Summary

En enkel och effektiv metod för att konsekvent isolera muskardiomyocyter

Published: November 11, 2022
doi:

Summary

Guldstandarden inom kardiologi för cellulära och molekylära funktionella experiment är kardiomyocyter. Denna artikel beskriver anpassningar till icke-Langendorff-tekniken för att isolera muskardiomyocyter.

Abstract

Behovet av reproducerbara men tekniskt enkla metoder som ger kardiomyocyter av hög kvalitet är avgörande för forskning inom hjärtbiologi. Cellulära och molekylära funktionella experiment (t.ex. kontraktion, elektrofysiologi, kalciumcykling, etc.) på kardiomyocyter är guldstandarden för att fastställa sjukdomsmekanism(er). Musen är den art som valts för funktionella experiment och den beskrivna tekniken är specifikt för isolering av muskardiomyocyter. Tidigare metoder som kräver en Langendorff-apparat kräver hög grad av träning och precision för aortakannulation, vilket ofta resulterar i ischemi. Fältet skiftar mot Langendorff-fria isoleringsmetoder som är enkla, reproducerbara och ger livskraftiga myocyter för fysiologisk datainsamling och odling. Dessa metoder minskar kraftigt ischemitiden jämfört med aortakanylering och resulterar i tillförlitligt erhållna kardiomyocyter. Vår anpassning till den Langendorff-fria metoden inkluderar en initial perfusion med iskall rensningslösning, användning av en stabiliseringsplattform som säkerställer en stadig nål under perfusion och ytterligare matsmältningssteg för att säkerställa tillförlitligt erhållna kardiomyocyter för användning i funktionella mätningar och odling. Denna metod är enkel och snabb att utföra och kräver liten teknisk skicklighet.

Introduction

I årtionden är en viktig idé i hjärtbiologisk litteratur den molekylära verkningsmekanismen. Verkningsmekanismen måste fastställas för att tillförlitliga studier ska kunna publiceras. En väletablerad strategi för att bestämma molekylär mekanism är isolerade kardiomyocytstudier, som kräver högkvalitativa kardiomyocyter för att uppnå tillförlitliga data. Cellulära och molekylära experiment som utförs på kardiomyocyter för att bestämma verkningsmekanismen är guldstandarden för att undersöka sammandragning1, elektrofysiologi2, kalcium (Ca 2+) cykling3, myofilament Ca2+ känslighet4, cytoskelett5, metabolism6, effekter av hormoner7, signalmolekyler8, läkemedelsstudier9 etc. Musen har blivit den art som valts för de flesta hjärtbiologiska experiment på grund av enkel genetisk manipulation, dess lilla storlek, dess relativt korta livslängd, låga kostnad etc10. Den tillförlitliga isoleringen av högkvalitativa muskardiomyocyter är emellertid inte trivial med nuvarande tekniker.

Labs har isolerat kardiomyocyter i nästan 70 år11. Praktiskt taget alla tekniker för att isolera kardiomyocyter är beroende av matsmältningen av hjärtat via olika enzymer (kollagenas, proteas, trypsin, etc.). Under de tidiga perioderna (1950-1960-talet) användes segmentmetoden, som innebar att hjärtat avlägsnades, skars i mycket mindre bitar och inkuberades i lösning med kollagenas / proteas / trypsin12. På 1970-talet implementerade laboratorier den förbättrade “Langendorff” -metoden13, som isolerade kardiomyocyter med hjälp av en kranskärlsperfusionsbaserad isoleringsteknik (retrograd perfusion med enzym via Langendorff-apparaten); Denna teknik är fortfarande den dominerande metoden för myocytisolering i fältet idag, ~ 50 år senare14,15,16. Det senaste arbetet har övergått till kanylering av hjärtat in vivo för att begränsa hypoxitiden och ischemisk skada, vilket resulterar i överlägsen kardiomyocytisolering (bättre avkastning och högre kvalitet)17. Nyligen har detta utvecklats till att utföra in vivo, Langendorff-fria hjärtperfusioner 18,19,20,21,22. Vi har utvecklat den Langendorff-fria kardiomyocytisoleringstekniken baserad på Ackers-Johnson et al.18-tekniken och anpassat olika komponenter från de många tidigare isoleringsteknikerna. Dessa viktiga anpassningar inkluderar injektion av en iskall rensningsbuffert och införlivandet av en stödjande plattform för att stabilisera nålen, vilket möjliggör minskad manipulation av hjärtat. I denna teknik beskrivs också temperaturkontroll av injicerade buffertar (37 °C), vilket minskade tiden mellan in vivo-injektion och matsmältning på grund av mindre EDTA-perfusion som tidigare publicerats18. Genom att minska manipulationen av hjärtat och därmed minimera punkteringsställets storlek erhålls grundlig och konstant perfusion av kranskärlen. Vi förfinade också tekniken med en sekundär bitmetod digestion, mängden EDTA i den injicerade clearingbufferten och ändrade pH. Vår beskrivna teknik är mer tillförlitlig, effektivare och kräver inte omfattande utbildning/övning jämfört med användning av Langendorff-apparaten (tabell 1).

Protocol

Alla procedurer som utfördes i denna studie godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Ohio State University i enlighet med NIH-riktlinjerna. 1. Beredning av lösning Anmärkning: Se tabell 2 för buffertkoncentrationer. Förisolering (upp till 2 veckor före myocytisolering)Perfusionsbuffertbas: Bered 1 liter perfusionsbuffertbas (NaCl, KCl, NaH2PO4, HEPES, glukos och BDM) i 1 liter …

Representative Results

Det finns några faktorer att undersöka när man bestämmer framgången för en isolering. Först måste kardiomyocyterna vara stavformade utan membranfläckar, såsom cellerna isolerade i figur 1. En typisk isolering kommer att ge ~ 80% av myocyterna som stavformade. Om isoleringen ger något mindre än 50% stavformade celler, anses det vara en misslyckad isolering och kardiomyocyter används inte. Slutligen bör kardiomyocyterna vara lugna. Spontant sammandragande myocyter visar Ca2 + int…

Discussion

Den främsta fördelen med vår Langendorff-fria kardiomyocytisoleringsteknik är att den begränsar hypoxi och ischemisk tid genom att inte kräva kanylering till en Langendorff-apparat. Alternativt till klassiska Langendorff-tekniker som tar flera minuter att ta bort, rengöra och hänga hjärtat, vilket ofta resulterar i ischemisk skada på myocyten, inkluderar vår metod en in vivo-rensning av blod via en iskall clearinglösning. Den iskalla rensningsbufferten innehåller etylendiamintetraättiksyra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) och T32 HL134616 (Sturgill och Salyer).

Materials

10 cc Bd Luer-Lok Syringe Fisher Sci 14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker Cole-Palmer UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle DWK Life Sciences UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap Fisher Sci 14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime Sigma B0753 >98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe Fisher Sci 14-823-435
35 mm glass bottom dishes MatTek Corporation P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle Fisher Sci 13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes Cole-Palmer EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad Fisher Sci 14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles Becton Dickinson 305109
Bovine Serum Albumin Sigma A3803 Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate Sigma C7902 >99%
D-(+)-Glucose Sigma G7021 Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM Fisher Sci 11965092
EDTA Fisher Sci AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish Corning 353003
FBS R&D Systems (Bio-techne) S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators Fisher Sci 13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments 15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set Fisher Sci 02-671-11
HEPES Sigma H4034 >99.5%
Labeling Tape Fisher Sci 15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump kdScientific 788100
L-glutathione Fisher Sci ICN19467980
Liberase TH Research Grade Sigma 5401135001 High thermolysin concentration
M199 Fisher Sci MT10060CV
Magnesium Chloride Invitrogen AM9530G
Mouse Laminin Corning 354232
Pen/Strep Fisher Sci
Potassium Chloride Sigma P5405 >99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath ThermoFisher Scientific TSCIR19
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Suitable for cell culture
Sodium Chloride Sigma S5886 >99%
Sodium phosphate monobasic Sigma S5011 >99%
Sterile Cell Strainer 70 µm Fisher Sci 22-363-548
Student Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11
VWR Absorbent Underpads Fisher Sci NC9481815

References

  1. Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
  2. Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
  3. Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).
  4. Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
  5. Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
  6. Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
  7. Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
  8. Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3′-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
  9. Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).
  10. Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  11. Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
  12. Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
  13. Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
  14. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
  15. Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
  16. Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
  20. Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).
  21. Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
  22. Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).
  23. Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).
  24. Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
  25. Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
  26. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).

Play Video

Cite This Article
Sturgill, S. L., Salyer, L. G., Biesiadecki, B. J., Ziolo, M. T. A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (189), e63056, doi:10.3791/63056 (2022).

View Video