여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.
간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 순환과 간 실질 사이의 계면에 위치한 특수 내피 세포입니다. LSECs는 fenestrae의 존재와 기저막의 부재를 특징으로하는 뚜렷한 형태를 가지고 있습니다. LSEC는 대사 조절 장애, 염증, 섬유증, 혈관 신생 및 발암을 포함하여 간에서 많은 병리학 적 장애에서 필수적인 역할을합니다. 그러나 LSEC의 격리 및 특성화에 대해서는 거의 발표되지 않았습니다. 여기에서, 이 프로토콜은 건강한 및 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 둘 다로부터 LSEC의 분리에 대해 논의한다. 이 프로토콜은 마우스 간 및 자기 비드의 콜라게나제 관류에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 연구는 유세포 분석기에 의해 특정 마커를 사용하여 LSEC를 특성화하고 주사 전자 현미경으로 특징적인 표현형 특징을 식별합니다. 이 프로토콜에 따라 분리된 LSEC는 접착 및 투과성 분석을 포함한 기능적 연구뿐만 아니라 관심 있는 특정 경로에 대한 다운스트림 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 이들 LSEC는 개별적으로 풀링되거나 사용될 수 있으며, RNA-seq 벌크 또는 단일 세포, 프로테오믹 또는 포스포-프로테오믹스, 시퀀싱(ATAC-seq)을 이용한 트랜스포제-접근 가능한 크로마틴에 대한 어세이 등을 포함하는 다중 오믹스 데이터 생성을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 LSEC가 건강 및 질병에서 다른 간 세포와의 통신을 연구하는 조사관에게 유용하며 급성 및 만성 간 손상의 병원성 메커니즘에서 LSEC의 역할에 대한 심층적 인 이해를 가능하게합니다.
간 정현파 내피 세포 (LSECs)는 간 정현파 벽을 따라 늘어서 있으며 간에서 가장 풍부한 비 실질 세포입니다1. LSECs는 fenestrae의 존재와 고전적인 기저막 또는 횡격막 2,3의 부족에 의해 신체의 다른 모세관 내피 세포와 구별됩니다. 따라서 LSEC는 지질 및 지단백질을 포함한 다양한 순환 거대 분자를 제거하기 위해 투과성과 내시성 능력을 향상시키는 독특한 표현형 및 구조적 특성을 가지고 있습니다. LSECs는 실질 세포와 비실질 세포, 예컨대 성상 세포 및 면역 세포 사이의 누화에서 중추적인 역할을 한다. LSECs는 성상 세포와 쿠퍼 세포를 정지 상태로 유지함으로써 간 항상성을 유지하는 데 중요합니다4. LSECs는 순환하는 백혈구 5,6의 부착 및 내피 이동을 매개함으로써 간 면역 세포 집단의 조성을 조절한다. 허혈-재관류 손상(IRI)8, 비알콜성 지방간염(NASH)9 및 간세포암(HCC)을 포함하는 급성 및 만성 간 손상(7) 동안, LSECs는 기저막(10)의 탈지 및 형성을 특징으로 하는 모세관화로 알려진 표현형 변화를 겪는다. LSECs의 이러한 표현형 변화는 LSECs 기능 장애 및 전구혈전성, 전염증성 및 프로섬유형성 특성의 획득과 관련이 있다.
마우스 간으로부터 LSECs를 분리하기 위한 몇몇 방법이 개발되었다11. 일부 기술은 비실질 및 실질 세포를 분리한 후 밀도 구배 원심분리를 통해 비실질 분획으로부터 LSEC를 정제하는 것에 의존한다. 이 방법의 한계는 LSEC 단리의 최종 단계에서 대식세포를 오염시키는 존재이며, 이는 단리된 LSEC(12)의 순도에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜은 마우스 간 콜라게나제 관류 및 CD146+ 자기 비드의 양성 선택에 기초하여 LSECs를 정제하기 위한 비실질 세포의 양성 선택이다. 이 방법을 사용하여 분리된 LSEC는 높은 순도와 보존된 형태학 및 생존력을 보여줍니다. 이러한 LSEC는 투과성 및 접착 분석뿐만 아니라 관심 경로에 대한 다운스트림 연구를 포함한 기능 연구에 최적입니다. 또한, 임상 연구 및 발견 과학 모두에서 큰 데이터 세트를 생성하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라, 비알콜성 지방간염(NASH) 또는 기타 질환을 앓고 있는 건강한 간과 병든 간에서 분리된 이러한 고품질 LSEC를 개별적으로 풀링하거나 사용할 수 있어 다중 오믹스 데이터 생성 및 건강과 질병 간의 비교13,14 . 또한, 단리된 LSEC는 LSEC에서 활성화된 신호전달 경로를 해독하고 다양한 유해한 자극 하에서 그리고 다양한 치료적 개입에 반응하여 다른 간세포와의 세포간 통신을 해독하기 위해 오가노이드와 같은 이차원 및 입체내 시험관내 모델을 개발하는 데 사용될 수 있다.
현재 원고에서, 우리는 두 단계 콜라게나제 관류 및 후속 자기 활성화 세포 분류 (MACS)로 구성된 마우스 간으로부터의 LSEC 분리를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다음의 세 단계로 구성된다: (1) 칼슘이 없는 완충액으로 PV를 통한 관류, 이어서 간세포 분산을 달성하기 위한 콜라게나제 함유 완충액; (2) 저속 원심분리를 통한 간세포의 배제; 및 (3) 항-CD146 자기 비드를 사용하는 비실질 세…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NIH의 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소 (1RO1DK122948 내지 SHI)와 NIH Silvio O. Conte 소화기 질환 연구 핵심 센터 P30 부여 메커니즘 (DK084567)에 의해 지원되었습니다. 일본 과학진흥회(JSPS) 해외연구펠로우십에서도 KF에 지원을 제공받았다. 우리는 또한 Gregory J. Gores 박사와 Steven Bronk 박사가 콜라게나제 관류 장치의 원래 설계 및 최적화에 대해 인정하고 싶습니다.
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |