Summary

Paramagnetisk avslappningsförbättring för att upptäcka och karakterisera självassociationer av inneboende oordnade proteiner

Published: September 23, 2021
doi:

Summary

Ett protokoll för tillämpning av paramagnetisk relaxation enhancement NMR-spektroskopi för att detektera svaga och övergående inter- och intramolekylära interaktioner i inneboende oordnade proteiner presenteras.

Abstract

Inneboende oordnade proteiner och inneboende oordnade regioner inom proteiner utgör en stor och funktionellt signifikant del av det mänskliga proteomet. Den mycket flexibla karaktären hos dessa sekvenser gör att de kan bilda svaga, långväga och övergående interaktioner med olika biomolekylära partners. Specifika interaktioner med men ändå låg affinitet främjar promiskuös bindning och gör det möjligt för ett enda inneboende oordnat segment att interagera med en mängd målplatser. På grund av den övergående karaktären hos dessa interaktioner kan de vara svåra att karakterisera med strukturbiologiska metoder som förlitar sig på proteiner för att bilda en enda, dominerande konformation. Paramagnetisk avslappningsförbättring NMR är ett användbart verktyg för att identifiera och definiera den strukturella grunden för svaga och övergående interaktioner. Ett detaljerat protokoll för att använda paramagnetisk avslappningsförbättring för att karakterisera de lågbefolkade möteskomplexen som bildas mellan inneboende oordnade proteiner och deras protein, nukleinsyra eller andra biomolekylära partners beskrivs.

Introduction

Intrinsic disorder (ID) beskriver proteiner (IDP) eller regioner inom proteiner (IDR) som inte spontant veckas i stabila sekundära eller tertiära strukturer men är biologiskt aktiva. I allmänhet är IDP/IDR:s funktion att underlätta specifika men reversibla interaktioner med biomolekyler vid fysiologiska förhållanden1. Således är IDP och IDR involverade i en rad cellulära funktioner, inklusive rekrytering, organisation och stabilisering av multiproteinkomplex, till exempel montering och aktivitet av spliceosome2, rekrytering och organisering av komponenter på platser för DNA-skada3, organisation och stabilisering av rekryteringen av transkriptionskomplex4 eller av kromatinremodelern BAF5. Dessutom finns internflyktingar vid signalering av nexuses där deras promiskuitet för olika bindningspartners gör det möjligt för dem att förmedla informationsöverföring via cellulära proteinnätverk6. Nyligen utfört arbete har också avslöjat en benägenhet för IDR-regioner att självassociera bildande biomolekylära kondensat genom processen med vätske-vätskefasseparation7. Många av de ovan nämnda funktionerna som involverar ID anses nu också involvera någon aspekt av kondensatbildning8. Trots betydelsen av ID för biomolekylär komplex montering, stabilisering, byggnadsställningar och signaltransduktion är de atomära detaljerna för deras specifika interaktioner svåra att identifiera eftersom IDP och IDR vanligtvis inte är mottagliga för strukturella undersökningar med röntgenkristallografi eller kryogen elektronmikroskopi.

Kärnmagnetisk resonans (NMR) är en idealisk teknik för att undersöka ID eftersom den inte är beroende av närvaron av styva eller homogena strukturella ensembler utan rapporterar om den omedelbara lokala miljön hos enskilda kärnor. Resonansfrekvensen, eller kemisk förskjutning, av en kärna i en given molekyl påverkas av svaga magnetfält inducerade av den lokala elektroniska distributionen, som i sin tur är beroende av bindningslängder, vinklar, närhet till andra kärnor, interaktioner med bindningspartners och andra faktorer9. Således fungerar varje kärna som en unik, platsspecifik strukturell sond som är känslig för förändringar i sin lokala kemiska miljö. Trots dessa fördelar är NMR en bulkteknik, och den observerade kemiska förskjutningen är genomsnittet av alla miljöer som provtas av en viss kärna. En rad NMR-tekniker, av vilka många beskrivs i detta nummer, har utvecklats för att återvinna strukturell, dynamisk och kinetisk information om högenergi, lågbefolkade biomolekylära konformationer som ingår i det genomsnittliga kemiska skiftet10,11. Även om de är tillfälligt befolkade är identifiering och kvantifiering av dessa tillstånd viktiga för att bestämma detaljerna i funktionella mekanismer12. Till exempel, när det gäller internflyktingar och fördjupade granskningar, kan konformationsensemblen vara partisk för att företrädesvis provkonformationer som är produktiva för bildandet av möteskomplex med fysiologiska bindningspartners. Detektion av dessa tillstånd, liksom identifiering av restspecifika inter- och intramolekylära interaktioner och dynamik, är viktiga för att bestämma de underliggande strukturella mekanismerna för proteinfunktion och komplex bildning.

Ett protokoll för att använda paramagnetisk relaxation enhancement (PRE) NMR för att undersöka övergående, lågbefolkade tillstånd som är viktiga för bildandet av IDP/IDR-medierade biomolekylära komplex beskrivs13. Detta tillvägagångssätt är användbart för att studera de övergående protein-proteininteraktionerna, såsom de som främjar sammansättningen av amyloidfibriller från α-synuklein 14,15 eller självföreningen av FUS16, samt för att karakterisera specifika protein-proteininteraktioner såsom mellan signalproteiner17. Ett exempel på en självassocierande IDP presenteras, där specifika inter- och intramolekylära interaktioner resulterar i företrädesvis komprimerade tillstånd samt platsspecifika interaktioner som driver självassociation.

PRE uppstår från den magnetiska dipolära interaktionen mellan en kärna och ett paramagnetiskt centrum med en isotrop g-tensor, vanligen levererad i form av en oparad elektron på en nitroxidgrupp eller som en paramagnetisk metallatom18 (figur 1). Medan atomer med anisotropa g-tensorer också ger en PRE-effekt, är analys av dessa system svårare på grund av förvirrande effekter som bidrar med pseudokontaktskift (PCS) eller kvarvarande dipolkoppling (RDC)13,19. Styrkan hos interaktionen mellan en kärna och det paramagnetiska centrumet är beroende av <r-6> avståndet mellan de två. Denna interaktion resulterar i en ökning av kärnavslappningshastigheter, vilket orsakar detekterbar linjebreddning även för långväga interaktioner (~ 10-35 Å), eftersom det magnetiska momentet för den oparade elektronen är så starkt20,21. Påvisande av övergående tillstånd med försäkrat värde är möjligt om följande två villkor är uppfyllda: (1) den transienta interaktionen är i snabbt utbyte på NMR-tidsskalan (observerad kemisk förskjutning är ett populationsviktat genomsnitt av utbytestillstånden); och (2) avståndet mellan kärnor och paramagnetiskt centrum är kortare i det tillfälligt befolkade tillståndet än i huvudtillståndet11. Den tvärgående PRE betecknas Γ2 och beräknas för praktiska ändamål utifrån skillnaden i 1H tvärgående avslappningshastigheter mellan ett prov innehållande ett paramagnetiskt centrum och en diamagnetisk styrning. För en fördjupad behandling av teorin om PRE och relaterade pseudokontaktförskjutningar i snabba och långsamma utbytesregimer hänvisas läsaren till de omfattande recensionerna av Clore och medarbetare13,22. Här beaktas endast situationen där 1H N-Γ2 är i den snabba utbytesregimen, där på grund av PR: s r-6-beroende är den observerade avkopplingshastigheten relaterad till både avståndet till vilket det paramagnetiska centrumet närmar sig kärnan såväl som den tid den spenderar i den konformationen. Därför ger transienta konformationer som inte involverar ett nära tillvägagångssätt en liten PRE medan närmare interaktioner, även om de är kortlivade, kommer att producera en större PRE.

För internflyktingar används PRE för att mäta och differentiera de interaktioner som sker inom en enda molekyl (intramolekylär) och mellan separata molekyler (intermolekylär). Genom att fästa ett paramagnetiskt centrum på ett NMR-synligt (t.ex. 15N-märkt) eller NMR-osynligt (t.ex. naturligt överflöd 14N) protein kan källan (inter- eller intramolekylär) för PRE bestämmas (figur 2). Platsriktad mutagenes som introducerar en cysteinrest är ett bekvämt tillvägagångssätt för att fästa ett paramagnetiskt centrum (spin-label) till ett protein23. Flera typer av molekyler har föreslagits för användning som spinnetiketter, inklusive metallkelaterande (EDTA-baserad) och fri radikal (nitroxidbaserad)24. Olika nitroxidspinnetiketter har beskrivits och finns med olika cysteinreaktiva kemier såsom metantisulfonat, maleimid, och jodacetamid25,26 (figur 1). Taggens eller länkarens inneboende flexibilitet kan vara problematisk för vissa analyser, och i dessa situationer har olika strategier föreslagits för att begränsa taggens rörelse, t.ex. genom att lägga till skrymmande kemiska grupper eller använda en andra länkare för att förankra taggen i proteinet (två platsfästen)27. 28. Dessutom kan kommersiellt tillgängliga taggar innehålla diastereomera proteiner, men i allmänhet bidrar detta inte till den observerade PRE29. Användningen av 3-maleimido-PROXYL bunden till ett fritt cystein via maleimidkemi beskrivs eftersom det är lättillgängligt, kostnadseffektivt, icke-reversibelt och reduktionsmedlet tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) kan bibehållas i lösningen under hela märkningsreaktionen. Eftersom 3-Maleimido-PROXYL har en isotrop g-tensor induceras inga PCS eller RDC, och samma kemiska skiftuppdrag kan användas för både paramagnetiska och diamagnetiska prover13.

1HN-T 2 mäts med hjälp av en tvåpunktsstrategi (T a, Tb) som tidigare har visat sig vara lika exakt som att samla in en fullständig evolutionsserie bestående av 8 till 12 tidpunkter30. Den första tidpunkten (T a) sätts så nära noll som praktiskt möjligt, och den optimala längden på den andra tidpunkten är beroende av storleken på den största förväntade PRE för ett givet prov och kan uppskattas från: Tb ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) där R 2,dia representerar R 2 i det diamagnetiska provet13. Om storleken på de största PRE: erna är okänd är inställning av T b till ~ en gånger 1H T 2 av proteinet en bra initial uppskattning och optimeras ytterligare genom att justera T2 för att förbättra signalen till brus. Denna tvåpunktsmätstrategi minskar avsevärt den experimentella tiden som krävs för att mäta PRE och ger tid för mer signalmedelvärde, särskilt eftersom relativt utspädda prover används för att minimera effekterna av icke-specifika kontakter mellan molekyler. En HSQC-baserad pulssekvens används för att mäta 1H N-T2 och har beskrivits i detaljnågon annanstans 30. För förbättrad känslighet kan de hårda pulserna för de främre och bakre olämpliga överföringarna ersättas med formade pulser. alternativt konverteras sekvensen lätt till en TROSY-baserad avläsning31. Eftersom internflyktingar vanligtvis har mycket längre tvärgående avslappningshastigheter som resulterar i smalare linjebredder (på grund av den inneboende störningen) än globulära proteiner av liknande storlek, kan långa förvärvstider i den indirekta dimensionen användas för att förbättra spektralupplösningen och lindra den kemiska skiftdispersionsbegränsningen som är inneboende för internflyktingar.

PRE är ett användbart verktyg för att studera protein-protein och protein-nukleinsyrainteraktioner, särskilt interaktioner som är övergående eller lågt befolkade. Ett detaljerat protokoll för beredning av ett NMR-prov som är lämpligt för mätning av PRE, inklusive steg för proteinrening, platsstyrd spinnmärkning, inställning och kalibrering av pulsprogrammet, bearbetning och tolkning av NMR-data, tillhandahålls. Viktiga experimentella överväganden noteras genomgående som kan påverka datakvalitet och experimentella resultat, inklusive provkoncentration, val av spin-etikett och avlägsnande av paramagnetiska komponenter.

Protocol

Allmänna krav för protokollet: proteinreningsanläggningar, UV-Vis-spektrometer, NMR-spektrometer med högt fält och operativsystem, programvara för efterbehandlingsanalys inklusive; NMRPipe32, Sparky 33, (eller CCPN-analys34 eller NMRViewJ35). 1. Rekombinant uttryck och rening av ett protein för PRE-mätningar Designa en uttryckskonstruktion för proteinet av intresse så att det fin…

Representative Results

Intramolekylära 1H N-Γ2 PREs registrerades på ett självassocierande, inneboende oordnat fragment (rester 171-264) härrörande från lågkomplexitetsdomänen för det RNA-bindande proteinet EWSR142 (figur 3). Resthalter i sekventiell närhet till fästpunkten för spinnetiketter (t.ex. rest 178 eller 260 i figur 3) förväntas breddas avsevärt och kan inte detekteras i spektrumet. Rester som …

Discussion

En metod för att karakterisera övergående interaktioner som finns vid låga populationer mellan inneboende oordnade proteiner och olika bindningspartners med hjälp av PRE har presenterats. I det visade exemplet är proteinet självassocierande och därför kan PRE uppstå genom en kombination av inter- och intramolekylära interaktioner. Denna metod utvidgas lätt till heterogena prover där interaktionerna mellan två olika proteiner kan karakteriseras. Kompletterande information om hur olika regioner av proteinet i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Drs. Jinfa Ying och Kristin Cano för hjälpsamma diskussioner och teknisk hjälp. DSL är en St. Baldrick’s Scholar och erkänner stödet från St. Baldrick’s Foundation (634706). Detta arbete stöddes delvis av Welch Foundation (AQ-2001-20190330) till DSL, Max och Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant till DSL), UTHSA Start-Up Funds till DSL och ett Greehey Graduate Fellowship in Children’s Health till CNJ. Detta arbete bygger på forskning som bedrivs i strukturbiologins kärnfaciliteter, en del av de institutionella forskningskärnorna vid University of Texas Health Science Center i San Antonio med stöd av kontoret för vice president för forskning och Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Materials

0.45 µm and 0.22 µm syringe filters Millipore Sigma SLHVM33RS
SLGVR33RS
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.
100 mm Petri Dish Fisher FB0875713 Agar plates for bacterial transformation.
14N Ammonium chloride Sigma Aldrich 576794 Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
15N Ammonium chloride Sigma Aldrich 299251 Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
3 L Fernbach baffled flask Corning 431523 Bacterial expression culture
3-Maleimido-Proxyl Sigma Aldrich 253375 Nitroxide spin label
50 mL conical centrifuge tubes Thermo Fisher 14-432-22 Solution/protein storage
Amicon centrifugal filter Millipore Sigma UFC900308 Protein concentration
Ampicillan Sigma Aldrich A5354 Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid
Analytical balance Oahus 30061978 Explorer Pro, for weighing reagents
Ascorbic acid Sigma Aldrich AX1775 Reduces nitroxide spin label
Autoclave Sterilize glassware and culture media
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901 M9 media component
Centrifuge bottles Thermo Fisher 010-1459 Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Centrifuge, hand-crank Thomas Scientific 0241C68 Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes
Chelex 100 Sigma Aldrich C7901 Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions
Computer workstation Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky
Deuterium oxide Sigma Aldrich 151882 Needed for NMR lock signal
Dextrose Sigma Aldrich D9434 M9 media component
Dibasic Sodium Phosphate Sigma Aldrich S5136 M9 media component
Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) Thermo Fisher 22582 Quantification of free cystiene residues
High speed centrifuge tubes Thermo Fisher 3114-0050 Used to clear bacterial lysate.
High-field NMR instrument (600 – 800 MHz) Bruker Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control
IMAC column, HisTrap FF Cytvia 17528601 Initial fractionation of crude bacterial lysate
Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) Sigma Aldrich I6758 Induces protein expression for genes under control of lac operator
LB agar Thermo Fisher 22700025 Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.
LB broth Thermo Fisher 12780052
Low-pressure chromatography system Bio-Rad 7318300 BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns
Magnesium sulfate Sigma Aldrich M7506 M9 media component
Medium pressure chromatography system Bio-Rad 7880007 BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector
MEM vitamin solution Sigma Aldrich M6895 M9 media component
Microfluidizer Avestin EmulsiFlex-C3 Provides rapid and efficient bacterial cell lysis
Micropipettes Thermo Fisher Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)
Monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich 1551139 M9 media component
NMR pipettes Sigma Aldrich 255688 To remove sample from NMR tube
NMR sample tube NewEra NE-SL5 Suitable for high-field NMR spectrometers
Preparative Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-HC Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Round bottom polystyrene centrifuge tubes Corning 352057 Clear bacterial lysate
Shaking incubator Eppendorf S44I200005 Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886 M9 media component
Sonicating water bath and vacuum source Thomas Scientific Used to degas buffer solutions
Sonicator Thermo Fisher FB505110 Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA
Spectrophotometer Implen OD600 Diluphotometer Monitor growth of E.coli protein expression cultures
Superdex 200 16/600 size exculsion colum Cytvia 28989333 Final protein purification step
Topspin software, version 3.2 or later Bruker Operating software for the NMR instrument
Transformation competent E. coli cells Thermo Fisher C600003 One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ThermoFisher 20490 Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations
UV-Vis spectrophotometer Implen NP80 Measure protein concentration.
Water bath, temperature controlled ThermoFisher FSGPD25 For heat shock step of bacterial transformation
Yeast extract Sigma Aldrich Y1625 For supplementing M9 media if required

References

  1. Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
  2. Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology. 8 (8), 1002641 (2012).
  3. Frege, T., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteins in the nucleus of human cells. Biochemistry and Biophysics Reports. 1, 33-51 (2015).
  4. Liu, J., et al. Intrinsic disorder in transcription factors. Biochemistry. 45 (22), 6873-6888 (2006).
  5. El Hadidy, N., Uversky, V. N. Intrinsic disorder of the BAF complex: Roles in chromatin remodeling and disease development. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), (2019).
  6. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (1), 18-29 (2015).
  7. Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
  8. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  9. Cavanagh, J. . Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 1st edition. , (2018).
  10. Sekhar, A., Kay, L. E. NMR paves the way for atomic level descriptions of sparsely populated, transiently formed biomolecular conformers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (32), 12867-12874 (2013).
  11. Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
  12. Alderson, T. R., Kay, L. E. NMR spectroscopy captures the essential role of dynamics in regulating biomolecular function. Cell. 184 (3), 577-595 (2021).
  13. Clore, G. M., Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chemical Reviews. 109 (9), 4108-4139 (2009).
  14. Wu, K. P., Baum, J. Detection of transient interchain interactions in the intrinsically disordered protein alpha-synuclein by NMR paramagnetic relaxation enhancement. Journal of the American Chemical Society. 132 (16), 5546-5547 (2010).
  15. Janowska, M. K., Wu, K. P., Baum, J. Unveiling transient protein-protein interactions that modulate inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein, a pre-synaptic protein that co-localizes with alpha-synuclein. Scientific Reports. 5, 15164 (2015).
  16. Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid-liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (7), 637-648 (2019).
  17. Fawzi, N. L., Doucleff, M., Suh, J. Y., Clore, G. M. Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (4), 1379-1384 (2010).
  18. Griffith, O. H., Waggoner, A. S. Nitroxide free radicals: spin labels for probing biomolecular structure. Accounts of Chemical Research. 2 (2), 17-24 (1969).
  19. Bertini, I., Luchinat, C., Parigi, G., Ravera, E. . NMR of Paramagnetic Macromolecules, Applications to Metallobiomolecules and Models. 2 edn. , (2016).
  20. Bloembergen, N., Purcell, E. M., Pound, R. V. Relaxation effects in nuclear magnetic resonance absorption. Physical Review. 73 (7), 679-712 (1948).
  21. Solomon, I. Relaxation processes in a system of two spins. Physical Review. 99 (2), 559 (1955).
  22. Clore, G. M. Practical aspects of paramagnetic relaxation enhancement in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 564, 485-497 (2015).
  23. Klare, J. P. Site-directed spin labeling EPR spectroscopy in protein research. Biological Chemistry. 394 (10), 1281-1300 (2013).
  24. Clore, G. M., Tang, C., Iwahara, J. Elucidating transient macromolecular interactions using paramagnetic relaxation enhancement. Current Opinion in Structural Biology. 17 (5), 603-616 (2007).
  25. Melanson, M., Sood, A., Torok, F., Torok, M. Introduction to spin label electron paramagnetic resonance spectroscopy of proteins. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 156-162 (2013).
  26. Czogalla, A., Pieciul, A., Jezierski, A., Sikorski, A. F. Attaching a spin to a protein — site-directed spin labeling in structural biology. Acta Biochimica Polonica. 54 (2), 235-244 (2007).
  27. Lindfors, H. E., de Koning, P. E., Drijfhout, J. W., Venezia, B., Ubbink, M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 157-167 (2008).
  28. Fawzi, N. L., et al. A rigid disulfide-linked nitroxide side chain simplifies the quantitative analysis of PRE data. Journal of Biomolecular NMR. 51 (1-2), 105-114 (2011).
  29. Bleicken, S., et al. gem-Diethyl pyrroline nitroxide spin labels: Synthesis, EPR characterization, rotamer libraries and biocompatibility. ChemistryOpen. 8 (8), 1035 (2019).
  30. Iwahara, J., Tang, C., Clore, G. M. Practical aspects of 1H transverse paramagnetic relaxation enhancement measurements on macromolecules. Journal of Magnetic Resonance. 184, 185-195 (2007).
  31. Venditti, V., Fawzi, N. L. Probing the atomic structure of transient protein contacts by paramagnetic relaxation enhancement solution NMR. Methods in Molecular Biology. 1688, 243-255 (2018).
  32. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  33. Lee, W., Tonelli, M., Markley, J. L. NMRFAM-SPARKY: enhanced software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 31 (8), 1325-1327 (2015).
  34. Vranken, W. F., et al. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline. Proteins. 59 (4), 687-696 (2005).
  35. Johnson, B. A. Using NMRView to visualize and analyze the NMR spectra of macromolecules. Methods in Molecular Biology. 278, 313-352 (2004).
  36. Sjodt, M., Clubb, R. T. Nitroxide labeling of proteins and the determination of paramagnetic relaxation derived distance restraints for NMR studies. Bio-Protocol. 7 (7), (2017).
  37. Zhang, H., van Ingen, H. Isotope-labeling strategies for solution NMR studies of macromolecular assemblies. Current Opinion in Structural Biology. 38, 75-82 (2016).
  38. Rabdano, S. O., et al. Onset of disorder and protein aggregation due to oxidation-induced intermolecular disulfide bonds: case study of RRM2 domain from TDP-43. Scientific Reports. 7 (1), 11161 (2017).
  39. Burns, J. A., Butler, J. C., Moran, J., Whitesides, G. M. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. Journal of Organic Chemistry. 56 (8), 2648-2650 (1991).
  40. Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics. 82 (1), 70-77 (1959).
  41. Binbuga, B., Boroujerdi, A. F., Young, J. K. Structure in an extreme environment: NMR at high salt. Protein Science. 16 (8), 1783-1787 (2007).
  42. Schwartz, J. C., Cech, T. R., Parker, R. R. Biochemical properties and biological functions of FET proteins. Annual Review of Biochemistry. 84, 355-379 (2015).
  43. Nabuurs, S. M., de Kort, B. J., Westphal, A. H., van Mierlo, C. P. Non-native hydrophobic interactions detected in unfolded apoflavodoxin by paramagnetic relaxation enhancement. European Biophysics Journal. 39 (4), 689-698 (2010).
  44. Wiedemann, C., Kumar, A., Lang, A., Ohlenschlager, O. Cysteines and disulfide bonds as structure-forming units: Insights from different domains of life and the potential for characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 8, 280 (2020).
  45. Wommack, A. J., et al. NMR solution structure and condition-dependent oligomerization of the antimicrobial peptide human defensin 5. Biochemistry. 51 (48), 9624-9637 (2012).
  46. Taylor, A. M., et al. Detailed characterization of cysteine-less P-glycoprotein reveals subtle pharmacological differences in function from wild-type protein. British Journal of Pharmacology. 134 (8), 1609-1618 (2001).
  47. Hu, K., Doucleff, M., Clore, G. M. Using multiple quantum coherence to increase the 15N resolution in a three-dimensional TROSY HNCO experiment for accurate PRE and RDC measurements. Journal of Magnetic Resonance. 200 (2), 173-177 (2009).
  48. Anthis, N. J., Doucleff, M., Clore, G. M. Transient, sparsely populated compact states of apo and calcium-loaded calmodulin probed by paramagnetic relaxation enhancement: interplay of conformational selection and induced fit. Journal of the American Chemical Society. 133 (46), 18966-18974 (2011).
  49. Battiste, J. L., Wagner, G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data. Biochemistry. 39 (18), 5355-5365 (2000).
  50. Donaldson, L. W., et al. Structural characterization of proteins with an attached ATCUN motif by paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 123 (40), 9843-9847 (2001).
  51. Gaponenko, V., et al. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling. Protein Science. 9 (2), 302-309 (2000).
  52. Trindade, I. B., Invernici, M., Cantini, F., Louro, R. O., Piccioli, M. PRE-driven protein NMR structures: an alternative approach in highly paramagnetic systems. FEBS Journal. 288 (9), 3010-3023 (2021).
  53. Nitsche, C., Otting, G. Pseudocontact shifts in biomolecular NMR using paramagnetic metal tags. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 98-99, 20-49 (2017).

Play Video

Cite This Article
Johnson, C. N., Libich, D. S. Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (175), e63057, doi:10.3791/63057 (2021).

View Video