Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

קביעת ההוצאה על אנרגיה בזלית והקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוצאות אנרגיה בעכברים שמנים

Published: November 11, 2021 doi: 10.3791/63066

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול למדידת קצב חילוף החומרים של הבזל ואת היכולת החמצונית של אדיפוזיטים תרמוגניים בעכברים שמנים.

Abstract

מדידות הוצאות אנרגיה נחוצות כדי להבין כיצד שינויים בחילוף החומרים יכולים להוביל להשמנת יתר. ניתן לקבוע את ההוצאה על אנרגיה בזלית בעכברים על ידי מדידת צריכת חמצן בכל הגוף, ייצור CO2 ופעילות גופנית באמצעות כלובים מטבוליים. אדיפוציטים חומים/בז' תרמוגניים (BA) תורמים באופן משמעותי להוצאות האנרגיה של מכרסמים, במיוחד בטמפרטורות סביבה נמוכות. כאן, מדידות של הוצאות אנרגיה בזאליות ויכולת BA כוללת להוציא אנרגיה בעכברים שמנים מתוארים בשני פרוטוקולים מפורטים: הראשון המסביר כיצד להקים את הבדיקה כדי למדוד את ההוצאה על אנרגיה בזלית באמצעות ניתוח של covariance (ANCOVA), ניתוח הכרחי בהתחשב בכך שהוצאות האנרגיה משתנות בהתאם למסת הגוף. הפרוטוקול השני מתאר כיצד למדוד את יכולת ההוצאה האנרגטית של BA בעכברים . הליך זה כרוך בהרדמה, הדרוש כדי להגביל את ההוצאה הנגרמת על ידי פעילות גופנית, ואחריו הזרקת אגוניסט בטא3-adrenergic, CL-316,243, אשר מפעיל את ההוצאה האנרגטית BA. שני פרוטוקולים אלה ומגבלותיהם מתוארים בפירוט מספיק כדי לאפשר ניסוי ראשון מוצלח.

Introduction

חילוף החומרים יכול להיות מוגדר כשילוב של התגובות הביוכימיות האחראיות על ספיגת חומרים מזינים, אחסון, טרנספורמציה, ופירוק כי תאים להשתמש כדי לגדול ולבצע את הפונקציות שלהם. תגובות מטבוליות הופכות את האנרגיה הכלולה בחומרים מזינים לצורה שיכולה לשמש תאים לסנתז מולקולות חדשות ולבצע עבודה. תגובות ביוכימיות אלה אינן יעילות מטבען בהפיכת אנרגיה זו לצורה שמיש כדי לקיים חיים1. חוסר יעילות כזה גורם לפיזור אנרגיה בצורה של חום, עם ייצור חום זה משמש כדי לכמת את קצב חילוף החומרים הסטנדרטי (SMR) של אורגניזם1. המצב הסטנדרטי הוגדר באופן קלאסי כייצור חום המתרחש במבוגר ער אך נח, לא בליעת או עיכול מזון, בתרמונוטרליות וללא כל מתח1. קצב חילוף החומרים הבסיסי (BMR) או הוצאות אנרגיה הבסיסית בעכברים מכונה SMR אך אצל אנשים בולעים ומעכלים מזון תחת לחץ תרמי קל (טמפרטורות הסביבה 21-22 מעלות צלזיוס)1. האתגרים והקשיים של מדידת ייצור חום ישירות הפכו את ה- BMR לעקיף, כלומר לחשב את ייצור החום ממדידות צריכת חמצן, כדי להפוך לגישה הפופולרית ביותר לקביעת ה- BMR. חישוב ה- BMR מצריכת חמצן אפשרי מכיוון שחמצון החומרים המזינים על ידי המיטוכונדריה לסנתז ATP אחראי ל -72% מכלל החמצן הנצרך באורגניזם, עם 8% מצריכת החמצן הכוללת המתרחשת גם במיטוכונדריה אך מבלי ליצור ATP (נשימה לא מנוקבת)1. ניתן לייחס את רוב 20% הנותרים של החמצן הנצרך לחמצון מיזים במקומות תת-תאיים אחרים (חמצון חומצת שומן פרוקסיזומלית), תהליכים אנבוליים ויצירת מינים תגובתיים של חמצן1. כך, בשנת 1907, לאסק הקים משוואה, המבוססת על מדידות אמפיריות, בשימוש נרחב כדי להפוך את צריכת החמצן וייצור CO2 לפיזור אנרגיה כחום. אצל בני אדם, המוח מהווה ~ 25% של BMR, מערכת השלד והשרירים עבור ~ 18.4%, הכבד עבור ~ 20 %, הלב עבור ~ 10%, ורקמת השומן עבור ~ 3-7%2. בעכברים, תרומת הרקמה ל- BMR שונה במקצת, כאשר המוח מייצג ~ 6.5%, שריר השלד ~ 13%, הכבד ~ 52%, הלב ~ 3.7%, ורקמת השומן ~ 5%3.

למרבה הפלא, התגובות הביוכימיות המגדירות את ה- BMR אינן קבועות ומשתנות בתגובה לצרכים שונים, כגון עבודה חיצונית (פעילות גופנית), פיתוח (צמיחת רקמות), לחצים פנימיים (זיהומים נגד, פציעות, מחזור רקמות) ושינויים בטמפרטורת הסביבה (הגנה קרה)1. אורגניזמים מסוימים מגייסים באופן פעיל תהליכים ליצירת חום בחשיפה לקור, מה שמרמז על כך שהחום המיוצר על ידי חילוף החומרים אינו רק תוצר לוואי מקרי. במקום זאת, האבולוציה בחרה מנגנוני רגולציה שיכולים במיוחד להגביר את ייצור החום על ידי שינוי קצב התגובות המטבוליות1. לכן, אלה מדידות צריכת חמצן ניתן להשתמש כדי לקבוע את היכולת של אורגניזם לייצר חום בתגובה לקור.

שני תהליכים עיקריים תורמים לייצור חום עם חשיפה לקור. הראשון הוא רועד, אשר מייצר חום על ידי הגדלת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס בשריר כדי לכסות את העבודה הפיזית שנעשתה על ידי התכווצות שרירים לא רצונית. לכן, חשיפה לקור תגדיל את צריכת החמצן בשרירים1. השני הוא תרמוגנזה לא רועדת, המתרחשת באמצעות עלייה בצריכת חמצן באדיפוציטים חומים ובז '(BA). פיזור האנרגיה לחום ב- BA מתווך על ידי חלבון מתפרק מיטוכונדריאלי 1 (UCP1), המאפשר כניסה מחדש של פרוטון למטריצה המיטוכונדריאלית, ומפחית את שיפוע הפרוטון המיטוכונדריאלי. פיזור שיפוע הפרוטונים המיטוכונדריאלי על ידי UCP1 מגביר את ייצור החום על ידי הגובה בהעברת אלקטרונים וצריכת חמצן והאנרגיה המשתחררת על ידי פיזור פרוטונים כשלעצמו מבלי ליצור ATP (לא מנוטרל). יתר על כן, BA תרמוגני יכול לגייס מנגנונים נוספים להעלות את צריכת החמצן מבלי לגרום פיזור גדול בשיפוע פרוטון, על ידי הפעלת סינתזת ATP חמצוני חסר תועלת ומחזורי צריכה. הכלובים המטבוליים המתוארים כאן, כלומר מערכת CLAMS-Oxymax מקולומבוס אינסטרומנטס, מציעים את האפשרות למדוד את הוצאות האנרגיה בטמפרטורות סביבה שונות. עם זאת, כדי לקבוע את יכולת התרמוגנית של BA באמצעות מדידות צריכת חמצן בכל הגוף, יש: (1) לחסל את התרומה של רועד, ותהליכים מטבוליים אחרים שאינם BA להוצאות אנרגיה, ו -(2) במיוחד להפעיל פעילות תרמוגנית BA ב vivo. לכן, פרוטוקול שני מתאר כיצד להפעיל באופן סלקטיבי BA ב vivo באמצעות פרמקולוגיה בעכברים מורדמים ב thermoneutrality (30 °C), עם הרדמה תרמונוטרליות המגבילה תהליכים תרמוגניים אחרים שאינם BA (כלומר, פעילות גופנית). האסטרטגיה הפרמקולוגית להפעלת BA היא טיפול בעכברים עם אגוניסט קולטן β3-adrenergic CL-316,246. הסיבה לכך היא כי חשיפה קרה מקדמת תגובה אוהדת משחרר נוראדרנלין להפעיל קולטנים β-adrenergic ב BA, אשר מפעיל UCP1 חמצון שומן. יתר על כן, ביטוי קולטן adrenergic β3 מועשר מאוד ברקמת שומן בעכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA). עכברים קיבלו את התזונה והמים שלהם בכלוב המטבולי, ששוכנו בסביבה מבוקרת טמפרטורה (~21-22 או 30 מעלות צלזיוס) עם מחזור בהיר/כהה של 12 שעות. 8 עכברים נקבות בנות שבוע האכילו דיאטה עתירת שומן או דיאטת צ'או במשך 8 שבועות שימשו למחקר זה.

1. מדידת קצב חילוף החומרים של הבזל (BMR)

  1. מדוד את משקל הגוף הכולל של העכבר באמצעות סולם משקל בדיוק בטווח של 0.1 גרם.
    הערה: זה חייב להיעשות לפני דיור העכברים בכלובים מטבוליים ואחרי 2-3 ימים של תקופת התאקלמות לכלובים המטבוליים.
  2. מדוד את הרכב הגוף, כולל שומן ומסה רזה בעכברים שאינם מרדים, באמצעות מערכת ניתוח הרכב הגוף המתאימה (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: מדידות אלה נדרשות כדי לקבוע את ההוצאה האנרגטית ומבוצעות במקביל למדידות משקל הגוף הכוללות (שלב 1.1).
  3. הגדר את הכלובים המטבוליים ולהתחיל את תקופת ההתאקלמות.
    הערה: מערכת הכלובים המטבוליים כוללת מארז המאפשר למשתמש לשלוט בטמפרטורת הדיור ובאור של 12 כלובים (איור 1A,B). בכל כלוב יש בקבוק מים, מאכיל ורשת (איור 1C). הרשת מפרידה את העכבר מתחתית הכלוב, ומאפשרת איסוף צואה. לאחר התקנת הכלוב על כל חלל שנקבע מראש, מכסה החותם את הכלוב כולל את חריץ בקבוק המים, את אוויר הדגימה של הצינורות, את מערכת זרימת האוויר ואת חיישן הפעילות הגופנית (איור 1D).
    1. הפעל את מארז הטמפרטורה, את מערכת זרימת האוויר ואת המחשב 2 שעות לפני תחילת בדיקת ההפעלה.
    2. לאחר 2 שעות, פתח את התוכנה השולטת במארז (ראה טבלת חומרים) ואת זרימת האוויר ותן לתוכנה לבדוק את התקשורת של המחשב עם הציוד.
      הערה: תוכנת Oxymax שימשה לעבודה הנוכחית.
    3. לאחר יצירת התקשורת, לחץ על קובץ ולאחר מכן פתח את תצורת הניסוי (איור 2A) ובחר את תצורת הניסוי שעוצבה מראש על-ידי הספק (או הגדר מבוחן קודם).
    4. לחץ על הניסוי ולאחר מכן לחץ על מאפיינים, אשר יפתח את החלון מאפייני ניסוי (איור 2B).
    5. בחלון מאפיינים, הגדר את הפרמטרים של המארז הסביבתי, כולל טמפרטורת הסביבה (21 °C )C) ואת מחזורי האור של 12 שעות.
      הערה: שמירה על התוכנה פתוחה ופועלת מאפשרת לאוויר לזרום לתוך הכלובים והמארז כדי לשמור על הטמפרטורה ומחזורי האור שנבחרו. לכן, המערכת כולה יכולה לפעול עם עכברים בתוך הכלובים במשך כמה ימים, גם ללא מדידת חמצן ופחמן דו חמצני.
    6. לחץ על ניסוי, ולאחר מכן לחץ על ההתקנה, ואת החלון הגדרת ניסוי ייפתח, שבו הפרמטרים של כל כלוב מטבולי מוגדרים.
    7. הקצה כל מזהה עכבר לכלוב הבודד שבו שוכן העכבר (איור 2C).
    8. כלול את המסה הרזה או משקל גוף כולל עבור כל עכבר רק אם אין הבדלים במשקל הגוף נצפים בין קבוצות.
      הערה: השגת ערכים גולמיים של צריכת חמצן והוצאות אנרגיה מקלה על ניתוחי ANCOVA.
    9. הגדר את קצב זרימת האוויר לכלוב חילוף החומרים ב 0.5-0.6 ליטר / דקה.
    10. בחלון התקנת ניסוי, בחר את הנתיב והשם לשמירת הקבצים. בחרו בספריית הגיבוי (איור 2D).
    11. הוסף כמות משוקללת מראש של מזון למאכילים המכסה לפחות צריכת מזון במשך יום אחד.
      הערה: אם לכלובים יש קשקשים משולבים, ניתן להוסיף את המזון ישירות, והתוכנה תקליט אותו.
    12. מוסיפים את בקבוקי המים. בדוק כי הבקבוק אטום כראוי ואינו דולף.
    13. 24 שעות לאחר הוספת האוכל, לשקול את האוכל שנותר על הכלוב.
      הערה: גרם המזון שנוספו פחות גרם המזון שנותר ימדוד את צריכת המזון.
    14. התחל את מדידות החמצן, הפחמן הדו-חמצני והפעילות (שלב 1.4.10) לאחר שערכי צריכת המזון זהים לאלה של עכברים השוכנים בכלובים רגילים.
      הערה: כאן, תקופת ההתאקלמות (בדרך כלל 2-3 ימים) הושלמה, ומדידות הוצאות אנרגיה יכולות להתחיל.
  4. מדידות קלורימטריה ופעילות עקיפות להערכת הוצאות האנרגיה
    1. למדוד את משקל הגוף, שומן, ומסה רזה של כל העכברים לפני תחילת המדידות.
      הערה: אלה הם משקל הגוף וערכי מסה רזה המשמשים לביצוע ניתוחי ANCOVA.
    2. כייל את גלאי O2 ו- CO2 של מערכת ה- CLAMS (ראה טבלת חומרים) בריכוז החמצן המומלץ; תמיד לכייל מחדש את הגלאי לפני תחילת ניסוי חדש.
    3. השתמש בגז כיול של הרכב ידוע (20.50% חמצן ו 0.50% CO2).
      הערה: ספקי גז לעתים קרובות מתייחסים לגז זה כאל "ציון סטנדרטי ראשוני".
    4. הפעל ולוודא כי לחץ פלט הטנק הוא ב 5-10 פסאיי.
    5. פתחו את תוכנת כלי הכיול לכיול ובדיקה של חיישני הגז (איור 2E). לחץ על ניסוי, ולאחר מכן כייל.
    6. לחץ על התחל. לאחר מכן, המתינו לבדיקת החיישנים ושתוכנה תבקש מהמשתמש לסובב את הכפתורים של חיישן הגז (איור 2F) עד שהערך של זהות O2 יהיה 1 (איור 2G-H). לחץ על הבא לאחר השלמת השלב.
      הערה: אם כלי הכיול מבצע את כל השלבים הנוכחיים, הכיול ימשיך באופן אוטומטי לשלב הבא כאשר מד ההתקדמות יתמלא.
    7. אמת את תוצאות הכיול לאחר השלמת כל השלבים והתוצאות מוצגות.
    8. כבה את גז הכיול.
    9. החליפו מזון והוסיפו מספיק מזון לתקופה של 48-72 שעות.
      הערה: למרות כלובים ניתן לפתוח במהלך מדידות הוצאות האנרגיה כדי לפקח על משקל הגוף ולשנות את המזון מדי יום, עכברים יכולים להיות לחוצים על ידי מניפולציות אלה, ומדידות הולכים לאיבוד כאשר הכלובים נפתחים. לכן, מומלץ להימנע מכל מניפולציה במהלך תקופת המדידה.
    10. בתוכנה, לחץ על ניסוי ולאחר מכן הפעל כדי להפעיל את מדידות החמצן, הפחמן הדו-חמצני והפעילות (איור 3A).
      הערה: ניתן לעקוב אחר ביצוע המדידות בזמן אמת בתיבה הממוקמת בחלק הימני התחתון של התוכנה (מלבן אדום, איור 3B). המלבן האדום באיור 3B מראה שהמערכת מודדת את הכלוב מספר 1 במרווח מס' 3, כלומר המדידה השלישית. מדידה אחת בכלוב אחד יכולה להימשך כדקה אחת. לכן, עם 12 כלובים מחוברים, צריכת חמצן ניתן למדוד בערך כל 12 דקות. מומלץ לבצע מדידות רציפה של מינימום 48 שעות.
    11. הפסיקו את הניסוי על ידי לחיצה על הניסוי ולאחר מכן עצרו (איור 3C).
    12. פתח את הכלובים, שקול את העכברים ואת האוכל. לאסוף את הצואה כדי לחשב את מספר הקלוריות והשומנים המופרשים על פני תקופת המדידות 48-72 שעות.
      הערה: ניתן לאחסן צואה ב- -20 °C (70 °F) עבור ניתוחים מאוחרים יותר. לא ניתן להשתמש בכלובים אלה ביעילות לאיסוף שתן.
    13. לחץ על ניסויים ולאחר מכן על ייצוא וייצוא של כל הנושאים כקובץ CSV (איור 3D).
      הערה: כדי להקל על ניתוחי ANCOVA, זה חיוני כדי לייצא צריכת חמצן גולמי (VO2) ו CO2 ייצור ערכים (VCO2) מבלי להיות מנורמל על ידי משקל הגוף.
  5. ניתוח נתונים ובקרת איכות
    1. בגיליון CSV המיוצא (איור 3D) (החל מהשלב 1.4.13), השתמש בערכים הגולמיים של צריכת החמצן (VO2) וייצור CO2 (VCO2) הנמדדים כל 12 דקות בתקופה של 2-3 ימים המפורטים באופן אוטומטי על-ידי התוכנה וכוללים חותמת זמן, כלומר השעה והתאריך שבהם הם נמדדו.
      הערה: ערכי VO2 ו- VCO2 יתוקנו באופן אוטומטי אם יוסיפו משקל גוף או ערכי מסה רזה.
    2. בגיליון CSV המיוצא, השתמש בערכים הגולמיים של יחס חילופי הנשימה (RER: VCO2/VO2) המחושב באופן אוטומטי ומפורטים על ידי התוכנה בהתאם לחותמת הזמן שלהם.
      הערה: ערכים קרובים ל- 1 מראים שהעכבר בעיקר מחמצן פחמימות, בעוד שערכים קרובים יותר ל- 0.7 מייצגים שהעכבר בעיקר מחמצן שומן. RER מעל 1 יכול להתרחש במהלך פעילות אנאירובית, כמו הגוף מגרש יותר CO2 כדי לפצות על חמצת הנגרמת על ידי לקטט. RER גבוה מ- 1 יכול להצביע על מתח. קובץ CSV המיוצא מכיל גם את הערכים הגולמיים מהוצאות אנרגיה (EE) או ייצור חום בקלוריות לדקה לעכבר, הנמדדים כל 12 דקות ב -2-3 הימים. כאן, כל הערכים המפורטים כוללים חותמת זמן.
    3. מכיוון שערכי EE יחידים לעכבר נדרשים עבור ANCOVA, ממוצע ערכי ה- EE שנרשמו בין השעות 09:00-16:00 עבור שלב האור (היום) ו- 19:00-04:00 עבור השלב הכהה (לילה) בעכבר וביום.
      הערה: ניתן לעשות זאת באופן ידני באמצעות Excel או Graph Pad. בחירת חלונות פעמיים אלה מונעת ממוצע של ערכי EE בינוניים, הדרגתיים ולא יציבים המשויכים למעבר הפאזה הכהה בהיר.
    4. עבור תקופה של 48 שעות, חשב את הממוצע של שני ערכי אור יום ואת שני ערכי הפאזה הכהה לעכבר באמצעות Excel או Graph Pad.
    5. כדי לכמת את הפעילות הגופנית הכוללת, השתמש ב- Excel או ב- Graph Pad כדי לסכם את ספירת מעברי הקרן x, Y ו- z הנמדדים בכלובים המטבוליים ומפורטים בקובץ CSV עבור כל עכבר.
      הערה: הפעילות הכוללת x,y,z מחושבת על-ידי ביצוע תחילה הערך הממוצע של כל X, Y, Z לעכבר ומחזור. לאחר מכן, הסכום של כל ערכי X, Y, Z ממוצעים לעכבר ומחזור נקבע להתוות את הנתונים כמו באיור 5E (בממוצע של יומיים).
    6. לחלופין, ייצג את הנתונים המציגים כל ערך מדידה לאורך זמן, מה שיוצר עקומות הממחישות את השינויים ב- EE במהלך המעבר ממחזורים בהירים וכהים.
      הערה: עיין בסעיף הדיון על אופן ומתי לבצע ניתוחי ANCOVA, והנוסחאות השונות המשמשות לחישוב VO2, VCO2 ו- EE מסופקות בקובץ משלים 1.

2. מדידת הקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוציא אנרגיה

  1. הגדר את המדידות וטיפולי העכבר. ראה שלב 1 לקבלת פרטים על ההכנות הניסיוניות לניטור צריכת החמצן, שכן קיבולת תרמוגנית באדיפוציטים נקבעת בעקיפין על ידי צריכת חמצן בעקבות שלבים 2.1.1-2.2.2.
    הערה: פרוטוקול זה דורש הרדמה עכבר וטיפול אקוטי עם אגוניסט קולטן בטא 3 CL-316,243 (ראה טבלה של חומרים), נותן הערכה מהירה של יכולת תרמוגנית BA.
    1. בצע ניתוח הרכב הגוף ולשקול את העכברים. הפעל את CLAMS, להגדיר את הטמפרטורה ב 30 °C (תרמונוטרליות), ולחכות 2 שעות עבור המערכת כולה להתחמם.
    2. הגדר את שאר תנאי הבחינה, כולל אור, להקצות מזהה עכבר לכל כלוב ולהוסיף ערך משקל גוף של כל עכבר בכלוב המתאים אם אין הבדל במשקל הגוף הוא ציין בין קבוצות.
    3. כייל את גלאי החמצן/CO2 כמו בשלבים 1.4.2-1.4.7.
    4. התחל את הניסוי בתוכנה.
    5. הזריקו לכל עכבר פנטוברביטל (60-120 מ"ג/ק"ג) והכניסו כל עכבר לכלוב המטבולי שהוקצה לו (שלב 2.1.2).
      הערה: המינון של pentobarbital הנדרש כדי לשמור על עכברים ישנים ב thermoneutrality (30 °C) משתנה עם זן העכבר ואת הגנוטיפ. מומלץ לבדוק מינונים שונים pentobarbital מ 50 כדי 120 מ"ג/ק"ג ובחר את אחד שמירה על העכבר מרדים במהלך 2-3 שעות ב 30 °C (50 °F). הרדמה יעילה חיונית כדי להסיר את התרומה של פעילות גופנית להוצאות האנרגיה.
    6. כדי להבטיח הרדמה, להתבונן בעכברים לאחר הזרקת pentobarbital עד שהם ישנים לחלוטין שלהם שיעורי צריכת החמצן ירד להיות יציב.
    7. המתן כדי להשיג לפחות 3 שיעורי צריכת חמצן יציבים רצופים לפני הזרקת CL-316,243.
      הערה: בזמן ההמתנה לייצוב צריכת החמצן, להכין את המזרקים עם CL-316,243 עבור כל עכבר (1 מ"ג / קילוגרם).
    8. פתח כלוב #1 והזרק CL-316,243 באופן תת עורי מיד לאחר מדידת VO2 ו- VCO2 אחת התרחשה בכלוב #1. החזר את העכבר לכלוב #1 מיד לאחר ההזרקה.
      הערה: המדידות מסומנות בזמן אמת בחלק הימני התחתון של התוכנה (איור 3B, מלבן אדום).
    9. המתן עד שכלוב #2 יימדד (איור 3B, מלבן אדום) ולאחר מכן המשך כמו בשלב 2.1.8 לכלוב #2.
      הערה: הזרקת CL-316,243 מיד לאחר מדידה מאפשרת שמירה על קבוע הזמן בין זריקות. לדוגמה, אם יש 12 עכברים / כלובים פועלים, עם מדידות שנאספו בכלובים בודדים ברצף ואת האוסף שנמשך 55 s לכלוב, אז אתה צריך להזריק עכבר אחד בכל דקה. עם שיעורי הזרקה אלה, המדידה הראשונה תתרחש לאחר 12 דקות לאחר הזרקה בכל 12 הכלובים.
    10. המשך מדידות הוצאות האנרגיה עד לערכי הוצאות האנרגיה לרמה של 5-6 מדידות רצופות, בדרך כלל 90-180 דקות לאחר ההזרקה.
      הערה: עכברים יכולים להתעורר מההרדמה במהלך הניסויים. יש להסיר את העכברים האלה מהניתוח. לכן, בדיקת מינונים pentobarbital מראש יגביר את היעילות של המחקרים.
    11. עצרו את מדידות ההוצאה האנרגטית, אך שמרו עכברים בכלובים שלהם ב-30 מעלות צלזיוס, עד שהם יתעוררו.
    12. לאחר שהעכברים ערים לחלוטין, בדוק את בריאות העכברים והחזיר אותם לכלובים הראשוניים שלהם.
    13. יצא את הנתונים של כל עכבר כקובץ CSV באמצעות תוכנת הציוד, כמתואר בסעיף 1.4.13.
  2. ניתוח נתונים
    הערה: ניתוח הנתונים בוצע על ידי Excel או Graphpad
    1. התווה את הערכים הרצופים 3-5 של VO2, VCO2 ו- EE יציבים וקבועים לאורך זמן, מכיוון שאלו הערכים המייצגים את קצב חילוף החומרים כאשר עכברים נמצאים במיון מלא.
    2. לאחר מכן, התווה את מדידות VO2, VCO2 ו- EE הרצופות הבאות שהושגו לאחר ההזרקה.
      הערה: הערכים המוחלטים של EE ואת הגידול הקיפול EE המושרה על ידי הזרקה מצביעים על פונקציה תרמוגנית BA7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 4 מציג ערכי פעילות גופנית של VO2, VCO2, ייצור חום/אנרגיה (EE), יחס חילופי נשימה (RER) וערכי פעילות גופנית של X, Y, Z המתקבלים באמצעות הכלובים המטבוליים של מערכת CLAMS. VO2 ו- VCO2 המסופקים על ידי מערכת CLAMS הוא נפח הגז (mL) לדקה וניתן כבר לחלק אותו לפי משקל הגוף או ערכי המסה הרזה על ידי הזנת ערכי משקל אלה בתוכנת CLAMS לפני תחילת המדידות. עם זאת, אין להזין ערכי משקל גוף אם נצפים הבדלים במשקל הגוף בין קבוצות של עכברים, שכן יש צורך בניתוח ANCOVA ותוכנת Oxymax אינה יכולה לבצע חישובים אלה. ההוצאה האנרגטית (חום) מחושבת בקק"ל/שעה באמצעות משוואת לאסק. עכברים הם ליליים ומוציאים יותר אנרגיה במהלך התקופה הלילה / כהה, מה שאומר כי חישובי הוצאות אנרגיה צריך להיות מופרדים על פי מחזור האור. כצפוי, לעכברים במהלך השלב הכהה יש צריכת O2 גבוהה יותר, ייצור CO2, ולכן EE גבוה יותר, כפי שמוצג באיור 4C. עכברים בתזונה רגילה ובמצב הפד, עם בליעת מזון המתרחשת במחזור הכהה, מאופיינים בערכי RER קרוב ל-1 (איור 4D), כלומר העדפה לשימוש בפחמימות. במהלך מחזור האור, כאשר עכברים בעיקר לישון ולכן מהר, יש מעבר חמצון שומן, עם ערכי RER להיות קרוב יותר 0.7. בהתאם, הפעילות הגופנית, הנמדדת כשברי קרן הלייזר x,y,z נחשבים, עולה במהלך השלב הכהה ויורדת במהלך שלב האור (איור 4E).

השווינו עכברות בנות 16 שבועות שהאכילו דיאטה עתירת שומן (8 שבועות) לעכברים שניזונו מצ'או, מה שאפשר להשוות בין קבוצות של עכברים עם הבדלים במשקל הגוף. כצפוי, תזונה עתירת שומן מגבירה את מסת השומן מבלי לשנות את המסה הרזה (איור 5A-C). עכברים עתירי שומן הניזונים מתזונה אכלו יותר קק"ל ליום, בעיקר בשל צפיפות קלורית גבוהה יותר לגרם מזון (איור 5D). בנוסף, הפעילות הגופנית הייתה דומה בין צ'או, לבין עכברים עתירי שומן הניזונים מתזונה, אפילו בתקופה האפלה (איור 5E). הערכים הנמוכים יותר של RER מראים את ההעדפה של עכברים עתירי שומן הניזונים מתזונה להשתמש בשומן כמצע העיקרי לחמצון, כצפוי עם צריכת שומן גבוהה יותר ועמידות לאינסולין בשרירים (איור 5F). צריכת החמצן עולה בעכברים עתירי שומן הניזונים מתזונה, אך לא בייצור CO2 (איור 5G-H). העלייה בצריכת החמצן בעכברים עתירי שומן הניזונים מתזונה מלווה בעלייה משמעותית בייצור חום/הוצאות אנרגיה לעכבר (איור 5I). עם זאת, חלוקת ההוצאה האנרגטית במסה הרזה של כל עכבר לא הובילה להבדלים בהוצאות האנרגיה (איור 5J), בעוד חלוקה לפי משקל הגוף הכולל הראתה ירידה בהוצאות האנרגיה בעכברים עתירי שומן הניזונים מתזונה (איור 5K). במצטבר, תוצאות אלה מצביעות על כך חלוקת נתוני הוצאות אנרגיה על ידי מסה רזה או משקל גוף כולל יכול להוביל למסקנות הפוכות על ההשפעות של דיאטה עתירת שומן האכלה על הוצאות אנרגיה. כפי שהוצע על ידי מחקרים מרובים, ניתוח של covariance (ANCOVA) מאפשר לקבוע אם הבדלים בהוצאות האנרגיה קיימים ללא תלות בשינויים במשקל הגוף. כדי להמחיש נקודה זו, בוצע ניתוח ANCOVA באמצעות אותם נתונים המוצגים באיור 5A-K, כאשר ההוצאה האנרגטית היא המשתנה התלוי ומשקל הגוף או מסת רזה כמו הקובריאטים. בעת ביצוע ANCOVA באמצעות משקל גוף כולל כ covariate מראה רק מגמה עבור עכברים עתירי שומן המוזנים דיאטה יש הוצאה גבוהה יותר אנרגיה (איור 5L), העכברים דיאטה עתירת שומן להראות עלייה משמעותית בהוצאות האנרגיה כאשר מסת רזה משמש (איור 5M). נתונים אלה מראים כי שימוש במשקל גוף כולל כדי לבצע ניתוחי ANCOVA יכול להיות לזלזל בהוצאות האנרגיה4. הסיבות יכולות להיות כי: (1) רקמת שומן רק תורם ~ 5% מכלל ההוצאה האנרגטית ו -(2) הרווח של מסת שומן הנגרמת על ידי האכלת דיאטה עתירת שומן נובע בעיקר מהתרחבות של תוכן טריגליצריד אדיפוציטים, ולא מעלייה במספר אדיפוזיטים תרמוגניים חמצוניים.

אדיפוציטים חומים ובז ' (BA) תורמים התרמוגנזה וכתוצאה מכך להוצאות האנרגיה במכרסמים. תרומתו של BA להוצאות האנרגיה ב- vivo אינה יכולה להיקבע רק על ידי מדידת צריכת חמצן בכל הגוף וחישוב ה- BMR, שכן רקמות מרובות צורכות חמצן. הגישה לקביעת יכולת תרמוגנית BA ב vivo כרוך הרדמה ראשונה, אשר יש צורך להגביל את צריכת החמצן בכל הרקמות. אז הרדמה משולבת עם גישה פרמקולוגית להפעלת thermogenesis, בעיקר BA תרמוגני. כמו קולטני adrenergic בטא-3 באים לידי ביטוי בעיקר ברקמת שומן, אגוניסט בטא-3 אגרנרגית CL-316,243 יכול לשמש כדי להפעיל פונקציה תרמוגנית BA. בנוסף, העכברים המרדים ניתן להציב במתחם מבוקר טמפרטורה ב 30 °C (50 °F), כדי למנוע כל הפעלת BA אוהד בלתי מבוקר המושרה על ידי מתח תרמי סביבה. איור 6 מראה שעכברים האכילו דיאטה עתירת שומן שהורדמה מפנטוברביטל והונחה בכלובים המטבוליים ב-30 מעלות צלזיוס, כדי לרשום הוצאות אנרגיה בקצב חילוף החומרים התת-סטנדרטי (איור 6A-C,D). מדידה זו באה בעקבות הזרקת CL-316,243, שהעלתה את צריכת החמצן, ייצור הפחמן דו-חמצני והוצאת האנרגיה, כצפוי מהפעלת BA (איור 6A-C). ניתן לזהות עלייה של פי 2-3 בהוצאות האנרגיה בעקבות טיפול אגוניסטי בטא-37.

Figure 1
איור 1: הכלובים המטבוליים עם המתחם הסביבתי והרכבת כלובים מטבוליים בודדים. (א) הכלובים המטבוליים במתחם הסביבתי. (B) המתחם יכול לאכלס 12 כלובים מטבוליים ומאפשר שליטה בטמפרטורה ובאור. (ג) רכיבים של הכלובים המטבוליים לפני ההרכבה. (D) כלובים מטבוליים אטומים עם המכסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התקנה וכיול ניסיוניים של חיישן החמצן. (A) צילום מסך של תוכנת Oxymax השולטת בכלובים המטבוליים, המציגה בחירה ופתיחה של חלון "תצורה ניסיונית" כדי להגדיר את המאפיינים הניסיוניים (B), כלומר אור הסביבה והטמפרטורה. לאחר מכן, הניסוי מוגדר באמצעות (C) "התקנה ניסיונית" כדי להקצות מזהה עכבר, משקל גוף, או מסה רזה לכל כלוב, כמו גם את קצב זרימת האוויר עבור 12 הכלובים. (D) באותו חלון "התקנה ניסיונית", ניתן לבחור נתיב שמירת קבצים. (ה) כדי לכייל את חיישן הגז, המשתמש צריך לסובב את הידית בגלאי הגז (F) כדי להתאים את זהות O2 (G-H) ל- 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התחל והפסק את המדידות. (א) הניסוי מתחיל בלחיצה על "ניסוי", ואז על "רוץ". (B) המשתמשים יכולים לראות, בזמן אמת, איזה מבין 12 הכלובים נמדד כעת (מלבן אדום), כמו גם טבלה עם המדידות שכבר נאספו. (ג) ניתן לעצור את הניסוי על ידי לחיצה על "ניסוי", ואז על "עצור". (ד) ניתן לייצא את הנתונים ל- Excel על-ידי לחיצה על "קובץ", לאחר מכן על "ייצוא" ולאחר מכן "יצא את כל הנושאים CSV". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פרמטרים מטבוליים הושגו. (א) צריכת חמצן. (ב) ייצור CO2 . (ג) הוצאות אנרגיה (EE) מנורמלות למסה רזה. (ד) יחס חילופי נשימה (RER). (ה) רמות הפעילות הגופנית מחושבות כסכום של X, Y, Z קרן לייזר הפסקה נחשב. הנתונים מראים ממוצע ± מבחן t של סטודנט SEM, **P < 0.01, ***P < 0.001. n = 7-8 עכברות לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח ANCOVA מאפשר פרשנות מתאימה לשינויים בהוצאות האנרגיה בעכברים שמנים. (A-M) מדידות בעכברים נשיים האכילו או דיאטה עתירת שומן (HFD) במשך 8 שבועות. (א) משקל גוף. (ב) מסת שומן. (ג) מסה רזה. (ד) צריכת מזון. מבחן הסטודנט, < 0.001. (ה) פעילות גופנית הוערכה עם הכלובים המטבוליים כמו ספירות של שברי קרן לייזר X, Y, Z. (F) יחס מקדם הנשימה (RER). (ז) צריכת חמצן (VO2). (ח) ייצור CO2 (VCO2). (I) הוצאות האנרגיה (EE) נמדדו על ידי קלורימטריה עקיפה. הוצאות האנרגיה נרמלו (J) מסה רזה ו -(K) משקל גוף. *P < 0.05 באמצעות שתי ANOVA. **P< 0.01, ***P< 0.001. (L) ניתוח Covariate (ANCOVA) של הוצאות אנרגיה (EE) בלילה לעומת משקל גוף כולל או (M) מסת רזה. קווים מקווקווים מייצגים את ערכי משקל הגוף הממוצעים המעוצבים לקביעת VO2 ו- EE בכל קבוצה. *P < 0.05 באמצעות ANCOVA. n = 7-8 עכברות לכל קבוצה. הנתונים מציגים ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ה-β3-אגוניסט הסלקטיבי, CL-316,243 מגדיל באופן חריף את ההוצאה האנרגטית בעכברים מרדים בתרמונוטרליות. עכברים נקבות היו מרדים עם pentobarbital (60 מ"ג / קילוגרם) והונחו בכלובים המטבוליים להגדיר על 30 °C (50 °F). הוצאות האנרגיה בהרדמה נרשמו עד ש-3 מדידות רצופות הראו את אותם ערכים, המשקפים הרדמה מלאה. העכבר מכלוב #1 הוזרק עם CL-316,243 (1 מ"ג/ קילוגרם) מיד לאחר מדידת צריכת חמצן. אותה גישת הזרקה שימשה בכלובים האחרים כדי להבטיח כי באותו הזמן עבר בין הזרקה למדידה הראשונה בכל העכברים. (א) צריכת חמצן. (ב) ייצור CO2 . (ג) הוצאות אנרגיה. n = 4 עכברים נקבות. הנתונים מציגים ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: נוסחאות המשמשות את תוכנת Oxymax במערכת CLAMS לחישוב צריכת חמצן, ייצור CO2 והוצאות אנרגיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קלורימטריה עקיפה שימשה במשך שנים להערכת הוצאות האנרגיה של כל הגוף4. פרוטוקול זה המתואר כאן מספק שיטה פשוטה למדידת קצב חילוף החומרים של הבזל וקביעת יכולת תרמוגנית BA ב vivo באמצעות כלובים מטבוליים.

שיטת הקלורימטריה העקיפה המתוארת כאן מאשרת כי חלוקת ערכי הוצאות האנרגיה לפי ערכי משקל הגוף יכולה להטעות. לדוגמה, זה יכול להסיק כי ההוצאה על אנרגיה נמוכה באופן שיטתי בכל דגמי העכבר עם השמנת יתר. עם זאת, ההוצאה הכוללת על אנרגיה יכולה להיות גבוהה יותר במודלים מסוימים של עכברים של השמנת יתר, כמו במקרה של עלייה בצריכת המזון המובילה להשמנת יתר. לכן, חלוקת הוצאות האנרגיה על ידי מסת שומן תמיד תגרום לפרשנות שגויה של התהליך האחראי להשמנת יתר בעכברים שמנים ללא פגמים ראשוניים בהוצאות האנרגיה. בנוסף, חלוקה לפי מסה רזה אינה הולמת גם כאשר מתרחשים שינויים במסה רזה, שכן מסה רזה משתנה עם הוצאות האנרגיה, והוצאת האנרגיה יכולה להראות ירידה משמעותית יותר מכל שינוי במסה רזה. משמעות הדבר היא כי חלוקת ההוצאה האנרגטית לפי משקל גוף או מסת רזה יכולה להתבצע רק אם לא נצפו שינויים במשקל הגוף או בהרכב הגוף (כלומר, מסת רזה ומסת שומן) בין הקבוצות שנבדקו. כתוצאה מכך, הגישה הבטוחה ביותר היא לבצע ANCOVA. נושא זה נדון בהרחבה במאמרים מצוינים, כולם הגיעו לסיכום כי ניתוח של covariance (ANCOVA) חיוני כדי להשוות את ההוצאה האנרגטית בין קבוצות של עכברים עם הבדלים במשקל הגוף הכולל או מסה רזה 4,5. כאן, SigmaPlot שימש לביצוע ניתוחי ANCOVA בתוך הבית, אך ניתן להשתמש בתוכנות ניתוח סטטיסטיות מתקדמות רבות אחרות. אתר CalR מאפשר להעלות נתונים באחת התבניות שלהם, אך ייתכן שלא תמיד יהיה אפשרי בהתאם לעיצוב הניסיוני5. לאחר תוכנה סטטיסטית כדי לבצע את ANCOVA "בתוך הבית" מציע גמישות רבה יותר על ניתוח נתונים ומצגת, אבל זה יותר זמן רב6.

תרמונוטרליות לעכברים היא סביב 30 °C (70 °F), אשר מדכא את הפעילות של חום תרמוגנית ובז 'אדיפוציטים (BA)1. טמפרטורת הסביבה (21 °C )C) היא מתחת התרמונו-אוטרליות, כלומר תרמוגנזה BA יתרום להוצאות האנרגיה בעכברים השוכן ב 21 °C (70 °F). אז, ההבדל בהוצאות האנרגיה בין עכברים בטמפרטורת הסביבה לעומת. עכברים ב thermoneutrality ניתן להשתמש כדי לקבוע את התרומה של BA להוצאות אנרגיה באופן פחות פולשני. עם זאת, הליך זה דורש שימוש מתמשך של המתחם ב 30 °C (30 °F) במשך 4 שבועות, עם thermoneutrality גם גרימת הבדלים בפעילות גופנית. בנוסף, תרמונוטרליות גורמת לשינויים מטבוליים ברקמות אחרות, לא רק ב- BA. בהקשר שבו המטרה העיקרית היא ללמוד שינויים ביכולת תרמוגנית BA, הגישה הפרמקולוגית המתוארת כאן יש רשימה של יתרונות על פני עכברי דיור ב thermoneutrality על פני תקופה ארוכה.

התוצאות מתקבלות בעוד מספר שעות, וההרדמה מדכאת את תרומת הפעילות הגופנית ושינויים התנהגותיים אחרים בהוצאות האנרגיה. בעת הערכת ההשפעות של מניפולציות גנטיות בעכברים, חילוף החומרים עשוי להשתנות BA ורקמות אחרות. לפיכך, טיפול CL-316,243 בעכברים מרדים הוא הגישה שיכולה להבחין בשינויים בפעילות BA עם טווח דינמי גבוה יותר וספציפיות, עם פחות מבלבלים מהוצאות האנרגיה הנובעות מרקמות אחרות. לחלופין, CL-316,243 יכול להיות מוזרק בעכברים מודעים כמו המערכת יכולה למדוד פעילות גופנית. לכן, אם מתרחש שינוי בפעילות הגופנית, ניתן להעריך אותו ולשלוט בו5. לסיכום, בעוד הרדמה יכולה לספק את הטווח הדינמי הגבוה ביותר, מדידות ניתן לעשות ללא הרדמה במידת הצורך, כמו פעילות גופנית ניתן לפקח.

בעת שימוש בכלובים חילוף החומרים, יש לנקוט זהירות לגבי מתח עכברים, והתאוששות נכונה יש צורך. הבידוד החברתי של דיור בודד והסביבה החדשה של הכלוב המטבולי מלחיצים את העכברים, וכתוצאה מכך ירידה בצריכת המזון וירידה במשקל. לכן, צריכת מזון ומשקל הגוף צריך להיות במעקב כל 24 שעות. עכברים לשחזר צריכת מזון נורמלית 48-72 שעות לאחר הצבתם לתוך הכלוב המטבולי. כתוצאה מכך, מדידות כיול וצריכת חמצן מתחילות כאשר צריכת המזון מתאוששת. למרות מערכת הכלובים המטבוליים להיות על, כיול ואמצעים אינם מבוצעים במהלך תקופת התאקלמות זו, כמו בהגדרה, BMR חייב להיות מושגת בעכבר ללא מתח. הימנעות ממדידות בתקופה זו מגדילה את תוחלת החיים של הגלאי ומפחיתה את השימוש והצריכה של Drierite (אשר לוכד מים כדי למנוע נזק גלאי חמצן). מערכות חדשות ויקרות יותר השתמשו במדידות ביתיות המבוססות על כלוב, מה שמפחית את הלחץ.

ניתוחי ANCOVA
ANCOVA (ניתוח של covariance) נדרש בעת השוואת הוצאות אנרגיה בין שתי קבוצות של עכברים עם הבדלים במשקל הגוף4. הסיבה לכך היא שגידול במסה רזה יגדיל את הוצאות האנרגיה. ANCOVA בודק אם ההוצאה על אנרגיה משתנה באופן מובהק סטטיסטית בין קבוצות, ללא תלות בהבדלים במשקל הגוף ובמסה רזה. ANCOVA משיג את זה על ידי קביעת אם ההוצאה על אנרגיה שונה אם לשתי הקבוצות היה אותו משקל גוף או מסת רזה. עם זאת, כדי לחשב את הוצאות האנרגיה באותו משקל גוף / מסת רזה באמצעות ANCOVA, המתאם בין covariate (משקל גוף / מסת רזה) לבין המשתנה (הוצאות אנרגיה) חייב להיות דומה בין קבוצות. הדמיון של מתאם זה נבחן באמצעות המבחן של לוין לשוויון שונות5.

ANCOVA דורשת שימוש בתוכנת ניתוח סטטיסטית מתקדמת יותר, כגון SigmaPlot. לחלופין, ניתן להשתמש באתרים שונים בחינם5. אם ANCOVA מראה כי ההשפעה שנצפתה בין קבוצות אינה תלויה בערך של covariate (משקל גוף / מסת רזה), התוכנה תבדוק אם הממוצע של המשתנה (הוצאות אנרגיה, VO2, VCO2) שונה בין הקבוצות ב covariate דומה (משקל גוף / מסת רזה). התוכנה תציע לבצע השוואות מרובות עם מבחן סטטיסטי מוצע. אם תושג משמעות סטטיסטית, היא תאשר כי ההוצאה האנרגטית שונה באופן משמעותי בין שתי קבוצות העכברים בכל ערך משקל גוף נתון. משוואת הרגרסיה עבור מודל השיתפונות השווה ניתן להשיג מהניתוח, שניתן להשתמש בו ב- GraphPad או בתוכנה גרפית אחרת כדי ליצור גרף עבור publication6.

שינויים ופתרון בעיות
מערכת CLAMS המשמשת בפרוטוקול זה נוצרת על ידי כלובים קטנים השונים מאוד מכלובים ביתיים שעכברים רגילים, הכוללים מצעים. בנוסף, עכברים הם בעלי חיים חברתיים, והצורך לשכן אותם בנפרד, יחד עם כלוב חדש ללא מצעים, גורם ללחץ ראשוני לעכברים. לכן, יש צורך בהסתגלות של יומיים לפחות כדי לאפשר לעכברים להסתגל לסביבות החדשות שלהם ולהפחית את הלחץ. בדרך כלל, צריכת המזון חוזרת למה שנרשם בכלובי הבית שלהם ביום השלישי. תקופת התאקלות זו מיותרת כדי להעריך את יכולת BA להוציא אנרגיה, כפי שהוא מבוצע בעכברים מרדים.

Pentobarbital הוא ברביטורט קצר טווח שיכול לשמש כסוכן הרגעה או הרדמה, אבל הוא משמש גם המתת חסד במינונים גבוהים יותר. מסיבה לא ידועה, זה היה לפעמים הבחין כי היעילות של pentobarbital ב 30 °C (50 °F) שונה מאשר בטמפרטורת הסביבה. לכן, מומלץ לבדוק מינונים שונים פנטוברביטל במודל העכבר ב thermoneutrality. ההשפעות השליליות העיקריות של pentobarbital כוללים דיכאון נשימתי, השפעות לב וכלי דם, כגון לחץ דם מופחת, נפח שבץ, תת לחץ דם8.

מגבלות
קולטני בטא3-adrenergic באים לידי ביטוי ברקמת שומן וניתן לזהות בשריר הלב, רשתית, כיס המרה, המוח, שתן השתן, וכלי הדם9. ככזה, CL-316,243 יכול להגדיל את הוצאות האנרגיה ברקמות אחרות אלה שבהן הקולטן בא לידי ביטוי. עם זאת, הוכח כי רוב ההוצאה האנרגטית הנגרמת על ידי CL-316,243 בעכברים בקרה היא תלוי UCP-1, חלבון ספציפי BA10,11. יש לקחת בחשבון כי כמה שינויים גנטיים עלול להחמיר את הפעולות של CL-316,243 ברקמות אחרות. בנוסף, השבר של נשימה עצמאית UCP1 עדיין יכול להיות מונע על ידי ATP לצרוך מחזורים חסרי תועלת המתוארים ברקמת שומן פעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים לנייר פרוטוקול זה. M.L. הוא מייסד שותף ויועץ עבור Enspire Bio LLC.

Acknowledgments

ML ממומן על ידי המחלקה לרפואה באוניברסיטת קליפורניה, מענקי פיילוט מ P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) ו P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CLAMS-Oxymax System Columbus Instruments CLAMS-center feeder-ENC Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software HP/Columbus N/A PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) Fisher Scientific 23-116681 Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition Echo-MRI Echo-MRI 100 Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243 Sigma C5976 Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet Research Diets D12266B Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal Pharmacy at DLAM N/A Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator) Praxair NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
  3. Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
  4. Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
  5. Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
  6. Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
  7. Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
  8. Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
  9. Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
  10. Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
  11. Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).

Tags

ביולוגיה גיליון 177
קביעת ההוצאה על אנרגיה בזלית והקיבולת של אדיפוציטים תרמוגניים להוצאות אנרגיה בעכברים שמנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M.More

Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M. Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice. J. Vis. Exp. (177), e63066, doi:10.3791/63066 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter