylatelösning. Tillsätt slutligen 6,9 μL 4-arm PEG-tioollösning till blandningen.
OBS: Genom att tillsätta 4-arm PEG-tialen i blandningen initieras korslänkningsreaktionen. Således bör hydrogelprekursorlösningen användas omedelbart efter blandning. - Följ steg 6.1.3-6.1.9 för cellinkapsling i hydrogelprekursorlösningen.
- För cellinkapsling inokulerar du, före steg 6.1.1, tvärlänkningsbufferten med önskad celltäthet. Som rapporterats tidigare19observerades att celltätheten på 7,26 × 107 CFU/ml i tvärbindningsbufferten korrelerar till en densitet på ~ 90 celler/mm2 inkapslad över hydrogelen.
- Placera det tiaderade bottenöverdraget på en ren Petri-skål. Placera två distanser (se Materialtabell) på de två motsatta sidorna av täckslipet.
OBS: Thiolfunktionalisering av täcksliparna är nödvändig för den kovalenta fastsättningen av hydrogelen på täckytan. Detta görs genom reaktionen av tiolgrupper på ytan och de akrylatgrupper som finns i hydrogelprekursorlösningen. - Fixera distanserna på basöverdraget genom att tejpa distanserna på Petri-skålen.
- Pipettera önskad volym av prekursorlösningen på en icke-reaktiv, perfluoralkylerad glasrutschbana.
- Placera den perfluoralkylerade glasglasbilden på bottenöverdraget(figur 1C). Vänta i 25 min på RT för att hydrogelbildningen ska slutföras.
- Efter gelering, ta försiktigt bort den perfluoralkylerade glasrutschbanan. Hydrogelen förblir fastsatt på bottenöverdraget.
OBS: Använd ~7 μL av prekursorlösningen för 18 mm x 8 mm för att erhålla ett 12,7 μm tjockt membran (figur 1A,B). Användning av högre volymer av prekursorlösning kan resultera i hydrogel under bastäcket. Detta kan leda till att basskyddet fastnar på Petri-skålen och bryts vid ett försök att ta bort. Hydrogelrester under täckslipet är också problematiskt för mikroskopi. Skonsam borttagning av den icke-reaktiva perfluoralkylerade glasrutschbanan krävs eftersom snabb borttagning kan skada hydrogelen. - Placera substratet i en 60 mm x 15 mm Petriskål i angivna odlingsmedier. Här användes ATGN media kompletterade med 100 μg/mL spectinomycin för B. subtilis eller 100 μg/mL ampicillin för E.coli vid 37 °C för 24 h kulturtider.
- Hydrogelprekursorlösning: Tillsätt 12,5 μL av tvärbindningsbufferten till ett 0,5 mL mikrocentrifugerör,följt av 5,6 μL PEG- o-NB-diacrylatelösning. Tillsätt slutligen 6,9 μL 4-arm PEG-tioollösning till blandningen.
Figur 1: Hydrogelbildning på tiolerade glasöverdrag. (A) Distanser med en tjocklek av 12,7 μm placeras på två motsatta sidor av ett basöverdrag som innehåller reaktiva tiolhusgrupper. (B) Hydrogelprekursorlösningen är pipetted över en icke-reaktiv, fluorerad glasrutschbana. (C) Den icke-reaktiva glasrutschbanan placeras på distanserna för bildandet av 12,7 μm tjock hydrogel. ( D) Den icke-reaktiva glasrutschbanan avlägsnas försiktigt och lämnar hydrogelen fäst vid basöverdraget. (E) Den beredda hydrogelen kan inkuberas i media för kultur. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
7. Hydrogelbildning över mikrobrunnmatriser
- Bakteriesådd i mikrobrunnmatriser
OBS: 700 μL av 0,1 OD600 cell suspensioner såddes över microwell array substrat, och parylen lift-off metoden tillämpades för att ta bort celler från bakgrunden med hjälp av protokollet som beskrivs av Timm et al. 22. - Förbered hydrogelprekursorlösningen genom att tillsätta 5,6μL PEG- o-NB-diacrylate med 12,5 μL pH 8 fosfatbuffrad saltlösning ATGN och blanda med 6,9 μL av den fyrarmade PEG-tioollösningen.
- Pipett 12,5 μL av prekursorlösningen på en icke-reaktiv, perfluoralkylerad glasrutschbana och placera två 38 μm ståltrum (se Materialtabellen)på två motsatta sidor av mikrobrunnsmatrissubstratet inokulerat med celler.
- Vänd den perfluoralkylerade glasrutschbanan med prekursorlösningsdroppen och placera droppen i mitten av mikrobrunnssubstratet. Inkubera sedan i 25 min vid RT för hydrogelbildning.
- Ta försiktigt bort glasrutschbanan från mikrobrunnssubstratet. Hydrogelmembranet ska förbli fastsatt på mikrobrunnssubstratet. Fortsätt till steg 6.1.9.
8. Materialberedning för cellutvinning
- PDMS-hållare förberedelse
- Tejpa ihop en stapel på tio 18 x 18 mm täckslipar och limma fast denna bunt täcksläp på botten av en Petriskål.
- För att tillverka PDMS-hållare, blanda PDMS-föregångaren och härdningsmedlet i ett förhållande av 10: 1 volymförhållande i en plastkopp, avgasa blandningen i en vakuumavsickering och häll sedan blandningen i Petri-skålen.
- Härda PDMS i 90 min vid 80 °C. Skär sedan runt det tejpade blocket för att ta bort PDMS-hållaren och placera PDMS-hållaren på en glasrutschbana för enklare hantering för mikroskopi.
- Microsyringe och rörberedning
- Skär 20 cm PTFE-slangar (0,05 i ID) och fäst ena änden av slangen på en 100 μL mikroliterspruta.
OBS: För extraktion, undvik att använda pipetter eftersom ritning av de utsläppta cellerna via en pipettspets kan skada hydrogelytan och leda till förorening.
- Skär 20 cm PTFE-slangar (0,05 i ID) och fäst ena änden av slangen på en 100 μL mikroliterspruta.
9. Hydrogelnedbrytning med det mönstrade belysningsverktyget
OBS: Följande steg som beskrivs i detta avsnitt är identiska för både bulkhydrogeler och mikrobrunnmatriser, med undantag för de ljusexponeringsmönster som beskrivs i steg 9.6.4-9.6.6 och 9.6.7-9.6.10.
- Slå på mikroskopet (se Materialförteckning). Slå sedan på det mönstrade belysningsverktyget (se Tabell över material).
- Slå på 365 nm LED-ljuskällan Analog och Digital styrmodul. Slå sedan på LED-styrmodulen för ljuskälla.
- Öppna mikroskopprogramvaran och programvaran för det mönstrade belysningsverktyget. När fönstret för maskinvarukonfiguration öppnas väljer du knappen Läs in.
OBS: Tre enheter kommer att laddas här. (Kamera från tredje part, en styrmodul och det mönstrade belysningsverktyget) - Tryck på Start-knappen. Det ljusmönstrande programvarufönstret öppnas nu. Välj det första alternativet, knappen Enhetskontroll, i fönstrets vänstra sidofält.
- Kalibrera det mönstrade belysningsverktyget.
OBS: Kalibrering måste göras med samma mikroskopmål och filter som ska användas för ljusexponering.- Ställ in mikroskopmålet på 10x förstoring.
OBS: Denna förstoring ger tillräckligt arbetsavstånd mellan mikroskoplinsen och provytan. Det gör det också möjligt att övervaka och registrera hämtningsprocessen i realtid genom bildfönstret. - Ställ in mikroskoplinsen och filtret på de inställningar som används för ljusexponering och placera kalibreringsspegeln under mikroskopet.
- Tryck på fliken LED-kontroll i fönstret Enhetskontroll. Slå på LYSDIOD #1 och ställ in ljusintensiteten på önskat nummer. I standardextraktionsexperiment är detta inställt på 60 %.
- Tryck på fliken med det mönstrade belysningsverktygets produktnamn i fönstret Enhetskontroll. Tryck sedan på knappen Visa rutnät.
OBS: Ett rutnätsmönster projiceras på kalibreringsspegeln. - Justera mikroskopets fokus och kameraexponering för att få hög bildkvalitet på rutnätet och rotera kameran för att justera rutnätslinjerna parallellt med kamerans fönsterram, om det behövs.
- Välj knappen Kalibreringsguiden under fliken med det mönstrade belysningsverktygets produktnamn och följ instruktionerna från programvaran i det här fönstret.
Ett kamerainställningsfönster från tredje part öppnas. - Ett kalibreringsfönster för typval öppnas. Välj Automatisk kalibrering och tryck på Nästa.
- När fönstret Justering före kalibrering öppnas följer du programvaruanvisningarna och trycker på knappen Nästa.
- När fönstret Mappningsinformation öppnas sparar du kalibreringen i önskad mapp. Detta görs genom att sätta in datum, mikroskopnamn, objektivlins och filter.
- Efter kalibrering trycker du på knappen Arbetsområdesdefinition som finns under fliken med det mönstrade belysningsverktygets produktnamn för att definiera arbetsområdet för det mönstrade belysningsverktyget om det behövs.
- Ställ in mikroskopmålet på 10x förstoring.
- Sekvensdesignavsnittet för mönsterförberedelse.
- Tryck på knappen Sekvensdesign till vänster i programfönstret. Tryck sedan på knappen Profilsekvensredigeraren.
- När fönstret Profilsekvensredigeraren öppnas väljer du alternativet Ny profil under profillistan.
Nu öppnas ett mönsterredigerarefönster. - Förbered önskat mönster för ljusexponering genom att välja olika mönsterformer och storlekar, eller rita mönstret manuellt om så önskas.
- För cirkel och trasiga korsmönster för bulkhydrogelen, följ steg 9.6.5- 9.6.6
- För cirkelmönster definierar du en cirkel med en diameter på 30 μm över en målbakterierkoloni för att täcka hela kolonin. Välj figurfyllningsfärgen vit.
- För brutna korsmönster väljer du rektangelformen från mönsterritningsfönstret med 3 μm x 8 μm dimensioner. Placera fyra rektanglar med den här dimensionen på målkolonins kanter, medan hälften av mönstren har ett överlägg med kolonin.
- För cirkel- och ringmönster för mikrobrunnsmatriserna, följ steg 9.6.8-9.6.10.
- För cirkelmönster, rita en cirkel med 10 μm diameter runt brunnens omkrets. Välj figurfyllningsfärgen vit.
- För ringmönstret ritar du en cirkel med diameter 20 μm, placerar den över brunnen och väljer formen fyllningsfärg vit.
- Rita ett annat cirkelmönster med diameter 10 μm med fyllningsformfärg svart och placera den runt brunnens omkrets.
- Redigera mönstret och ändra formerna baserat på önskad extraheringsmetod. Se till att det önskade mönstret finns inom arbetsområdet för det mönstrade belysningsverktyget.
- Placera provet i en PDMS-hållare och pipetten det definierade mediet ovanpå provet för att förhindra provbrist och tillhandahålla en bärarlösning för utsläppta celler.
- Byt sedan ut den mot kalibreringsspegeln.
- Justera mikroskopfokuset för att få en skarp bild av kolonierna i hydrogelen. Inspektera kolonierna för att identifiera en koloni av intresse.
- Här designar du ljusmönstren medan kameravyn visar kolonierna inuti provet för att testa olika mönster för celluttag.
- Spara det definierade mönstret. När du har sparat det definierade mönstret väljer du avsnittet SessionSkontroll.
- Lägg till den sparade sekvensen under fliken med det mönstrade belysningsverktygets produktnamn.
- När du har lagt till sekvensen väljer du alternativet att simulera mönstret som ska visas och justera för önskad exponeringsplats.
OBS: Provplatsen kan justeras här för att säkerställa att mönstret projiceras exakt på det riktade området. - Justera sedan ljusintensiteten till 60% och exponeringstiden till 40 s under LED-kontrollfliken och starta exponeringsprocessen.
- Övervaka hydrogelnedbrytningen i realtids- och brightfield-läge för att säkerställa cellfrisättning.
OBS: Förhindra förflyttningar av provet under ljusexponering eftersom det kan orsaka nedbrytning av oönskade områden i hydrogelen vilket resulterar i korskontaminering.
10. Cellhämtning
OBS: Cellhämtningsproceduren är identisk för både bulkhydrogeler och mikrobrunnmatriser.
- Efter 365 nm ljusexponering och cellfrisättning, samla cellerna med en mikroliterspruta och mikrofluidisk slang(figur 2).
OBS: Cellhämtning måste göras omedelbart efter mönsterexponering. Detta möjliggör lokaliserad cellåterställning innan de utsläppta cellerna rör sig bort från det bestrålade området. - Byt mikroskop från brightfield till FITC- eller TRITC-filter så att det kan visualisera det exponerade området i provet med blotta ögat.
- När det exponerade området är beläget, placera änden av slangen på den bestrålade platsen. Byt sedan tillbaka mikroskopfiltret till brightfield för att övervaka cellhämtning i realtid.
- Använd sprutan som är fäst vid den andra änden av slangen för att försiktigt dra ut de frigjorda cellerna. Dra tillbaka 200 μL av lösningen och för in lösningen i ett 1,5 ml centrifugrör för DNA-analys eller plätering.
Figur 2: Schematisk representation av extraktionsmetoden för insamling av celler som frigörs från hydrogelen. Här, omedelbart efter 365 nm UV-exponering, hydrogelnedbrytning och cellfrisättning, används mikroskopet för att belysa hydrogelprovet med ljus från ett TRITC-filter, vilket resulterar i en ljusgrön fläck som täcker det område där cellutlösning inträffade. Detta hjälper användaren att identifiera den rumsliga platsen för provsamling. Efter att ha visualiserat detta område placeras uppsamlingsslangar som är fästa vid en mikroliterspruta på denna plats och provet samlas in. Brightfield mikroskopi vid 10x förstoring används för att övervaka änden av slang- och hydrogelytan i realtid för exakt cellsamling. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
11. Genomisk DNA-rening och DNA-kvalitetsmätning
- Använd DNA-reningskit (se Materialtabell) för att extrahera DNA från bakterieisolat.
- Följ tillverkarens specifikation som beskrivs i DNA-reningssatsens handbok23 fram till det sista steget (steg 7), vilket kräver elution med buffert AE.
- För elutionsteget, följ tillverkarens specifikation, med skillnaden att använda 100 μL buffert AE istället för 200 μL.
- Upprepa elution en gång enligt beskrivningen i steg 11.1.2. Detta steg leder till ökad total DNA-avkastning.
- Mät DNA-kvalitet med hjälp av en UV-Vis spektrofotometer (se Tabell över material).
- Slå på spektrofotometern. Efter enhetsinitieringen väljer du alternativet dsDNA på skärmen på startsidan.
- Lyft sedan piedestalarmen och rengör piedestalpositionen med DI-vatten och luddfria våtservetter.
- Pipetter 2 μL av en tom lösning, här AE-buffert, på piedestalpositionen och försiktigt ta ner piedestalarmen och välj Blank på skärmen.
- Lyft sedan piedestalen och rengör piedestalpositionen med DI-vatten för att avlägsna eventuellt restmaterial från föregående mätning.
- Ladda provet (2 μL) på piedestalläget, fäll piedestalarmen och välj knappen Mät på skärmen.
- Gör om steg 11.2.4 och 11.2.5 för alla prover.
- När mätningen är klar väljer du "Avsluta experiment" på skärmen. Sätt in flashenheten i enheten och tryck på "Exportera data" på skärmen.
12. Bestämning av cellens livskraft från hydrogel- och mikrobrunnextrakt
- Späd bakteriesläddarna med en utspädningsfaktor på 105 med en 96-välplatta.
- Pipettering 10 μL av den utspädda bakteriesuspensionen och spot tre gånger på ATGN-plattor för varje bakteriesuspension.
- Luta plattorna för att sprida cellerna på agarytor. Lufttorka ATGN-plattorna som innehåller bakteriesuspensionerna.
- Inkubera plattorna vid 37 °C i 48 timmar. Räkna och registrera siffrorna för kolonibildningsenheter (CFUs). Räkna alla tre spridningarna av bakteriesuspensioner på varje tallrik.
OBS: Utför steg 12.1-12.4 i ett biologiskt säkerhetsskåp för att undvika förorening av plattan.
Representative Results
För att undersöka UV-ljusets förmåga att utlösa kontrollerad hydrogelnedbrytning för cellfrisättning, inkapslades hydrogeler först över tiolated täcken utan bakterier närvarande. Varje hydrogel utsattes för tre replikat cirkel mönster av ljus vid olika intensiteter och exponeringstider. Den procentuella gelnedbrytningen beräknades efter UV-ljusexponering vid varje ljusintensitet, och exponeringstiden kvantifierades sedan genom koppling av hängräde tioolgrupper med ett fluorescein-5-maelimidfärgämne för fluorescensavbildning19,24. Ett representativt exempel på hur dessa två parametrar påverkar hydrogelnedbrytning visas i figur 3. Som uppenbart ger mönstrat ljus från det mönstrade belysningsverktyget rumslig-temporal kontroll av hydrogelnedbrytning vid en upplösning som kan möjliggöra frisättning av endast ett litet antal celler.
Figur 3: Kontroll över nedbrytningen av hydrogeler. UV-ljusdos och resulterande hydrogelnedbrytningshastighet kan inte via det mönstrade belysningsverktyget. (Infälld) Två olika ljusintensiteter valdes för mönstrad hydrogel nedbrytning. Efter 365 nm UV ljus exponering, hydrgels var märkt med fluorescein-5-maleimide för fluorescens imaging. Omtryckt (anpassat) med tillstånd från Fattahi m.fl.19 Copyright 2020 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
För cellutsugning användes olika ljusmönster för att undersöka cellutgivning (figur 4). Här kapslades Agrobacterium-bakterieceller in i bulkhydrogeler över tioolerade glasöverdrag och odlades sedan till mikroskala kolonier. Hydrogeler inspekterades sedan i brightfield mikroskopi, och riktade mikrokolonier utsattes för olika UV-ljusmönster. det observerades att olika exponeringsmönster påverkade morfologin i de utsläppta cellerna. Detta är potentiellt fördelaktigt för olika applikationer. Till exempel, att exponera ett ringmönster runt målkolonin resulterar i frisättningen av hela kolonin som fortfarande är inkapslad i en skyddande PEG-hydrogel och utan direkt UV-ljusexponering(figur 4A), som kan bevara celler och ge enkel rening nedströms. Genom att utsätta hela eller delar av kolonin för UV-ljus kan celler däremot extraheras antingen som aggregerade cellkluster(figur 4B) eller som fria, enskilda celler (figur 4C).
Figur 4: Kontroll över de extraherade cellernas morfologi. (A) Användning av ett ringmönster för att frigöra hela cellkolonin, skyddad i en PEG-matris. b)Användning av ett brutet korsmönster för cellfrisättning i aggregat. c)Användning av ett korsmönster för att frigöra enskilda celler. Omtryckt (anpassat) med tillstånd från Fattahi m.fl.19 Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kritisk i inkapslingsprotokollet är både cellsåddtätheten och tjockleken på hydrogelen, eftersom båda dessa parametrar kan påverka antalet celler som ingår i hydrogelen för observation. För att demonstrera, A. tumefaciens celler prover var inkapslade i hydrogeler av två olika tjocklekar med hjälp av tunna distanser (12,7 μm) eller tjocka distanser (40 μm) odlade och avbildas enligt de etablerade protokollen. Tunnare hydrogeler resulterade i en mikrokolontäthet på 90 kolonier/mm2 i hela hydrogelen, där minimal överlappning av koloni observerades (figur 5A). Hydrogeltjocklekar över 12,7 μm resulterade däremot i bildandet av överlappande kolonier i vertikal riktning (figur 5B), vilket kan leda till utvinning av flera kolonier. Överlappande kolonier kan orsaka korskontaminering under extraktion på grund av ljusmönstrets tvådimensionella karaktär. Till exempel kan en toppkoloni riktas, medan en underliggande koloni också extraheras med den (figur 5C). Därför rekommenderas användning av 12,7 μm distanser för hydrogelberedning.
Figur 5: Hydrogeltjockleken påverkar extraktionsrenhet. (A) Genom att använda distanser med en tjocklek av 12,7 μm för hydrogelbildning bildas kolonier inom ett 10x fokalplan. (B)Överlägg av kolonier kan observeras vid 10x förstoring om distanser med större tjocklekar än 12,7 μm används. c)Korskontaminering kan uppstå med ett överlägg av kolonier under cellutsättning: i) ett ringmönster används för att frigöra en riktad cellkoloni, ii) den riktade cellkolonin lossnar från hydrogelen och iii) en andra underliggande koloni observeras under ljusexponeringen under den riktade kolonin. Denna koloni avlägsnas också, vilket resulterar i korskontaminering. Omtryckt (anpassat) med tillstånd från Fattahi m.fl.19 Copyright 2020 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Med tanke på de potentiella skadorna på bakterier med UV-ljus studerades effekten av olika UV-ljusmikromönster på cellens livskraft ytterligare med hjälp av modell, grampositiva bakterier (B. subtilis) och modell, gramnegativa bakterier (E. coli). Var och en var inkapslad i bulkhydrogeler och odlades i mikroskala kolonier enligt standardprotokoll, verifierar deras kompatibilitet med hydrogelen. Riktade mikrokolonier av motsvarande storlek (26 ± 1 μm diameter) utsattes sedan för en konstant ljusdos (168 mJ/mm2), antingen i form av cirkelmönster som utsätter hela mikrokolonier för UV-ljus eller korsmönster som endast försämrar hydrogelkanter för att minimera ljusexponeringen för celler. Celler återfanns sedan och pläterades för att kvantifiera CFU/ml återhämtade sig från varje koloni. Ingen signifikant skillnad i cellåterställningsnivå hittades (figur 6A). För att ytterligare undersöka renheten hos de extraherade cellerna extraherades DNA från E. coli-prover och analyserades med hjälp av en UV-Vis spektrofotometer. För båda mönstren faller DNA-kvalitetsnivåer inom ett A260/A280-intervall mellan 1,8 och 2,0 (figur 6B), vilket är i det idealiska intervallet för genomisk sekvensering25. Detta visar att de UV-mönster som används för utsläpp under de beskrivna förhållandena har minimal effekt på mängden livskraftiga celler som återvinns från bulkhydrogelerna eller på genomisk DNA-kvalitet efter extraktion.
Figur 6: Inverkan av olika ljusexponeringsmönster på cellens livskraft och DNA-kvalitet hos bakterier som frigörs från bulkhydrogeler. (A) Cellåtervinningsnivåer för både E. coli och B. subtilis efter extraktion med hjälp av korsmönster och cirkelmönster. För detta experiment gjordes extraktion från sfäriska kolonier med samma diameter (26 μm ± 1 μm) för att säkerställa att antalet utsläppta celler från varje koloni var likvärdigt. De extraherade lösningarna pläterades sedan för att beräkna den CFU/ml som förvärvats från varje mönster. Statistisk analys visade ingen signifikant skillnad i CFU/ml som erhållits från kors- och cirkelmönster för både E. coli och B. subtilis (P-värde > 0, 05, n= 6 för båda stammarna). (B)Spektrofotometrisk kvantifiering av DNA-kvalitet för isolerade E. coli-celler med hjälp av kors- och cirkelmönster. Här visade statistisk analys inte någon signifikant skillnad i DNA-kvalitet för de mönster som används (P-värde > 0,05, n = 6) (C) Brightfield-bilder av kolonier med lika diametrar som utsätts för kors- och cirkelmönster. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Microwell-matriser ger ett alternativt lab-on-a-chip-screeninggränssnitt som erbjuder mer kontrollerade screeningfunktioner jämfört med bulkhydrogeler. Till exempel möjliggör mikrobrunnmatriser sådd av bakterier till diskreta odlingsplatser där antalet celler i inokulat kan kontrolleras. Geometriska egenskaper hos mikrobrunn som brunnsdjup och diameter styrs också genom vanliga mikrotillverkningsmetoder. Med dessa fördelar har mikrobrunnar varit användbara för att studera bakterietillväxt under rumslig inneslutning26, och senast för upptäckten av symbiotiska och antagonistiska interaktioner mellan olika bakteriearter när de är begränsade tillsammans på mikroskalan18. Cellulär extraktion från brunnar för genomisk analys såsom 16S amplicon sekvensering är avgörande för dessa applikationer. Med samma hydrogelmaterial kan UV-ljus exponeras över en brunn som innehåller celler av intresse, antingen som cirkel- eller ringmönster. Den senare säkerställer hydrogelnedbrytning endast vid mikrobrunnsomkretsen för att förhindra direkt bestrålning av celler. För att demonstrera detta, A. tumefaciens celler som uttrycker mCherry såddes i brunnar, hydrogelen var sedan fäst vid microwell matrisen. Celler odlades och bestrålades sedan med antingen cirkel- eller ringmönster. Membranet färgades sedan med fluorescein-5-maleimide färgämne. Tvåfärgade fluorescensbilder visade att både membranet och cellerna i brunnarna avlägsnas för båda bestrålningsmönstren17. Till skillnad från bulkhydrogelformatet har celluttag här endast observerats i form av cellkluster18.
Bild 7: Representativa konfokala mikroskopibilder som visar ljusmönsterpåverkan på cellisolering från mikrobrunnmatriser. A)Mikrobrunn med diametrar på 40 μm innehållande bakterier (röda) efter sådd och odling. (B) Ljusexponering med hjälp av cirkel- och ringmönster (blå). (C) Minskad röd fluorescens visar att celler extraheras från bestrålade brunnar. (D) Tvåfärgad fluorescensbild av membran och bakterier efter bestrålning, vilket indikerar avlägsnande av både hydrogelen (grön) och bakterier (röd) från målbrunnarna. (E) Z-stack, tvåfärgad fluorescensbild av målbrunnar. Den röda linjen i (D) betecknar xz-planet som avbildas i (E) och den gröna linjen i (E) betecknar xy-planet som avbildas i (D). Prover i bilder (C-E) tvättades för avlägsnande av släppta celler, sedan fasta och avbildade. Skalstång = 40 μm. Omtryckt (anpassat) med tillstånd från van der Vlies et al.17. Copyright 2019 American Chemical Soceity. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
För att kvantifiera bakterier cell livskraft och DNA-kvalitet efter extraktion i detta format, B. subtilis och E. coli celler såddes, odlades och sedan släpptes från microwell matriser med hjälp av cirkel och ring mönster (figur 8A, B). Utsläppta celler pläterades sedan på ATGN agar plattor, och DNA-kvaliteten på de extraherade cellerna kvantifierades. För att säkerställa att ett konsekvent antal celler var närvarande under varje extraktion, mikrowells med liknande fluorescerande intensiteter (~ 6000 A.U.) och därför ett liknande antal celler riktades för frisättning. Antalet livskraftiga celler som extraherades med hjälp av ett cirkelmönster skilde sig inte nämnvärt från antalet livskraftiga celler som extraherades med ringmönster för någon av bakterierna (figur 8C). Dessutom var DNA-kvalitetsnivån inte signifikant annorlunda mellan cirkeln och ringmönstren för någon av bakterierna (figur 8D). I likhet med resultaten i bulkhydrogeler hade därför tillämpningen av UV-ljus vid den intensitet och varaktighet som anges här en försumbar inverkan på livskraften och DNA-kvaliteten hos celler som extraherats från mikrobrunnmatriserna. Dessa resultat visar att livskraftiga bakterieceller kan selektivt hämtas från mikrobrunnar med minimal skada för nedströms analys.
Figur 8: Inverkan av olika ljusexponeringsmönster på cellens livskraft och DNA-kvalitet hos bakterier som frigörs från mikrobrunnmatriser. (A,B) För både E. coli och B. subtilisanvändes cirkelmönster och ringmönster för celluttag från 10 μm mikrobrunn. Cirkelmönster med en diameter på 10 μm och ringmönster med en innerdiameter på 10 μm och ytterdiameter på 20 μm användes i detta experiment för cellutvinning. Mikrobrunnar med samma diametrar användes för att säkerställa att antalet utsläppta celler från varje mikrobrunn var detsamma. (C) De extraherade lösningarna pläterades sedan för att beräkna den CFU/ml som förvärvats från varje exponeringsmönster. Statistisk analys visade ingen signifikant skillnad i CFU/ml som erhållits från cirkel- och ringmönster för både E. coli och B. subtilis (P-värde > 0, 05, n = 6 för båda stammarna). (D) Spektrofotometri användes för att mäta DNA-kvaliteten hos både E. coli- och B. subtilisceller med hjälp av cirkel- och ringmönster. Här visade statistisk analys ingen signifikant skillnad i DNA-kvalitet för de mönster som används (P-värde > 0,05, n = 6 för båda stammarna). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Utformning och tillverkning av mikrobrunnmatriser. ( A) Standard mikrotillverkningstekniker tillämpades för att tillverka mikrobrunnmatriser på kiselplattor. b)Varje substrat bestod av 7 x 7 matriser med 10 μm diameter brunnar med 20 μm djup och 30 μm tonhöjd. c)Varje matris bestod av 225 mikrobrunn. Denna siffra har ändrats från Barua et al.18. Copyright 2021 Frontiers Media. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Detta manuskript visar användningen av fotodegraderbara hydrogeler för bakteriescreening och isolering. Materialet och tillvägagångssättet möjliggör hög genomströmningskultur, kontroll över tillväxtmedier och tillväxtförhållanden samt ren och exakt cellutvinning på ett enkelt och kostnadseffektivt sätt. Extraktion kräver endast ett fluorescerande mikroskop i kombination med det mönstrade belysningsverktyget och kan göras på ett sekventiellt sätt för att isolera flera cellmål. Varje extraktion tar 5-10 min att utföra, och upp till 30 riktade kolonier har tagits bort från en enda hydrogel. En viktig fördel med tillvägagångssättet är dess anpassningsförmåga till en mängd olika analysformat, vilket visas här med screening från både bulkhydrogeler och mikrobrunnmatriser. Separationsprocessen i båda formaten har framgångsrikt använts för att isolera bakterier som visar unikt tillväxtbeteende för nedströms genotypning efter kultur och mikroskopisk observation, en kritisk förmåga att ansluta cellgenotyp till fenotyp. Hittills har genomiska karakteriseringar av bakterier som extraherats från dessa gränssnitt inkluderat 16S amplicon sekvensering för att identifiera multiartsamlingar av bakterier från miljömikrobiomer som genererar framväxande tillväxtbeteende18, och för helgenomsekvensering för att framgångsrikt identifiera genetiska mutationer som orsakar sällsynta tillväxtprofiler i celler som finns i mutantbibliotek19.
Att använda bulkhydrogeler för cellscreening och isolering är det enklaste och enklaste formatet. Bulk fotodegraderbara hydrogeler bildas snabbt (25 min) efter att ha blandat prekursorerna över genomskinliga glasöverdrag för att kapsla in celler i en 3D-cellskulturmatris som är avbildad med ett standard upprätt eller inverterat fluorescensmikroskop. Metoden har således potential att kunna translationseras till vanliga mikrobiologiska laboratorier som inte har mikrotillverkningsresurser eller expertis. En nackdel med detta format är att celler är slumpmässigt orienterade i hela den tredimensionella hydrogelen. Därför kan celler dyka upp ur fokalplanet när avbildning med högre förstoringsmål och extraktion kan vara svårt om cellkolonier är orienterade för nära varandra eller om det finns ett vertikalt överlägg av kolonier. Att deponera en tunn hydrogel (<13 μm) enligt beskrivningen är avgörande för att mildra denna nackdel. Exponering i trasiga korsljusmönster (figur 4B) är att föredra här, eftersom detta mönster resulterar i celler fria från hydrogelen som har minimal exponering för UV-ljus och lätt kan återvinnas genom plätering.
Däremot ger mikrobrunnsmatrisformatet ett mer välkontrollerat gränssnitt, eftersom bakterieceller är uppdelade i diskreta mikrobrunnar som fungerar som små kultur- eller samkulturplatser17,18,26. Mikrobrunnsdimension, tonhöjd och densitet tillverkas exakt med hjälp av vanliga fotolitografiska tekniker. Jämfört med bulkhydrogeler kan bakterier extraheras från mikrobrunnmatriser med högre grad av specificitet och lägre risk för korskontaminering, eftersom cellerna endast finns på fördefinierade platser, inte slumpmässigt spridda över hela hydrogelen. Koncentrationen och förhållandet mellan bakterieceller i såddlösningen kan också varieras för att kontrollera mängden och sammansättningen av mikrowellinokulat genom en såddprocess som har karakteriserats i tidigare rapporter26, vilket ger användaren flexibilitet i skärmens experimentella design. Den främsta nackdelen med screening med microwell array-formatet är den extra tid och expertis som krävs för mikrotillverkning. Tillverkning av mikrobrunnar beräknades kosta ~ $ 10 per matris, vilket inkluderar materialkostnader och renrumskostnader. Dessutom är mikrobrunnsystem traditionellt gjorda av kisel, vilket kan orsaka bildsvårigheter eftersom substraten är icke-transparenta. Dessutom kan en stor mängd ljusspridning från kiselytan begränsa avbildningen i mikrobrunnarna och kan minska mönsterupplösningen vid hydrogelexponering med UV-ljus från det mönstrade belysningsverktyget (se figur 8A,B). Liknande mikrobrunnar har tillverkats på genomskinliga kvartssubstrat för att ta itu med dessa typer av begränsningar27; Denna tillverkning är dock betydligt svårare. Exponering för ringmönster som belyser brunnens omkrets är att föredra här för att frigöra fria celler från brunnarna samtidigt som UV-exponeringen minimeras.
Det vanligaste problemet som uppstår i båda formaten är avlossning av hydrogelen från det underliggande substratet under odling på grund av hydrogelsvullnad. Om detta är ett problem för bulkhydrogeler, bör förekomsten, densiteten och enhetligheten hos tiolgrupper i kemikalieskiktet (MTPS) över ytan av basglastäcket verifieras med hjälp av en lämplig ytkarakteriseringsteknik (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Låg densitet av ytt tiol grupper på grund av ineffektiva ytan funktionalisering kan leda till en svag interaktion mellan substratet och hydrogelen. Om en låg nivå av ytt tiolation uppstår, bör stabiliteten hos MTPS-lösningen kontrolleras. Vid den första rengöringen av glasrutschbanan bör man vara försiktig med att säkerställa en ren yta före MTPS-behandlingen, och försiktighet bör iakttas för att säkerställa användning av vattenfri toluen under MTPS ytreaktion (protokoll avsnitt 4). När det gäller mikrobrunnmatriser är ytorna inte tiolerade, och hydrogeler fäster istället genom den partiella fyllningen av brunnarna med hydrogelen, som förankrar hydrogelen till kiselsubstratet17. Om hydrogelavlossning är ett problem i detta system kan fler mikrobrunnar eller andra mikroskalefunktioner etsas in i matrisen för att ytterligare förankra hydrogelen på substratet för att främja starkare fastsättning.
En begränsning av tekniken i båda formaten är hydrogelernas begränsade stabilitet i närvaro av bakterier. Det har noterats att vissa bakterier, såsom A. tumefaciens, kan bryta ner hydrogelen under loppet av 5-7 dagar17,19, vilket begränsar experimenttiden. Pågående undersökning av mekanismerna för bakteriell nedbrytning pågår. det är en hypotes att de estergrupper som finns från diacrylatemonomererna utsätts för bakteriemedierad hydrolys och/eller enzymatisk nedbrytning, som noterats i andra system17. Att utveckla mer stabila hydrogelkemier kommer att förlänga den tid som bakterier kan finnas kvar i hydrogelen och kommer att utöka skärmen till mikroorganismer med långsammare tillväxttakt. En andra begränsning är att cellåtervinning och extraktion sker i båda formaten i en öppen miljö, vilket resulterar i relativt höga extraktionsvolymer (30-100 μL), som kan vara mottagliga för yttre förorening. Därför måste man se till att det finns tillräckligt med celler från målkolonierna samtidigt som extraktionslösningens volym minimeras. För att erhålla tillräckligt med celler för plätering och återvinning eller för extraktion av DNA-material observerades att i bulkhydrogeler måste cellerna odlas tillräckligt länge för att nå kolonidiametrar på minst 10 μm. För att sänka den erforderliga volymen för celluttag observerades det att användningen av en mikroliterspruta och slangar(figur 2) var effektivare än pipettering. Slangen gjorde det möjligt att dra isolaten från utsläppspunkten mer exakt, vilket krävde mindre lösningsvolym och minskade risken för förorening.
Framtida arbete innebär att förstå effekten av hydrogelmekaniska egenskaper på celltillväxt, eftersom mekaniska egenskaper hos dessa hydrogeler styrs väl av valet av lämpliga PEG-baserade monomerprekursorer av olika molekylvikter28, och mekaniska interaktioner spelar sannolikt en viktig roll i bakteriebeteende29. Eftersom hydrogelmaterialen lätt kan införlivas i en mängd olika system och enheter, är vidareutveckling också inriktad på integrering av detta material i mikrofluidiska system. Detta skulle minska extraktionslösningen till femtoliter till picolitervolymer, jämfört med traditionella 30-100 μL-volymer som för närvarande krävs i open collection-format. Mindre lösningsvolymer skulle kraftigt minska potentiell förorening och flytta tillvägagångssättet mot encellsisolering och karakterisering.
Disclosures
RRH och AJV har lämnat in ett patent på denna teknik. De återstående författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av NSF CAREER Award #1944791.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
| Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
| Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
| Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
| Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
| Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
| Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
| D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
| DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
| DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
| Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
| Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
| Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
| Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
| Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
| Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
| Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
| Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
| Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
| Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
| Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
| Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
| Super Nuova Digital Hot Plate Stirrer | Thermo Scientific | S131825 | |
| Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |
References
- Welch, J. D., et al. Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).
- Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries. Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).
- Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).
- Nichols, D., et al. Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 8, 580 (2017).
- Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition. Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006 (2013).
- Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Poonlapdecha, W., et al. Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples. International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).
- Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).
- Blainey, P. C. The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).
- Shrirao, A. B., et al. Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification. Technology. 06 (01), 1-23 (2018).
- Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -M. Microfluidics and microbial engineering. Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).
- Kehe, J., et al. Massively parallel screening of synthetic microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels. Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes. ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).
- Barua, N., et al. Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays. Frontiers in Microbiology. 11, 3361 (2021).
- Fattahi, N., et al. Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes. Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).
- Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).
- Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562 (2018).
- Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701 (2017).
- DNeasy Blood & Tissue Handbook - QIAGEN. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&lang=en (2021).
- Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
- Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism. Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28 (2018).
- Hansen, R. H., et al. Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development. PLoS One. 11 (5), 0155080 (2016).
- Halsted, M., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).
- Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160 (2013).
- Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. Mechanical interactions between bacteria and hydrogels. Scientific Reports. 8 (1), 10893 (2018).
