Guldstandarden inom kardiologi för cellulära och molekylära funktionella experiment är kardiomyocyter. Denna artikel beskriver anpassningar till icke-Langendorff-tekniken för att isolera muskardiomyocyter.
Behovet av reproducerbara men tekniskt enkla metoder som ger kardiomyocyter av hög kvalitet är avgörande för forskning inom hjärtbiologi. Cellulära och molekylära funktionella experiment (t.ex. kontraktion, elektrofysiologi, kalciumcykling, etc.) på kardiomyocyter är guldstandarden för att fastställa sjukdomsmekanism(er). Musen är den art som valts för funktionella experiment och den beskrivna tekniken är specifikt för isolering av muskardiomyocyter. Tidigare metoder som kräver en Langendorff-apparat kräver hög grad av träning och precision för aortakannulation, vilket ofta resulterar i ischemi. Fältet skiftar mot Langendorff-fria isoleringsmetoder som är enkla, reproducerbara och ger livskraftiga myocyter för fysiologisk datainsamling och odling. Dessa metoder minskar kraftigt ischemitiden jämfört med aortakanylering och resulterar i tillförlitligt erhållna kardiomyocyter. Vår anpassning till den Langendorff-fria metoden inkluderar en initial perfusion med iskall rensningslösning, användning av en stabiliseringsplattform som säkerställer en stadig nål under perfusion och ytterligare matsmältningssteg för att säkerställa tillförlitligt erhållna kardiomyocyter för användning i funktionella mätningar och odling. Denna metod är enkel och snabb att utföra och kräver liten teknisk skicklighet.
I årtionden är en viktig idé i hjärtbiologisk litteratur den molekylära verkningsmekanismen. Verkningsmekanismen måste fastställas för att tillförlitliga studier ska kunna publiceras. En väletablerad strategi för att bestämma molekylär mekanism är isolerade kardiomyocytstudier, som kräver högkvalitativa kardiomyocyter för att uppnå tillförlitliga data. Cellulära och molekylära experiment som utförs på kardiomyocyter för att bestämma verkningsmekanismen är guldstandarden för att undersöka sammandragning1, elektrofysiologi2, kalcium (Ca 2+) cykling3, myofilament Ca2+ känslighet4, cytoskelett5, metabolism6, effekter av hormoner7, signalmolekyler8, läkemedelsstudier9 etc. Musen har blivit den art som valts för de flesta hjärtbiologiska experiment på grund av enkel genetisk manipulation, dess lilla storlek, dess relativt korta livslängd, låga kostnad etc10. Den tillförlitliga isoleringen av högkvalitativa muskardiomyocyter är emellertid inte trivial med nuvarande tekniker.
Labs har isolerat kardiomyocyter i nästan 70 år11. Praktiskt taget alla tekniker för att isolera kardiomyocyter är beroende av matsmältningen av hjärtat via olika enzymer (kollagenas, proteas, trypsin, etc.). Under de tidiga perioderna (1950-1960-talet) användes segmentmetoden, som innebar att hjärtat avlägsnades, skars i mycket mindre bitar och inkuberades i lösning med kollagenas / proteas / trypsin12. På 1970-talet implementerade laboratorier den förbättrade “Langendorff” -metoden13, som isolerade kardiomyocyter med hjälp av en kranskärlsperfusionsbaserad isoleringsteknik (retrograd perfusion med enzym via Langendorff-apparaten); Denna teknik är fortfarande den dominerande metoden för myocytisolering i fältet idag, ~ 50 år senare14,15,16. Det senaste arbetet har övergått till kanylering av hjärtat in vivo för att begränsa hypoxitiden och ischemisk skada, vilket resulterar i överlägsen kardiomyocytisolering (bättre avkastning och högre kvalitet)17. Nyligen har detta utvecklats till att utföra in vivo, Langendorff-fria hjärtperfusioner 18,19,20,21,22. Vi har utvecklat den Langendorff-fria kardiomyocytisoleringstekniken baserad på Ackers-Johnson et al.18-tekniken och anpassat olika komponenter från de många tidigare isoleringsteknikerna. Dessa viktiga anpassningar inkluderar injektion av en iskall rensningsbuffert och införlivandet av en stödjande plattform för att stabilisera nålen, vilket möjliggör minskad manipulation av hjärtat. I denna teknik beskrivs också temperaturkontroll av injicerade buffertar (37 °C), vilket minskade tiden mellan in vivo-injektion och matsmältning på grund av mindre EDTA-perfusion som tidigare publicerats18. Genom att minska manipulationen av hjärtat och därmed minimera punkteringsställets storlek erhålls grundlig och konstant perfusion av kranskärlen. Vi förfinade också tekniken med en sekundär bitmetod digestion, mängden EDTA i den injicerade clearingbufferten och ändrade pH. Vår beskrivna teknik är mer tillförlitlig, effektivare och kräver inte omfattande utbildning/övning jämfört med användning av Langendorff-apparaten (tabell 1).
Den främsta fördelen med vår Langendorff-fria kardiomyocytisoleringsteknik är att den begränsar hypoxi och ischemisk tid genom att inte kräva kanylering till en Langendorff-apparat. Alternativt till klassiska Langendorff-tekniker som tar flera minuter att ta bort, rengöra och hänga hjärtat, vilket ofta resulterar i ischemisk skada på myocyten, inkluderar vår metod en in vivo-rensning av blod via en iskall clearinglösning. Den iskalla rensningsbufferten innehåller etylendiamintetraättiksyra…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) och T32 HL134616 (Sturgill och Salyer).
10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
95% O2 5% CO2 | |||
AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
Pen/Strep | Fisher Sci | ||
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |