Summary

Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains

Published: December 17, 2021
doi:

Summary

Un protocole détaillé est présenté ici pour décrire un modèle organoïde in vitro à partir de cellules épithéliales nasales humaines. Le protocole propose des options pour les mesures nécessitant un équipement de laboratoire standard, avec des possibilités supplémentaires pour l’équipement et les logiciels spécialisés.

Abstract

Un traitement individualisé pour les patients atteints de mucoviscidose (FK) peut être réalisé avec un modèle de maladie in vitro pour comprendre l’activité de base du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) et la restauration à partir de composés de petites molécules. Notre groupe s’est récemment concentré sur l’établissement d’un modèle organoïde bien différencié directement dérivé des cellules épithéliales nasales humaines primaires (HNE). L’histologie des organoïdes sectionnés, la coloration immunofluorescente à monture entière et l’imagerie (à l’aide de la microscopie confocale, de la microscopie immunofluorescente et du champ lumineux) sont essentielles pour caractériser les organoïdes et confirmer la différenciation épithéliale en préparation des essais fonctionnels. De plus, les organoïdes HNE produisent des lumens de différentes tailles qui sont en corrélation avec l’activité CFTR, en distinguant les organoïdes CF et non CF. Dans ce manuscrit, la méthodologie de culture des organoïdes HNE est décrite en détail, en se concentrant sur l’évaluation de la différenciation à l’aide des modalités d’imagerie, y compris la mesure de la zone lumineuse de base (une méthode de mesure de l’activité CFTR dans les organoïdes que tout laboratoire avec un microscope peut utiliser) ainsi que l’approche automatisée développée pour un test fonctionnel (qui nécessite un équipement plus spécialisé).

Introduction

Introduction à la technique
Les tests basés sur la culture ex vivo sont un outil de plus en plus utilisé pour la médecine de précision et l’étude de la physiopathologie des maladies. La culture épithéliale nasale humaine primaire (HNE) a été utilisée dans de nombreuses études sur la fibrose kystique 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , une maladie autosomique récessive qui affecte la fonction des cellules épithéliales dans plusieurs organes. La culture HNE fournit une source renouvelable d’épithélium des voies respiratoires qui peut être obtenue prospectivement et récapitule les qualités électrophysiologiques et biochimiques pour tester l’activité du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR). Les cellules HNE peuvent être échantillonnées avec des effets secondaires minimes14, similaires aux écouvillons respiratoires viraux courants. Des travaux de recherche décrivant un modèle d’étude sur la fibrose kystique dérivé de biopsies à la brosse HNE ont été récemment publiés11,13. Bien que similaire à d’autres modèles utilisantl’HNE primaire 2,3 et le tissu intestinal 15,16,17,18,19, la caractérisation détaillée de la différenciation et de l’imagerie de ce modèle est décrite ici pour une utilisation dans la recherche sur la FK et pour aider aux études d’autres maladies des voies respiratoires 13 . Le modèle organoïde n’est pas illimité comme les lignées cellulaires immortalisées, mais peut être étendu par reprogrammation conditionnelle (en utilisant des fibroblastes d’alimentation irradiés et inactivés et des inhibiteurs de rho-kinase) à un état plus semblable à celui des cellules souches 20,21,22,23. Le traitement des biopsies au pinceau HNE à l’aide de cette méthode produit un grand nombre de cellules épithéliales pour une utilisation dans de multiples applications à un débit plus élevé tout en conservant la capacité de se différencier pleinement. Bien que ce protocole ait été élaboré à l’aide de cellules nourricières, d’autres méthodologies peuvent être utilisées par les chercheurs qui souhaitent éviter la technologie des cellules d’alimentation 14,24.

Importance de la technique pour la biologie pulmonaire
Une étude importante a été consacrée à la compréhension de la façon dont l’absence de CFTR régulier et fonctionnel dans la membrane cellulaire des cellules épithéliales entraîne un dysfonctionnement des poumons, du pancréas, du foie, de l’intestin ou d’autres tissus. Le transport dysfonctionnel des ions épithéliaux, en particulier celui du chlorure et du bicarbonate, entraîne une diminution du volume des fluides de la muqueuse épithéliale et des modifications des sécrétions muqueuses, entraînant une stase muqueuse et une obstruction. Dans d’autres maladies des voies respiratoires, telles que la dyskinésie ciliaire primaire, une altération du mouvement ciliaire altère la clairance mucociliaire et entraîne une stase muqueuse et une obstruction25. Par conséquent, le modèle organoïde HNE actuel a été développé pour diverses applications, en fonction de la conception expérimentale et des ressources de l’investigateur. Cela comprend l’imagerie de cellules vivantes à l’aide de taches de cellules vivantes; fixation et sectionnement pour caractériser la morphologie; coloration par immunofluorescence avec des anticorps et imagerie confocale à montage entier pour éviter de perturber les structures intraluminales; et l’imagerie en champ lumineux et la tomographie par cohérence micro-optique pour les mesures quantitatives de la fréquence des battements ciliaires et du transport mucociliaire13. Pour faciliter l’expansion à d’autres chercheurs, des réactifs et des fournitures disponibles dans le commerce ont été utilisés pour la culture. Un test fonctionnel a été développé qui utilisait des techniques de microscope courantes et un équipement plus spécialisé. Dans l’ensemble, bien que le présent modèle ait été conçu pour évaluer l’activité du CFTR au départ ou en réponse à des traitements, les techniques décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres maladies impliquant la fonction des cellules épithéliales, en particulier le transport du liquide cellulaire épithélial.

Comparaison avec d’autres méthodologies
Récemment, l’utilité de ce modèle organoïde a été développée en corrélant les réponses in vitro du modulateur CFTR des organoïdes des patients avec leur réponse clinique11. Notamment, il est également démontré que le modèle actuel était parallèle aux réponses de courant de court-circuit, l’étalon-or actuel pour évaluer la fonction CFTR, chez les mêmes patients. Le courant de court-circuit diffère du test de gonflement car le premier mesure la fonction CFTR via le transport ionique26. En revanche, ce test mesure un effet plus en aval avec le transport de fluide, fournissant des informations supplémentaires sur la fonction globale du CFTR 27,28,29,30,31,32. Les mesures de courant de court-circuit ont continué d’être une méthode courante et fiable pour déterminer l’activitédu canal chlorure CFTR 1,33. Ces essais électrophysiologiques nécessitent un équipement spécialisé et coûteux, nécessitent beaucoup plus de cellules pour chaque réplication expérimentale que le test organoïde, ne peuvent pas être facilement automatisés et ne se prêtent pas à une mise à l’échelle pour des applications à haut débit. Un autre modèle organoïde dérivé de l’épithélium intestinal présente des avantages supplémentaires 15,16,17,18, tels qu’une capacité de réplication plus excellente, mais n’est ni dérivé d’un tissu des voies respiratoires ni universellement disponible. Les brossages HNE sont obtenus avec des brosses cytologiques peu coûteuses sans sédation et avec un risque minimal. L’obtention du brossage ne nécessite pas de clinicien et peut être effectuée par des coordonnateurs de recherche formés et d’autres membres du personnel de recherche14. Le modèle organoïde HNE peut être cultivé par n’importe quel laboratoire doté de capacités de culture cellulaire primaire, et certaines des applications peuvent être réalisées avec des techniques de microscopie standard. Dans l’ensemble, ces avantages offrent un accès supplémentaire à la technologie d’évaluation de la fonction épithéliale des voies respiratoires qui pourrait autrement ne pas être disponible pour certains laboratoires. En outre, les organoïdes HNE peuvent être utilisés pour étudier d’autres états pathologiques qui affectent les voies respiratoires, tels que la dyskinésie ciliaire primaire25 ou l’infection virale, ce que les organoïdes intestinaux ne peuvent pas.

Protocol

Des échantillons de HNE ont été prélevés à l’hôpital Children’s of Alabama. Toutes les procédures et méthodes décrites ici ont été approuvées par l’IRB University of Alabama à Birmingham (UAB IRB #151030001). Pour faciliter l’expansion et améliorer la fonction des cellules épithéliales nasales humaines (HNE), les méthodes de culture actuelles sont adaptées de la méthode de culture bien connue de l’interface air-liquide (ALI)28,34. Le…

Representative Results

L’expansion des HNE est essentielle à une culture organoïde florissante. Les HNE d’une collecte d’échantillons réussie devraient s’étendre à plus de 70% de confluence vers 10 jours. Un exemple d’échantillons réussis et infructueux est illustré à la figure 1A et à la figure 1B, respectivement. Les cellules doivent être jetées si elles ne peuvent pas atteindre 70% de confluence 14 jours après la co-culture avec des cellules…

Discussion

Ce manuscrit fournit des méthodologies détaillées pour l’imagerie complète en direct et fixe des organoïdes épithéliaux des voies respiratoires dérivés de la biopsie par brosse HNE. Il décrit les tests fonctionnels qui peuvent déterminer l’activité CFTR chez un individu. Les HNE fournissent un tissu primaire peu invasif pour une variété d’applications. Les techniques d’expansion proposées ici peuvent être utilisées pour modéliser les maladies des voies respiratoires, y compris les organoïdes. L…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions tous les participants qui ont fait don de biopsies à la brosse HNE pour développer ce protocole. Nous remercions Latona Kersh et le personnel de l’Unité de recherche pour enfants d’avoir coordonné le recrutement de volontaires de l’étude et les collectes d’échantillons. Nous remercions Lily Deng, Johnathan Bailey et Stephen Mackay, anciens stagiaires de notre laboratoire, pour leur assistance technique. Nous remercions Zhong Liu et Rui Zhao pour leur aide technique. Steven M. Rowe, directeur du Centre de recherche sur les FC à l’UAB, fournit un leadership et des ressources sans lesquels ce travail ne serait pas possible. Nous tenons également à remercier Sarah Guadiana de Biotek pour son aide à la formation aux instruments, Robert Grabski pour l’assistance en microscopie confocale au centre d’imagerie haute résolution de l’UAB et Dezhi Wang pour son assistance histologique au noyau d’histologie de l’UAB. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH). Grant K23HL143167 (à JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF), Grant GUIMBE18A0-Q (à JSG), le Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 et DK072482 et le CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], et le UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

Materials

Nasal brush Medical Packaging CYB1 CYB-1 Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette Tips ThermoFisher Scientific 02-707-141 Large bore pipette tips
Accutase ThermoFisher Scientific A1110501 Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTA Gibco 25300-054
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrix Corning 356255 Extracellular matrix (EM)
µ-Slide Angiogenesis Ibidi 81506 15-well slide
24-Well Transwell Corning 7200154 Culture insert
Chambered Coverglass ThermoFisher Scientific 155409 8-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific 354240 Cell adhesive
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 50980487
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
BSA ThermoFisher Scientific BP1600-100
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) Nikon Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25 Nikon Confocal microscope
NIS Elements- Basic Research Nikon manual imaging analysis software
Histogel ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Disposable Base Molds ThermoFisher Scientific 41-740
Lionheart FX BioTek BTLFX Automated image system
Lionheart Cover BioTek BT1450009 Environmental Control Lid
Humidity Chamber BioTek BT1450006 Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2 BioTek BT1210013 Gas controller
Microplate/Slide Stage Insert BioTek BT1450527 Slide holder
Gen5 Imaging Prime Software BioTek BTGEN5IPRIM Automated imaging analysis software
4x Phase Contrast Objective BioTek BT1320515
10x Phase Contrast Objective BioTek BT1320516
LED Cube BioTek BT1225007
Filter Cube (DAPI) BioTek BT1225100 DAPI
CFTRinh-172 Selleck Chemicals S7139
Forskolin Sigma F6886
IBMX Sigma I5879
Expansion Media
DMEM ThermoFisher Scientific 11965
F12 Nutrient mix ThermoFisher Scientific 11765
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific  16140-071
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific  15-140-122
Cholera Toxin Sigma  C8052
Epidermal Growth Factor (EGF) ThermoFisher Scientific  PHG0314
Hydrocortisone (HC) Sigma  H0888
Insulin Sigma  I9278
Adenine Sigma  A2786
Y-27632 Stemgent  04-0012-02
Antibiotic Media
Ceftazidime Alfa Aesar  J66460-03
Tobramycin Alfa Aesar  J67340
Vancomycin Alfa Aesar  J67251
Amphotericin B Sigma  A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1) ThermoFisher Scientific  11330-32
Ultroser-G Pall  15950-017
Fetal Clone II Hyclone  SH30066.03
Bovine Brain Extract Lonza  CC-4098
Insulin Sigma  I-9278
Hydrocortisone Sigma  H-0888
Triiodothyronine Sigma  T-6397
Transferrin Sigma  T-0665
Ethanolamine Sigma  E-0135
Epinephrine Sigma E-4250
O-Phosphorylethanolamine Sigma P-0503
Retinoic Acid Sigma R-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibody R&D Systems MAB1660 Dilution: 100x
ZO-1 antibody Thermo Fisher MA3-39100-A647 Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibody Sigma HPA008246 Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulin Sigma T7451 Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibody Abcam Ab11315 Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A21202 Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 Invitrogen A21207 Dilution: 2000x

References

  1. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
  2. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
  3. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
  4. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
  5. Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
  6. Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
  7. Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
  8. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  9. Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
  10. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
  11. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  12. Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
  13. Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
  14. Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
  16. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  17. Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
  18. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  19. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  20. Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
  21. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  22. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
  23. Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
  24. Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
  25. Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
  26. Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
  27. Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
  28. Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
  29. Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
  30. Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
  31. Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
  32. Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
  33. McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
  34. Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
  35. Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
  36. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  37. Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
  38. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  39. Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
  40. McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
  41. Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).

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Cite This Article
Liu, Z., Anderson, J. D., Natt, J., Guimbellot, J. S. Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids. J. Vis. Exp. (178), e63064, doi:10.3791/63064 (2021).

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