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Biology

Determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos

Published: November 11, 2021 doi: 10.3791/63066
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4
1Department of Molecular Medicine, Faculty of Medicine, Universite Laval, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Molecular Biology Institute at UCLA

Summary

Este manuscrito describe un protocolo para medir la tasa metabólica basal y la capacidad oxidativa de los adipocitos termogénicos en ratones obesos.

Abstract

Las mediciones del gasto de energía son necesarias para comprender cómo los cambios en el metabolismo pueden conducir a la obesidad. El gasto de energía basal se puede determinar en ratones midiendo el consumo de oxígeno de todo el cuerpo, la producción de CO2 y la actividad física utilizando jaulas metabólicas. Los adipocitos termogénicos de color marrón/beige (BA) contribuyen significativamente al gasto energético de los roedores, particularmente a bajas temperaturas ambientales. Aquí, las mediciones del gasto de energía basal y la capacidad total de BA para gastar energía en ratones obesos se describen en dos protocolos detallados: el primero explica cómo configurar el ensayo para medir el gasto de energía basal utilizando el análisis de covarianza (ANCOVA), un análisis necesario dado que el gasto de energía covaria con la masa corporal. El segundo protocolo describe cómo medir la capacidad de gasto de energía de BA in vivo en ratones. Este procedimiento implica anestesia, necesaria para limitar el gasto causado por la actividad física, seguido de la inyección del agonista beta3-adrenérgico, CL-316,243, que activa el gasto de energía en BA. Estos dos protocolos y sus limitaciones se describen con suficiente detalle para permitir un primer experimento exitoso.

Introduction

El metabolismo se puede definir como la integración de las reacciones bioquímicas responsables de la absorción, almacenamiento, transformación y descomposición de nutrientes que las células utilizan para crecer y realizar sus funciones. Las reacciones metabólicas transforman la energía contenida en los nutrientes en una forma que puede ser utilizada por las células para sintetizar nuevas moléculas y ejecutar el trabajo. Estas reacciones bioquímicas son inherentemente ineficientes para transformar esta energía en una forma utilizable para sostener la vida1. Tal ineficiencia resulta en la disipación de energía en forma de calor, y esta producción de calor se utiliza para cuantificar la tasa metabólica estándar (SMR) de un organismo1. La condición estándar se definió clásicamente como la producción de calor que ocurre en un adulto despierto pero en reposo, que no ingiere ni digiere alimentos, en termoneutralidad y sin ningún tipo de estrés1. La tasa metabólica basal (TMB) o el gasto de energía basal en ratones se conoce como SMR, pero en individuos que ingieren y digieren alimentos bajo estrés térmico leve (temperatura ambiente 21-22 ° C)1. Los desafíos y dificultades de medir directamente la producción de calor hicieron que la calorimetría indirecta, es decir, el cálculo de la producción de calor a partir de las mediciones de consumo de oxígeno, se convirtiera en el enfoque más popular para determinar la TMB. Calcular la TMB a partir del consumo de oxígeno es posible porque la oxidación de nutrientes por parte de las mitocondrias para sintetizar ATP es responsable del 72% del oxígeno total consumido en un organismo, con un 8% del consumo total de oxígeno que también ocurre en las mitocondrias pero sin generar ATP (respiración desacoplada)1. La mayoría del 20% restante del oxígeno consumido se puede atribuir a la oxidación de nutrientes en otras ubicaciones subcelulares (oxidación de ácidos grasos peroxisomales), procesos anabólicos y formación de especies reactivas de oxígeno1. Así, en 1907, Lusk estableció una ecuación, basada en mediciones empíricas, ampliamente utilizada para transformar el consumo de oxígeno y la producción de CO2 en disipación de energía en forma de calor. En los seres humanos, el cerebro representa ~ 25% de la TMB, el sistema musculoesquelético para ~ 18.4%, el hígado para ~ 20%, el corazón para ~ 10% y el tejido adiposo para ~ 3-7%2. En ratones, la contribución del tejido a la TMB es ligeramente diferente, con el cerebro representando ~ 6.5%, el músculo esquelético ~ 13%, el hígado ~ 52%, el corazón ~ 3.7% y el tejido adiposo ~ 5%3.

Sorprendentemente, las reacciones bioquímicas que definen la TMB no son fijas y cambian en respuesta a diferentes necesidades, como el trabajo externo (actividad física), el desarrollo (crecimiento de tejidos), las tensiones internas (contrarrestar infecciones, lesiones, renovación de tejidos) y los cambios en la temperatura ambiente (defensa contra el frío)1. Algunos organismos reclutan activamente procesos para generar calor en la exposición al frío, lo que implica que el calor producido por el metabolismo no es solo un subproducto accidental. En cambio, la evolución seleccionó mecanismos reguladores que podrían regular específicamente la producción de calor al cambiar la tasa de reacciones metabólicas1. Por lo tanto, estas mismas mediciones de consumo de oxígeno se pueden utilizar para determinar la capacidad de un organismo para generar calor en respuesta al frío.

Dos procesos principales contribuyen a la generación de calor tras la exposición al frío. El primero es el escalofrío, que genera calor al aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial y la glucólisis en el músculo para cubrir el trabajo físico realizado por la contracción muscular involuntaria. Por lo tanto, la exposición al frío aumentará el consumo de oxígeno en los músculos1. El segundo es la termogénesis no temblorosa, que se produce a través de un aumento en el consumo de oxígeno en los adipocitos marrón y beige (BA). La disipación de energía en calor en BA está mediada por la proteína de desacoplamiento mitocondrial 1 (UCP1), que permite la reentrada de protones en la matriz mitocondrial, disminuyendo el gradiente de protones mitocondriales. La disipación del gradiente de protones mitocondrial por UCP1 aumenta la producción de calor por la elevación en la transferencia de electrones y el consumo de oxígeno y la energía liberada por disipación de protones per se sin generar ATP (desacoplado). Además, el BA termogénico puede reclutar mecanismos adicionales que elevan el consumo de oxígeno sin causar una gran disipación en el gradiente de protones, activando ciclos inútiles de síntesis y consumo de ATP oxidativo. Las jaulas metabólicas descritas aquí, a saber, el sistema CLAMS-Oxymax de Columbus Instruments, ofrecen la posibilidad de medir el gasto de energía a diferentes temperaturas ambientales. Sin embargo, para determinar la capacidad termogénica de BA utilizando mediciones de consumo de oxígeno de todo el cuerpo, se necesita: (1) eliminar la contribución de los escalofríos y otros procesos metabólicos no BA al gasto de energía, y (2) activar específicamente la actividad termogénica de BA in vivo. Por lo tanto, un segundo protocolo describe cómo activar selectivamente ba in vivo utilizando farmacología en ratones anestesiados a termoneutralidad (30 ° C), con anestesia y termoneutralidad limitando otros procesos termogénicos no BA (es decir, actividad física). La estrategia farmacológica para activar el BA es tratar ratones con el agonista del receptor β3-adrenérgico CL-316,246. La razón es que la exposición al frío promueve una respuesta simpática liberando norepinefrina para activar los receptores β-adrenérgicos en BA, que activa la UCP1 y la oxidación de grasas. Además, la expresión del receptor β3-adrenérgico está altamente enriquecida en el tejido adiposo en ratones.

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Protocol

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA). A los ratones se les administró su dieta y agua ad libitum en la jaula metabólica, alojada en un ambiente de temperatura controlada (~ 21-22 o 30 ° C) con un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas. Para este estudio se utilizaron ratones hembra de 8 semanas de edad alimentados con una dieta alta en grasas o dieta chow durante 8 semanas.

1. Medición de la tasa metabólica basal (TMB)

  1. Mida el peso corporal total del ratón utilizando una báscula de peso con una precisión en el rango de 0,1 g.
    NOTA: Esto debe hacerse antes de alojar a los ratones en jaulas metabólicas y después de los 2-3 días del período de aclimatación a las jaulas metabólicas.
  2. Mida la composición corporal, incluida la grasa y la masa magra en ratones no anestesiados, utilizando un sistema de análisis de composición corporal apropiado (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Estas mediciones son necesarias para determinar el gasto de energía y se ejecutan en paralelo a las mediciones del peso corporal total (paso 1.1).
  3. Configure las jaulas metabólicas y comience el período de aclimatación.
    NOTA: El sistema de jaulas metabólicas incluye un recinto que permite al usuario controlar la temperatura y la luz de la carcasa de 12 jaulas (Figura 1A, B). Cada jaula tiene una botella de agua, un comedero y una rejilla (Figura 1C). La rejilla separa el ratón de la parte inferior de la jaula, lo que permite la recolección de heces. Una vez que la jaula está instalada en cada espacio predeterminado, una tapa que sella la jaula incluye la ranura de la botella de agua, el tubo de muestreo de aire, el sistema de flujo de aire y el sensor de actividad física (Figura 1D).
    1. Encienda la carcasa de temperatura, el sistema de flujo de aire y la computadora 2 h antes de comenzar el ensayo.
    2. Después de 2 h, abra el software que controla la carcasa (consulte la Tabla de materiales) y el flujo de aire y deje que el software pruebe la comunicación de la computadora con el equipo.
      NOTA: Para el presente trabajo se utilizó el software Oxymax.
    3. Una vez establecida la comunicación, haga clic en Archivo, luego en Abrir configuración del experimento (Figura 2A) y seleccione la configuración del experimento prediseñada por el proveedor (o configurada a partir de un ensayo anterior).
    4. Haga clic en Experimento, luego haga clic en Propiedades, que abrirá la ventana Propiedades del experimento (Figura 2B).
    5. En la ventana Propiedades, configure los parámetros del recinto ambiental, incluidos los ciclos de temperatura ambiente (21 °C) y 12 h.
      NOTA: Mantener el software abierto y en funcionamiento permite que el aire fluya hacia las jaulas y el recinto para mantener la temperatura y los ciclos de luz seleccionados. Por lo tanto, todo el sistema puede funcionar con ratones dentro de las jaulas durante varios días, incluso sin medir oxígeno y CO2.
    6. Haga clic en Experimento, luego haga clic en Configuración y se abrirá la ventana Configuración del experimento , donde se definen los parámetros de cada jaula metabólica.
    7. Asigne cada ID de ratón a la jaula individual donde se aloja el ratón (Figura 2C).
    8. Incluya la masa magra o el peso corporal total de cada ratón solo si no se observan diferencias en el peso corporal entre los grupos.
      NOTA: La obtención de valores brutos de consumo de oxígeno y gasto energético facilita los análisis de ANCOVA.
    9. Ajuste la tasa de flujo de aire a la jaula metabólica en 0.5-0.6 L / min.
    10. En la ventana Configuración del experimento, seleccione la ruta de acceso y el nombre de guardado del archivo. Seleccione el directorio de copia de seguridad (Figura 2D).
    11. Agregue una cantidad preponderada de alimentos a los comederos que cubra al menos la ingesta de alimentos durante 1 día.
      NOTA: Si las jaulas tienen escamas integradas, la comida se puede agregar directamente y el software la registrará.
    12. Añadir las botellas de agua. Compruebe que el frasco esté sellado correctamente y no tenga fugas.
    13. 24 h después de agregar la comida, pesar la comida que queda en la jaula.
      NOTA: Los gramos de comida agregada menos los gramos de comida restantes medirán la ingesta de alimentos.
    14. Comience las mediciones de oxígeno, CO2 y actividad (paso 1.4.10) una vez que los valores de ingesta de alimentos sean los mismos que los de los ratones alojados en jaulas regulares.
      NOTA: Aquí, se completa el período de aclimatación (generalmente 2-3 días) y pueden comenzar las mediciones de gasto de energía.
  4. Calorimetría indirecta y mediciones de actividad para evaluar el gasto energético
    1. Mida el peso corporal, la grasa y la masa magra de todos los ratones antes de comenzar las mediciones.
      NOTA: Estos son los valores de peso corporal y masa magra utilizados para realizar los análisis de ANCOVA.
    2. Calibrar el detector basado en zirconia de O2 y CO2 del sistema CLAMS (ver Tabla de Materiales) con la concentración de oxígeno recomendada; siempre vuelva a calibrar el detector antes de comenzar un nuevo experimento.
    3. Utilizar un gas de calibración de composición conocida (20,50% de oxígeno y 0,50% de CO2).
      NOTA: Los proveedores de gas a menudo se refieren a este gas como "Grado estándar primario".
    4. Encienda y asegúrese de que la presión de salida del tanque sea de 5-10 psi.
    5. Abra el software de la Utilidad de calibración para calibrar y probar los sensores de gas (Figura 2E). Haga clic en Experimentar y, a continuación, en Calibrar.
    6. Pulse Inicio. Luego, espere a que se prueben los sensores y a que el software le pida al usuario que gire las perillas del sensor de gas (Figura 2F) hasta que el valor de la identidad de O2 sea 1 (Figura 2G-H). Haga clic en Siguiente cuando se complete el paso.
      NOTA: Si la Utilidad de calibración realiza todos los pasos actuales, la calibración pasará automáticamente al siguiente paso cuando se llene la barra de progreso.
    7. Verifique los resultados de la calibración cuando se hayan completado todos los pasos y se presenten los resultados.
    8. Apague el gas de calibración.
    9. Cambie los alimentos y agregue suficiente comida durante un período de 48-72 h.
      NOTA: Aunque las jaulas podrían abrirse durante las mediciones de gasto de energía para controlar el peso corporal y cambiar los alimentos diariamente, los ratones pueden estresarse por estas manipulaciones, y las mediciones se pierden cuando se abren las jaulas. Por lo tanto, se recomienda evitar cualquier manipulación durante el período de medición.
    10. En el software, haga clic en Experimento y luego en Ejecutar para iniciar las mediciones de oxígeno, CO2 y actividad (Figura 3A).
      NOTA: La ejecución de las mediciones se puede rastrear en tiempo real en un cuadro ubicado en la sección inferior izquierda del software (rectángulo rojo, Figura 3B). El rectángulo rojo de la Figura 3B muestra que el sistema mide la jaula #1 en el intervalo #3, es decir, la 3ª medición. Una medición en una jaula puede tomar aproximadamente 1 minuto. Así, con 12 jaulas conectadas, el consumo de oxígeno se puede medir aproximadamente cada 12 min. Se recomiendan mediciones continuas durante un mínimo de 48 h.
    11. Detenga el experimento haciendo clic en Experimento y, a continuación, en Detener (Figura 3C).
    12. Abra las jaulas, pese a los ratones y la comida. Recolecte las heces para calcular el número de calorías y lípidos excretados durante el período de medición de 48-72 h.
      NOTA: Las heces se pueden almacenar a -20 °C para análisis posteriores. Estas jaulas no se pueden usar de manera efectiva para recolectar orina.
    13. Haga clic en Experimentos, luego en Exportar y Exportar todos los temas como un archivo CSV (Figura 3D).
      NOTA: Para facilitar los análisis de ANCOVA, es esencial exportar los valores de consumo de oxígeno bruto (VO2) y producción de CO2 (VCO2) sin ser normalizados por el peso corporal.
  5. Análisis de datos y control de calidad
    1. En la hoja CSV exportada (Figura 3D) (del paso 1.4.13), utilice los valores brutos del consumo de oxígeno (VO2) y la producción de CO2 (VCO2) medidos cada 12 minutos en el período de 2-3 días que el software enumera automáticamente e incluya una marca de tiempo, es decir, la hora y la fecha en que se midieron.
      NOTA: Los valores de VO2 y VCO2 se corregirán automáticamente si se agregan valores de peso corporal o masa magra.
    2. En la hoja CSV exportada, utilice los valores brutos de la relación de intercambio respiratorio (RER: VCO2/VO2) que el software calcula y enumera automáticamente de acuerdo con su marca de tiempo.
      NOTA: Los valores cercanos a 1 muestran que el ratón oxida principalmente los carbohidratos, mientras que los valores más cercanos a 0,7 representan que el ratón está oxidando principalmente la grasa. EL RER por encima de 1 puede ocurrir durante el ejercicio anaeróbico, ya que el cuerpo expulsa más CO2 para compensar la acidosis causada por el lactato. RER superior a 1 puede indicar estrés. El archivo CSV exportado también contiene los valores brutos del gasto de energía (EE) o la producción de calor en calorías por minuto por ratón, medidos cada 12 minutos en los 2-3 días. Aquí, todos los valores enumerados incluyen una marca de tiempo.
    3. Como se necesitan valores únicos de EE por ratón para un ANCOVA, promedie los valores de EE registrados entre las 09:00-16:00 para la fase de luz (día) y las 19:00-04:00 para la fase oscura (nocturna) por ratón y día.
      NOTA: Esto se puede hacer manualmente usando Excel o Graph Pad. La selección de estas ventanas de dos tiempos evita promediar los valores de EE intermedios, graduales e inestables asociados con la transición de fase claro-oscuro.
    4. Durante un período de 48 horas, calcule el promedio de los dos valores de luz diurna y los dos valores de fase oscura por mouse usando Excel o Graph Pad.
    5. Para cuantificar la actividad física total, use Excel o Graph Pad para sumar los recuentos de rotura de haz x, y y z medidos en las jaulas metabólicas y enumerados en el archivo CSV para cada mouse.
      NOTA: La actividad total x, y, z se calcula haciendo primero el valor promedio de cada X, Y, Z por mouse y ciclo. Luego, se determina la suma de cada valor promedio X, Y, Z por ratón y ciclo para trazar los datos como en la Figura 5E (siendo el promedio de 2 días).
    6. Alternativamente, represente los datos que muestran cada valor de medición a lo largo del tiempo, lo que genera curvas que ilustran los cambios en EE durante la transición de los ciclos de luz a oscuridad.
      NOTA: Consulte la sección de discusión sobre cómo y cuándo realizar los análisis de ANCOVA, y las diferentes fórmulas utilizadas para calcular el VO2, VCO2 y EE se proporcionan en el Archivo Complementario 1.

2. Medición de la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía

  1. Configure las mediciones y los tratamientos con ratones. Consulte el paso 1 para obtener detalles sobre las preparaciones experimentales para controlar el consumo de oxígeno, ya que la capacidad termogénica en los adipocitos se determina indirectamente por el consumo de oxígeno siguiendo los pasos 2.1.1-2.2.2.
    NOTA: Este protocolo requiere anestesia en ratones y tratamiento agudo con el agonista del receptor beta-3 CL-316,243 (ver Tabla de Materiales), dando una evaluación rápida de la capacidad termogénica ba.
    1. Realizar análisis de composición corporal y pesar los ratones. Encienda las ALMEJAS, configure la temperatura a 30 °C (termoneutralidad) y espere 2 h a que todo el sistema se caliente.
    2. Configure el resto de las condiciones del ensayo, incluida la luz, asigne id de ratón a cada jaula y agregue el valor de peso corporal de cada ratón en la jaula correspondiente si no se observa ninguna diferencia en el peso corporal entre los grupos.
    3. Calibre el detector de oxígeno/CO2 como en los pasos 1.4.2-1.4.7.
    4. Inicie el experimento en el software.
    5. Inyecte a cada ratón pentobarbital (60-120 mg/kg) y coloque a cada ratón en su jaula metabólica asignada (paso 2.1.2).
      NOTA: La dosis de pentobarbital requerida para mantener a los ratones dormidos a la termoneutralidad (30 °C) varía con la cepa y el genotipo del ratón. Se recomienda probar diferentes dosis de pentobarbital de 50 a 120 mg/kg y elegir la que mantenga al ratón anestesiado durante 2-3 h a 30 °C. La anestesia eficiente es esencial para eliminar la contribución de la actividad física al gasto energético.
    6. Para asegurar la anestesia, observe a los ratones después de la inyección de pentobarbital hasta que estén completamente dormidos y sus tasas de consumo de oxígeno disminuidas se vuelvan constantes.
    7. Espere a obtener al menos 3 tasas de consumo de oxígeno consecutivas estables antes de inyectar CL-316,243.
      NOTA: Mientras espera la estabilización del consumo de oxígeno, prepare las jeringas con CL-316,243 para cada ratón (1 mg/kg).
    8. Abra la jaula # 1 e inyecte CL-316,243 por vía subcutánea inmediatamente después de que se produjo una medición de VO2 y VCO2 en la jaula # 1. Devuelva el ratón a la jaula #1 inmediatamente después de la inyección.
      NOTA: Las mediciones se indican en tiempo real en la sección inferior izquierda del software (Figura 3B, rectángulo rojo).
    9. Espere a que se mida la jaula # 2 (Figura 3B, rectángulo rojo) y luego continúe como en el paso 2.1.8 para la jaula # 2.
      NOTA: La inyección de CL-316,243 inmediatamente después de una medición permite mantener el tiempo constante entre inyecciones. Por ejemplo, si hay 12 ratones / jaulas en funcionamiento, con mediciones recopiladas en jaulas individuales secuencialmente y la colección que dura 55 s por jaula, entonces debe inyectar un ratón cada minuto. Con estas tasas de inyección, la primera medición ocurrirá después de 12 minutos después de la inyección en las 12 jaulas.
    10. Continúe las mediciones de gasto de energía hasta que los valores de gasto de energía se estabilicen durante 5-6 mediciones consecutivas, generalmente 90-180 minutos después de la inyección.
      NOTA: Los ratones podrían despertarse de la anestesia durante los experimentos. Estos ratones deben ser retirados del análisis. Por lo tanto, probar las dosis de pentobarbital de antemano aumentará la eficiencia de los estudios.
    11. Detenga las mediciones de gasto de energía, pero mantenga a los ratones en sus jaulas a 30 ° C, hasta que se despierten.
    12. Después de que los ratones estén completamente despiertos, inspeccione la salud de los ratones y devuélvalos a sus jaulas iniciales.
    13. Exporte los datos de cada ratón como un archivo CSV utilizando el software del equipo, tal como se describe en la sección 1.4.13.
  2. Análisis de datos
    NOTA: El análisis de los datos fue realizado por Excel o Graphpad
    1. Trazar los 3-5 valores consecutivos de VO2, VCO2 y EE que son estables y constantes en el tiempo, ya que estos son los valores que representan la tasa metabólica cuando los ratones están completamente anestesiados.
    2. A continuación, trace la primera y las siguientes mediciones consecutivas de VO2, VCO2 y EE obtenidas después de la inyección.
      NOTA: Los valores absolutos de EE y el aumento de pliegue en EE inducido por inyección indican la función termogénica ba7.

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Representative Results

La Figura 4 muestra los valores de ACTIVIDAD física VO2, VCO2, Producción de calor/Gasto de energía (EE), Relación de Intercambio Respiratorio (RER) y X, Y, Z obtenidos utilizando las jaulas metabólicas del sistema CLAMS. El VO2 y VCO2 proporcionados por el sistema CLAMS es el volumen de gas (ml) por minuto y ya se puede dividir por el peso corporal o los valores de masa magra ingresando estos valores de peso en el software CLAMS antes de comenzar las mediciones. Sin embargo, no se deben introducir valores de peso corporal si se observan diferencias en el peso corporal entre grupos de ratones, ya que se necesita el análisis ANCOVA y el software Oxymax no puede realizar estos cálculos. El gasto de energía (calor) se calcula en kcal/h utilizando la ecuación de Lusk. Los ratones son nocturnos y gastan más energía durante el período nocturno / oscuro, lo que significa que los cálculos de gasto de energía deben separarse de acuerdo con el ciclo de luz. Como era de esperar, los ratones durante la fase oscura tienen un mayor consumo de O2 , producción de CO2 y, por lo tanto, mayor EE, como se muestra en la Figura 4C. Los ratones con una dieta regular y en estado alimentado, con ingestión de alimentos que ocurre en el ciclo oscuro, se caracterizan por valores de RER cercanos a 1 (Figura 4D), lo que significa una preferencia por usar carbohidratos. Durante el ciclo de luz, cuando los ratones duermen principalmente y, por lo tanto, rápido, hay un cambio a la oxidación de la grasa, con valores de RER más cercanos a 0.7. En consecuencia, la actividad física, medida como x, y, z laser beam break counts, aumenta durante la fase oscura y disminuye durante la fase de luz (Figura 4E).

Comparamos ratones hembra de 16 semanas de edad alimentados con una dieta alta en grasas (8 semanas) con ratones alimentados con chow, lo que permitió la comparación del gasto de energía entre grupos de ratones con diferencias en el peso corporal. Como era de esperar, la alimentación dietética alta en grasas aumenta la masa grasa sin cambiar la masa magra (Figura 5A-C). Los ratones alimentados con dieta alta en grasas comieron más Kcal / día, principalmente debido a una mayor densidad calórica por gramo de alimento (Figura 5D). Además, la actividad física fue similar entre el chow y los ratones alimentados con dieta alta en grasas, incluso durante el período oscuro (Figura 5E). Los valores más bajos de RER muestran la preferencia de los ratones alimentados con dieta alta en grasas para usar grasa como sustrato primario para la oxidación, como se esperaba con una mayor ingesta de grasas y resistencia a la insulina muscular (Figura 5F). El consumo de oxígeno aumenta en ratones alimentados con dieta alta en grasas, pero no la producción de CO2 (Figura 5G-H). El aumento en el consumo de oxígeno en ratones alimentados con dieta alta en grasas se acompaña de un aumento significativo en la producción de calor / gasto de energía por ratón (Figura 5I). Sin embargo, dividir el gasto de energía por la masa magra de cada ratón no condujo a diferencias en el gasto de energía (Figura 5J), mientras que dividir por el peso corporal total mostró una disminución en el gasto de energía en ratones alimentados con dieta alta en grasas (Figura 5K). Acumulativamente, estos resultados indican que dividir los datos de gasto de energía por la masa magra o el peso corporal total puede llevar a conclusiones opuestas sobre los efectos de la alimentación de dieta alta en grasas sobre el gasto de energía. Como sugieren múltiples estudios, el análisis de covarianza (ANCOVA) permite determinar si existen diferencias en el gasto energético independientemente de los cambios en el peso corporal. Para ilustrar este punto, se realizó un análisis ANCOVA utilizando los mismos datos mostrados en la Figura 5A-K, siendo el gasto energético la variable dependiente y el peso corporal o masa magra como las covariables. Mientras que la realización de ANCOVA utilizando el peso corporal total como covariable muestra solo una tendencia a que los ratones alimentados con dieta alta en grasas tengan un mayor gasto de energía (Figura 5L), los ratones alimentados con dieta alta en grasas muestran un aumento significativo en el gasto de energía cuando se usa masa magra (Figura 5M). Estos datos sugieren que utilizar el peso corporal total para realizar análisis ANCOVA podría estar subestimando el gasto energético4. Las razones pueden ser que: (1) el tejido adiposo solo contribuye a ~ 5% del gasto total de energía y (2) la ganancia de masa grasa inducida por la alimentación dietética alta en grasas resulta principalmente de una expansión del contenido de triglicéridos en los adipocitos, en lugar de un aumento en el número de adipocitos termogénicos oxidativos.

Los adipocitos marrones y beige (BA) contribuyen a la termogénesis y, en consecuencia, al gasto de energía en roedores. La contribución de BA al gasto de energía in vivo no se puede determinar simplemente midiendo el consumo de oxígeno de todo el cuerpo y calculando el BMR, ya que múltiples tejidos consumen oxígeno. El enfoque para determinar la capacidad termogénica de BA in vivo implica primero la anestesia, que es necesaria para limitar el consumo de oxígeno en todos los tejidos. Luego, la anestesia se combina con un enfoque farmacológico para activar la termogénesis, principalmente en BA termogénico. Como los receptores adrenérgicos beta-3 se expresan principalmente en el tejido adiposo, el agonista adrenérgico beta-3 CL-316,243 se puede utilizar para activar la función termogénica BA. Además, los ratones anestesiados se pueden colocar en un recinto de temperatura controlada a 30 ° C, para evitar cualquier activación incontrolada de BA simpática inducida por estrés térmico ambiental. La Figura 6 muestra ratones alimentados con una dieta alta en grasas anestesiada con pentobarbital y colocada en las jaulas metabólicas a 30 ° C, para registrar el gasto de energía a la tasa metabólica inferior a la estándar (Figura 6A-C, D). Esta medición fue seguida por la inyección de CL-316,243, que elevó el consumo de oxígeno, la producción de CO2 y el gasto de energía, como se esperaba de la activación de BA (Figura 6A-C). Se puede detectar un aumento de 2-3 veces en el gasto de energía después del tratamiento con agonistas beta-37.

Figure 1
Figura 1: Las jaulas metabólicas con el recinto ambiental y el ensamblaje de jaulas metabólicas individuales. (A) Las jaulas metabólicas en el recinto ambiental. (B) El recinto puede albergar 12 jaulas metabólicas y permite controlar la temperatura y la luz. (C) Componentes de las jaulas metabólicas antes del montaje. (D) Jaulas metabólicas selladas con la tapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuración experimental y calibración del sensor de oxígeno. (A) Una captura de pantalla del software Oxymax que controla las jaulas metabólicas, que muestra la selección y apertura de una ventana de "Configuración experimental" para establecer las propiedades experimentales (B), a saber, la luz ambiental y la temperatura. Luego, el Experimento se configura utilizando la ventana (C) "Configuración experimental" para asignar una identificación del mouse, el peso corporal o la masa magra a cada jaula, así como la tasa de flujo de aire para las 12 jaulas. (D) En la misma ventana "Configuración experimental", se puede seleccionar una ruta de guardado de archivos. (E) Para calibrar el sensor de gas, el usuario debe girar la perilla del detector de gas (F) para ajustar la identidad (G-H) O2 a 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Inicio y parada de las mediciones. (A) El experimento se inicia haciendo clic en "Experimento" y luego en "Ejecutar". (B) Los usuarios pueden ver, en tiempo real, cuál de las 12 jaulas se está midiendo actualmente (rectángulo rojo), así como una tabla con las medidas ya recogidas. (C) El experimento se puede detener haciendo clic en "Experimento", luego en "Detener". (D) Los datos se pueden exportar a Excel haciendo clic en "Archivo", luego en "Exportar" y luego en "Exportar todos los temas CSV". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Parámetros metabólicos obtenidos. (A) Consumo de oxígeno. B) Producción de CO2. (C) Gasto de energía (EE) normalizado a masa magra. (D) Relación de intercambio respiratorio (RER). (E) Los niveles de actividad física se calculan como la suma de los recuentos de rotura del rayo láser X, Y, Z. Los datos muestran ± promedio sem. Prueba t de Student, **P < 0.01, ***P < 0.001. n = 7-8 ratones hembra por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: El análisis de ANCOVA permite una interpretación adecuada de los cambios en el gasto de energía en ratones obesos. (A-M) Mediciones en ratones hembra alimentados con una dieta chow o alta en grasas (HFD) durante 8 semanas. (A) Peso corporal. (B) Masa grasa. (C) Masa magra. D) Ingesta de alimentos. Prueba t del estudiante, ***P < 0.001. (E) La actividad física se evaluó con las jaulas metabólicas como recuentos de roturas de rayos láser en X, Y, Z. (F) La relación de coeficiente respiratorio (RER). G) Consumo de oxígeno (VO2). (H) Producción de CO2 (VCO2). (I) El gasto de energía (EE) se midió por calorimetría indirecta. El gasto energético se normalizó a (J) Masa magra y (K) peso corporal. *P < 0,05 usando Two-ANOVA. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Análisis covariable (ANCOVA) del gasto energético (EE) por la noche versus peso corporal total o (M) masa magra. Las líneas discontinuas representan los valores promedio de peso corporal modelados para determinar el VO2 y la EE en cada grupo. *P < 0,05 usando ANCOVA. n = 7-8 ratones hembra por grupo. Los datos muestran la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: El agonista selectivo β3, CL-316,243 aumenta agudamente el gasto de energía en ratones anestesiados en termoneutralidad. Los ratones hembra fueron anestesiados con pentobarbital (60 mg/kg) y colocados en las jaulas metabólicas establecidas a 30 °C. El gasto energético bajo anestesia se registró hasta que 3 mediciones consecutivas mostraron los mismos valores, reflejando la anestesia completa. El ratón de la jaula # 1 fue inyectado con CL-316,243 (1 mg / kg) inmediatamente después de una medición del consumo de oxígeno. El mismo enfoque de inyección se utilizó en las otras jaulas para garantizar que pasara el mismo tiempo entre la inyección y la primera medición en todos los ratones. (A) Consumo de oxígeno. B) Producción de CO2 . C) Gastos energéticos. n = 4 ratones hembra. Los datos muestran la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Fórmulas utilizadas por el software Oxymax en el sistema CLAMS para calcular el consumo de oxígeno, la producción de CO2 y el gasto de energía. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La calorimetría indirecta se ha utilizado durante años para evaluar el gasto energético de todo el cuerpo4. Este protocolo descrito aquí proporciona un método sencillo para medir la tasa metabólica basal y determinar la capacidad termogénica de BA in vivo utilizando jaulas metabólicas.

El método de calorimetría indirecta descrito aquí confirma que dividir los valores de gasto de energía por los valores de peso corporal puede ser engañoso. Por ejemplo, se puede concluir que el gasto energético es sistemáticamente menor en todos los modelos de ratón con obesidad. Sin embargo, el gasto total de energía puede ser mayor en algunos modelos de obesidad en ratones, como en el caso de un aumento en la ingesta de alimentos que conduce a la obesidad. Por lo tanto, dividir el gasto de energía por la masa grasa siempre causará una mala interpretación del proceso responsable de la obesidad en ratones obesos sin defectos primarios en el gasto de energía. Además, dividir por masa magra también es inapropiado cuando se producen cambios en la masa magra, ya que la masa magra covaria con el gasto de energía, y el gasto de energía puede mostrar una disminución más significativa que cualquier cambio en la masa magra. Esto significa que la división del gasto de energía por peso corporal o masa magra solo se puede realizar si no se observan cambios en el peso corporal o la composición corporal (es decir, masa magra y masa grasa) entre los grupos probados. Como consecuencia, el enfoque más seguro es realizar ANCOVA. Este tema ha sido ampliamente discutido en excelentes artículos, todos ellos concluyendo que un análisis de covarianza (ANCOVA) es esencial para comparar el gasto energético entre grupos de ratones con diferencias en el peso corporal total o la masa magra4,5. Aquí, SigmaPlot se utilizó para realizar análisis ANCOVA internamente, pero se pueden usar muchos otros software de análisis estadístico avanzado. El sitio web de CalR permite cargar datos en una de sus plantillas, pero no siempre es posible dependiendo del diseño experimental5. Tener un software estadístico para realizar el ANCOVA "in-house" ofrece más flexibilidad en el análisis y la presentación de datos, pero consume más tiempo6.

La termoneutralidad para ratones es de alrededor de 30 °C, lo que suprime la actividad de los adipocitos termogénicos de color marrón y beige (BA)1. La temperatura ambiente (21 °C) está por debajo de la termoneutralidad, lo que significa que la termogénesis BA contribuirá al gasto de energía en ratones alojados a 21 °C. Por lo tanto, la diferencia en el gasto de energía entre ratones a temperatura ambiente vs. Los ratones en termoneutralidad se pueden utilizar para determinar la contribución de BA al gasto de energía de una manera menos invasiva. Sin embargo, este procedimiento requiere el uso continuo del recinto a 30 °C durante 4 semanas, con termoneutralidad que también causa diferencias en la actividad física. Además, la termoneutralidad induce cambios metabólicos en otros tejidos, no solo en BA. En un contexto donde el objetivo principal es estudiar los cambios en la capacidad termogénica de BA, el enfoque farmacológico descrito aquí tiene una lista de ventajas sobre el alojamiento de ratones en termoneutralidad durante un largo período.

Los resultados se obtienen en pocas horas, y la anestesia suprime la contribución de la actividad física y otros cambios de comportamiento al gasto energético. Al evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas en ratones, el metabolismo podría cambiar en BA y otros tejidos. Por lo tanto, el tratamiento con CL-316,243 en ratones anestesiados es el enfoque que puede discernir cambios en la actividad de BA con un mayor rango dinámico y especificidad, con menos factores de confusión del gasto de energía derivado de otros tejidos. Alternativamente, CL-316,243 se puede inyectar en ratones conscientes, ya que el sistema puede medir la actividad física. Por lo tanto, si se produce un cambio en la actividad física, se puede estimar y controlar5. En resumen, mientras que la anestesia puede proporcionar el rango dinámico más alto, las mediciones se pueden hacer sin anestesia si es necesario, ya que la actividad física puede ser monitoreada.

Al usar las jaulas metabólicas, se debe tener precaución con respecto al estrés de los ratones, y es necesaria una recuperación adecuada. El aislamiento social de la vivienda individual y el nuevo entorno de la jaula metabólica estresan a los ratones, lo que resulta en una disminución de la ingesta de alimentos y la pérdida de peso. Por lo tanto, la ingesta de alimentos y el peso corporal deben controlarse cada 24 h. Los ratones recuperan la ingesta normal de alimentos 48-72 h después de colocarlos en la jaula metabólica. Como resultado, la calibración y las mediciones de consumo de oxígeno comienzan cuando se recupera la ingesta de alimentos. A pesar de que el sistema de jaulas metabólicas está encendido, la calibración y las medidas no se realizan durante este período de aclimatación, ya que por definición, el BMR debe obtenerse en un ratón libre de estrés. Evitar las mediciones durante este período aumenta la vida útil del detector y reduce el uso y el consumo de Drierite (que atrapa el agua para evitar daños en el detector de oxígeno). Los sistemas más nuevos y más caros utilizan mediciones basadas en jaulas domésticas, lo que disminuye el estrés.

Análisis ANCOVA
Es necesario un ANCOVA (análisis de covarianza) al comparar el gasto energético entre dos grupos de ratones con diferencias de peso corporal4. La razón es que un aumento en la masa magra aumentará el gasto de energía. ANCOVA prueba si el gasto de energía cambia estadísticamente significativamente entre los grupos, independientemente de las diferencias en el peso corporal y la masa magra. ANCOVA logra eso al determinar si el gasto de energía difiere si ambos grupos tenían el mismo peso corporal o masa magra. Sin embargo, para calcular el gasto de energía al mismo peso corporal/masa magra utilizando ANCOVA, la correlación entre la covariable (peso corporal/masa magra) y la variable (gasto energético) debe ser similar entre los grupos. La similitud de esta correlación se prueba utilizando la prueba de Levene para la igualdad de varianza5.

ANCOVA requiere el uso de software de análisis estadístico más avanzado, como SigmaPlot. Alternativamente, se pueden utilizar diferentes sitios web gratuitos5. Si ANCOVA muestra que el efecto observado entre grupos no depende del valor de la covariable (peso corporal/masa magra), el software probará si el promedio de la variable (gasto energético, VO2, VCO2) es diferente entre los grupos a una covariable similar (peso corporal/masa magra). El software ofrecerá hacer múltiples comparaciones con una prueba estadística sugerida. Si se alcanza significación estadística, confirmará que el gasto de energía es significativamente diferente entre los dos grupos de ratones en cualquier valor de peso corporal dado. La ecuación de regresión para el modelo de pendientes iguales se puede obtener del análisis, que se puede utilizar en GraphPad u otro software gráfico para generar un gráfico para su publicación6.

Modificaciones y solución de problemas
El sistema CLAMS utilizado en este protocolo está constituido por pequeñas jaulas que son muy diferentes de las jaulas caseras a las que están acostumbrados los ratones, que incluyen la ropa de cama. Además, los ratones son animales sociales, y la necesidad de alojarlos individualmente, junto con una nueva jaula sin ropa de cama, causa estrés inicial a los ratones. Por lo tanto, es necesaria una aclimatación de al menos 2 días para permitir que los ratones se adapten a sus nuevos entornos y mitiguen el estrés. Por lo general, la ingesta de alimentos vuelve a lo que se registró en las jaulas de sus hogares al tercer día. Este período de aclimatación es innecesario para evaluar la capacidad de BA para gastar energía, ya que se realiza en ratones anestesiados.

El pentobarbital es un barbitúrico de acción corta que se puede usar como agente sedante o anestésico, pero también se usa para la eutanasia en dosis más altas. Por una razón desconocida, a veces se observó que la eficacia del pentobarbital a 30 ° C es diferente a la temperatura ambiente. Por lo tanto, se recomienda probar diferentes dosis de pentobarbital en el modelo de ratón a la termoneutralidad. Los principales efectos adversos del pentobarbital incluyen depresión respiratoria y efectos cardiovasculares, como reducción de la presión arterial, volumen sistólico e hipotensión8.

Limitaciones
Los receptores beta3-adrenérgicos se expresan en el tejido adiposo y son detectables en el miocardio, la retina, la vesícula biliar, el cerebro, la vejiga urinaria y los vasos sanguíneos9. Como tal, CL-316,243 puede aumentar potencialmente el gasto de energía en estos otros tejidos donde se expresa el receptor. Sin embargo, se demostró que la mayor parte del gasto energético inducido por CL-316.243 en ratones control es dependiente de UCP-1, una proteína específica de BA10,11. Hay que tener en cuenta que algunas modificaciones genéticas pueden exacerbar las acciones de CL-316.243 en otros tejidos. Además, la fracción de la respiración independiente UCP1 todavía puede ser impulsada por ciclos inútiles que consumen ATP descritos en el tejido adiposo activado.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses en este documento de protocolo. M.L. es cofundador y consultor de Enspire Bio LLC.

Acknowledgments

ML está financiado por el Departamento de Medicina de UCLA, subvenciones piloto de P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) y P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CLAMS-Oxymax System Columbus Instruments CLAMS-center feeder-ENC Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software HP/Columbus N/A PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) Fisher Scientific 23-116681 Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition Echo-MRI Echo-MRI 100 Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243 Sigma C5976 Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet Research Diets D12266B Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal Pharmacy at DLAM N/A Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator) Praxair NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration

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References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
  3. Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
  4. Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
  5. Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
  6. Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
  7. Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
  8. Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
  9. Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
  10. Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
  11. Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).

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Biología Número 177
Determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos
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Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M.… More

Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M. Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice. J. Vis. Exp. (177), e63066, doi:10.3791/63066 (2021).

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