Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Determinando o gasto energético basal e a capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia em camundongos obesos

Published: November 11, 2021 doi: 10.3791/63066
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4
1Department of Molecular Medicine, Faculty of Medicine, Universite Laval, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Molecular Biology Institute at UCLA

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para medir a taxa metabólica basal e a capacidade oxidativa de adipócitos termogênicos em camundongos obesos.

Abstract

As medidas de gasto energético são necessárias para entender como as mudanças no metabolismo podem levar à obesidade. O gasto energético basal pode ser determinado em camundongos medindo o consumo de oxigênio do corpo inteiro, a produção de CO2 e a atividade física usando gaiolas metabólicas. Os adipócitos castanhos/bege termogênicos (BA) contribuem significativamente para o gasto energético dos roedores, particularmente em baixas temperaturas ambientais. Aqui, as medidas do gasto de energia basal e da capacidade total da BA de gastar energia em camundongos obesos são descritas em dois protocolos detalhados: o primeiro explicando como configurar o ensaio para medir o gasto de energia basal utilizando a análise da covariância (ANCOVA), uma análise necessária dado que o gasto energético co-varia com a massa corporal. O segundo protocolo descreve como medir a capacidade de gasto energético da BA in vivo em camundongos. Este procedimento envolve anestesia, necessária para limitar os gastos causados pela atividade física, seguida da injeção de agonista beta3-adrenérgico, CL-316.243, que ativa o gasto energético na BA. Estes dois protocolos e suas limitações são descritos em detalhes suficientes para permitir um primeiro experimento bem sucedido.

Introduction

O metabolismo pode ser definido como a integração das reações bioquímicas responsáveis pela absorção de nutrientes, armazenamento, transformação e quebra que as células usam para crescer e desempenhar suas funções. Reações metabólicas transformam a energia contida em nutrientes em uma forma que pode ser usada pelas células para sintetizar novas moléculas e executar o trabalho. Essas reações bioquímicas são inerentemente ineficientes em transformar essa energia em uma forma utilizável para sustentar a vida1. Tal ineficiência resulta em dissipação de energia na forma de calor, com esta produção de calor sendo usada para quantificar a Taxa Metabólica Padrão (RMR) de um organismo1. A condição Padrão foi definida clássicamente como a produção de calor ocorrendo em um adulto acordado, mas descansando, não ingerindo ou digerindo alimentos, na termoneutralidade e sem estresse1. A Taxa Metabólica Basal (RMC) ou o gasto energético basal em camundongos é referido como A RMS, mas em indivíduos que ingerem e digerem alimentos sob leve estresse térmico (temperaturas ambientais 21-22 °C)1. Os desafios e dificuldades de medir diretamente a produção de calor fizeram com que a calorimetria indireta, ou seja, calculando a produção de calor a partir de medições de consumo de oxigênio, se tornasse a abordagem mais popular para determinar a RMC. O cálculo da RMC a partir do consumo de oxigênio é possível porque a oxidação de nutrientes por mitocôndrias para sintetizar ATP é responsável por 72% do oxigênio total consumido em um organismo, com 8% do consumo total de oxigênio também ocorrendo em mitocôndrias, mas sem gerar ATP (respiração não alcoólica)1. A maioria dos 20% restantes do oxigênio consumido pode ser atribuída à oxidação de nutrientes em outros locais subcelulares (oxidação de ácido graxo peroxisômico), processos anabólicos e formação de espécies reativas de oxigênio1. Assim, em 1907, a Lusk estabeleceu uma equação, baseada em medições empíricas, amplamente utilizada para transformar o consumo de oxigênio e a produção de CO2 em dissipação de energia como calor. Em humanos, o cérebro é responsável por ~25% da RMC, o sistema musculoesquelético para ~18,4%, o fígado por ~20 %, o coração por ~10%, e o tecido adiposo para ~3-7%2. Em camundongos, a contribuição tecidual para a RMC é ligeiramente diferente, com o cérebro representando ~6,5%, o músculo esquelético ~13%, o fígado ~52%, o coração ~3,7%, e tecido adiposo ~5%3.

Notavelmente, as reações bioquímicas que definem a RMC não são fixas e mudam em resposta a diferentes necessidades, como trabalho externo (atividade física), desenvolvimento (crescimento tecidual), estresses internos (contra-infecções, lesões, rotatividade de tecidos) e alterações na temperatura ambiente (defesa fria)1. Alguns organismos recrutam ativamente processos para gerar calor na exposição ao frio, implicando que o calor produzido pelo metabolismo não é apenas um subproduto acidental. Em vez disso, a evolução selecionou mecanismos regulatórios que poderiam especificamente aumentar a produção de calor alterando a taxa de reações metabólicas1. Assim, essas mesmas medidas de consumo de oxigênio podem ser usadas para determinar a capacidade de um organismo de gerar calor em resposta ao frio.

Dois grandes processos contribuem para a geração de calor após a exposição ao frio. O primeiro é o tremor, que gera calor aumentando a fosforilação oxidativa mitocondrial e a glicólise no músculo para cobrir o trabalho físico feito por contração muscular involuntária. Portanto, a exposição ao frio aumentará o consumo de oxigênio nos músculos1. A segunda é a Termogênese Não-Trêmula, que ocorre através de um aumento no consumo de oxigênio em adipócitos marrons e bege (BA). A dissipação de energia em calor na BA é mediada pela proteína de desacoplamento mitocondrial 1 (UCP1), que permite a reentrada de prótons na matriz mitocondrial, diminuindo o gradiente de próton mitocondrial. A dissipação do gradiente de próton mitocondrial por UCP1 aumenta a produção de calor pela elevação na transferência de elétrons e consumo de oxigênio e pela energia liberada pela dissipação de prótons em si sem gerar ATP (desacoplamento). Além disso, a BA termogênica pode recrutar mecanismos adicionais que elevam o consumo de oxigênio sem causar uma grande dissipação no gradiente de prótons, ativando ciclos fúteis de síntese oxidativa de ATP e de consumo. As gaiolas metabólicas descritas aqui, ou seja, o sistema CLAMS-Oxymax da Columbus Instruments, oferecem a possibilidade de medir o gasto energético em diferentes temperaturas ambientes. No entanto, para determinar a capacidade termogênica da BA utilizando medidas de consumo de oxigênio do corpo inteiro, é preciso: (1) eliminar a contribuição de tremores, e outros processos metabólicos não-BA para o gasto energético, e (2) ativar especificamente a atividade termogênica ba in vivo. Assim, um segundo protocolo descreve como ativar seletivamente a BA in vivo utilizando farmacologia em camundongos anestesiados na termoneutralidade (30 °C), com anestesia e termoneutralidade limitando outros processos termogênicos não-BA (ou seja, atividade física). A estratégia farmacológica para ativar a BA é tratar camundongos com o receptor β3-adrenérgico agonista CL-316.246. A razão é que a exposição a frio promove uma resposta simpática liberando norepinefrina para ativar receptores β-adrenérgicos na BA, o que ativa UCP1 e oxidação de gordura. Além disso, a expressão do receptor β3-adrenérgico é altamente enriquecida em tecido adiposo em camundongos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). Os camundongos foram administrados sua dieta e ad libitum de água na gaiola metabólica, abrigada em um ambiente controlado pela temperatura (~21-22 ou 30 °C) com um ciclo claro/escuro de 12h. Camundongos fêmeas de 8 semanas alimentados com dieta rica em gordura ou dieta de comida por 8 semanas foram usados para este estudo.

1. Medição da Taxa Metabólica Basal (BMR)

  1. Meça o peso corporal total do mouse usando uma escala de peso com precisão na faixa de 0,1 g.
    NOTA: Isso deve ser feito antes de abrigar os camundongos em gaiolas metabólicas e após os 2-3 dias de período de aclimatação para as gaiolas metabólicas.
  2. Meça a composição corporal, incluindo gordura e massa magra em camundongos não anestesiados, utilizando um sistema de análise de composição corporal adequado (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Essas medidas são necessárias para determinar o gasto energético e são executadas em paralelo às medidas totais de peso corporal (etapa 1.1).
  3. Configure as gaiolas metabólicas e inicie o período de aclimatação.
    NOTA: O sistema de gaiolas metabólicas inclui um gabinete que permite ao usuário controlar a temperatura da carcaça e a luz de 12 gaiolas (Figura 1A,B). Cada gaiola tem uma garrafa de água, um alimentador e uma grade (Figura 1C). A grade separa o mouse do fundo da gaiola, permitindo a coleta de fezes. Uma vez instalada a gaiola em cada espaço pré-determinado, uma tampa que sela a gaiola inclui o slot da garrafa de água, o ar amostrador de tubos, o sistema de fluxo de ar e o sensor de atividade física (Figura 1D).
    1. Ligue o compartimento de temperatura, o sistema de fluxo de ar e o computador 2h antes de iniciar o ensaio.
    2. Após 2h, abra o software que controla o gabinete (ver Tabela de Materiais) e o fluxo de ar e deixe que o software teste a comunicação do computador com o equipamento.
      NOTA: O software Oxymax foi utilizado para o presente trabalho.
    3. Uma vez estabelecida a comunicação, clique em Arquivo, em seguida, Abra a Configuração do Experimento (Figura 2A) e selecione a configuração do experimento pré-assinada pelo fornecedor (ou configurada a partir de um ensaio anterior).
    4. Clique em Experimentar e clique em Propriedades, que abrirá a janela Propriedades de Experimento (Figura 2B).
    5. Na janela Propriedades, configure os parâmetros do gabinete ambiental, incluindo a Temperatura Ambiente (21 °C) e os ciclos de luz de 12 horas.
      NOTA: Manter o software aberto e funcionando permite que o ar flua para as gaiolas e o gabinete para manter os ciclos de temperatura e luz selecionados. Assim, todo o sistema pode operar com ratos dentro das gaiolas por vários dias, mesmo sem medir oxigênio e CO2.
    6. Clique em Experimentar e clique em Configuração e a janela Configuração do experimento será aberta, onde os parâmetros de cada gaiola metabólica são definidos.
    7. Atribua cada ID do mouse à gaiola individual onde o mouse está alojado (Figura 2C).
    8. Inclua a massa magra ou o peso corporal total para cada camundongo somente se não forem observadas diferenças no peso corporal entre os grupos.
      NOTA: A obtenção de valores brutos de consumo de oxigênio e gasto energético facilita as análises da ANCOVA.
    9. Defina a taxa de fluxo de ar para a gaiola metabólica em 0,5-0,6 L/min.
    10. Na janela Configuração de experimentos, selecione o caminho e o nome de salvar arquivos. Selecione o diretório de backup (Figura 2D).
    11. Adicione uma quantidade pré-ponderada de alimentos aos alimentadores que cobrem pelo menos a ingestão de alimentos por 1 dia.
      NOTA: Se as gaiolas tiverem escalas integradas, os alimentos podem ser adicionados diretamente, e o software irá gravá-lo.
    12. Adicione as garrafas de água. Verifique se a garrafa está selada corretamente e não vaze.
    13. 24 horas depois de adicionar o alimento, pese o alimento que é deixado na gaiola.
      NOTA: Os gramas de alimentos adicionados menos os gramas dos alimentos restantes medirão a ingestão alimentar.
    14. Inicie as medidas de oxigênio, CO2 e atividade (etapa 1.4.10) uma vez que os valores de consumo alimentar são os mesmos dos camundongos alojados em gaiolas regulares.
      NOTA: Aqui, o período de aclimatação (geralmente de 2 a 3 dias) está concluído, e as medições de gastos energéticos podem começar.
  4. Medições indiretas de calorimetria e atividade para avaliar o gasto energético
    1. Meça o peso corporal, a gordura e a massa magra de todos os camundongos antes de iniciar as medições.
      NOTA: Estes são os valores de peso corporal e massa magra utilizados para realizar análises ANCOVA.
    2. Calibrar o detector baseado em O2 e CO2 do sistema CLAMS (ver Tabela de Materiais) com a concentração de oxigênio recomendada; sempre recalibrar o detector antes de iniciar um novo experimento.
    3. Use um gás de calibração de composição conhecida (20,50% oxigênio e 0,50% CO2).
      NOTA: Os fornecedores de gás muitas vezes se referem a este gás como "Grau Padrão Primário".
    4. Ligue e certifique-se de que a pressão de saída do tanque esteja em 5-10 psi.
    5. Abra o software calibration utility para calibrar e testar os sensores de gás (Figura 2E). Clique em Experimentar e, em seguida, calibrar.
    6. Pressione Start. Em seguida, espere os sensores serem testados e para que o software peça ao usuário para girar os botões do sensor de gás (Figura 2F) até que o valor da identidade O2 seja 1 (Figura 2G-H). Clique em Seguir quando a etapa estiver completa.
      NOTA: Se o Utilitário de Calibração realizar todas as etapas atuais, a calibração prosseguirá automaticamente para o próximo passo quando a barra de progresso estiver preenchida.
    7. Verifique os resultados de calibração quando todas as etapas foram concluídas e os resultados são apresentados.
    8. Desligue o gás de calibração.
    9. Troque de alimento e adicione alimentos suficientes para um período de 48-72 h.
      NOTA: Embora as gaiolas possam ser abertas durante as medições de gastos energéticos para monitorar o peso corporal e alterar os alimentos diariamente, os camundongos podem ser estressados por essas manipulações, e as medidas são perdidas quando as gaiolas são abertas. Assim, recomenda-se evitar qualquer manipulação durante o período de medição.
    10. No software, clique em Experimentar e, em seguida, Execute para iniciar as medidas de oxigênio, CO2 e atividade (Figura 3A).
      NOTA: A execução das medidas pode ser rastreada em tempo real em uma caixa localizada na seção inferior esquerda do software (retângulo vermelho, Figura 3B). O retângulo vermelho na Figura 3B mostra que o sistema mede a gaiola nº 1 no intervalo #3, ou seja, a 3ª medição. Uma medição em uma gaiola pode levar cerca de 1 min. Assim, com 12 gaiolas conectadas, o consumo de oxigênio pode ser medido aproximadamente a cada 12 minutos. São recomendadas medidas contínuas de no mínimo 48 h.
    11. Pare o experimento clicando em Experimentar e, em seguida, Pare (Figura 3C).
    12. Abra as gaiolas, pese os ratos e a comida. Coletar as fezes para calcular o número de calorias e lipídios excretados durante o período de medições de 48-72 h.
      NOTA: As fezes podem ser armazenadas a -20 °C para análises posteriores. Estas gaiolas não podem ser efetivamente usadas para coletar urina.
    13. Clique em Experimentos e exporte e exporte todos os sujeitos como um arquivo CSV (Figura 3D).
      NOTA: Para facilitar as análises da ANCOVA, é essencial exportar valores de consumo bruto de oxigênio (VO2) e CO2 (VCO2) sem ser normalizado pelo peso corporal.
  5. Análise de dados e controle de qualidade
    1. Na folha de CSV exportada (Figura 3D) (a partir da etapa 1.4.13), utilize os valores brutos do consumo de oxigênio (VO2) e produção de CO2 (VCO2) medidos a cada 12 minutos no período de 2-3 dias que são automaticamente listados pelo software e incluem um cronograma, ou seja, a hora e a data em que foram medidos.
      NOTA: Os valores vo2 e VCO2 serão automaticamente corrigidos se os valores de peso corporal ou massa magra forem adicionados.
    2. Na folha de CSV exportada, utilize os valores brutos da razão de troca respiratória (RER: VCO2/VO2) que são automaticamente calculados e listados pelo software de acordo com o seu cronograma.
      NOTA: Valores próximos a 1 mostram que o camundongo oxida principalmente carboidratos, enquanto valores mais próximos de 0,7 representam que o camundongo é principalmente gordura oxidante. O RER acima de 1 pode ocorrer durante o exercício anaeróbico, pois o corpo expulsa mais CO2 para compensar a acidose causada pelo lactato. RER maior que 1 pode indicar estresse. O arquivo CSV exportado também contém os valores brutos do gasto energético (EE) ou da produção de calor em calorias por minuto por mouse, medidos a cada 12 minutos nos 2-3 dias. Aqui, todos os valores listados incluem um estamp de tempo.
    3. Como os valores de EE único por mouse são necessários para um ANCOVA, os valores médios do EE registrados entre 09:00-16:00 para a fase luz (dia) e 19:00-04:00 para a fase escura (noite) por mouse e dia.
      NOTA: Isso pode ser feito manualmente usando Excel ou Graph Pad. A seleção dessas janelas biditárias evita a média dos valores EE intermediários, graduais e instáveis associados à transição de fase clara-escura.
    4. Para um período de 48 horas, calcule a média dos dois valores da luz do dia e os dois valores de fase escura por mouse usando Excel ou Graph Pad.
    5. Para quantificar a atividade física total, use Excel ou Graph Pad para somar as contagens de quebra de feixe x, y e z medidas nas gaiolas metabólicas e listadas no arquivo CSV para cada mouse.
      NOTA: A atividade total x,y,z é calculada fazendo primeiro o valor médio de cada X, Y, Z por mouse e ciclo. Em seguida, a soma de cada valor médio de X, Y, Z por mouse e ciclo é determinada a traçar os dados como na Figura 5E (sendo a média de 2 dias).
    6. Alternativamente, representam os dados que mostram cada valor de medição ao longo do tempo, o que gera curvas que ilustram as mudanças no EE durante a transição dos ciclos claros para escuros.
      NOTA: Consulte a seção de discussão sobre como e quando realizar análises ANCOVA, e as diferentes fórmulas utilizadas para calcular VO2, VCO2 e EE são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

2. Medição da capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia

  1. Configure as medidas e tratamentos do rato. Consulte o passo 1 para obter detalhes sobre as preparações experimentais para monitorar o consumo de oxigênio, uma vez que a capacidade termogênica em adipócitos é determinada indiretamente pelo consumo de oxigênio seguindo as etapas 2.1.1-2.2.2.
    NOTA: Este protocolo requer anestesia do rato e tratamento agudo com o agonista receptor beta-3 CL-316.243 (ver Tabela de Materiais), dando uma rápida avaliação da capacidade termogênica ba.
    1. Realize a análise da composição corporal e pese os camundongos. Ligue os CLAMS, configure a temperatura a 30 °C (termoneutralidade) e espere 2h para todo o sistema aquecer.
    2. Configure o resto das condições de ensaio, incluindo luz, atribua o ID do mouse a cada gaiola e adicione o valor do peso corporal de cada rato na gaiola correspondente se não for observada diferença no peso corporal entre os grupos.
    3. Calibrar o detector de oxigênio/CO2 como nas etapas 1.4.2-1.4.7.
    4. Inicie o experimento no software.
    5. Injete cada rato com pentobarbital (60-120 mg/kg) e coloque cada rato em sua gaiola metabólica atribuída (passo 2.1.2).
      NOTA: A dose de pentobarbital necessária para manter os camundongos dormindo na termoneutralidade (30 °C) varia de acordo com a cepa do camundongo e o genótipo. Recomenda-se testar diferentes doses pentobarbitais de 50 a 120 mg/kg e escolheu aquela que mantém o camundongo anestesiado durante 2-3 h a 30 °C. A anestesia eficiente é essencial para eliminar a contribuição da atividade física para o gasto energético.
    6. Para garantir a anestesia, observe os camundongos após a injeção pentobarbital até que estejam completamente dormindo e suas taxas de consumo de oxigênio diminuídas se tornem estáveis.
    7. Aguarde para obter pelo menos 3 taxas de consumo de oxigênio consecutivos estáveis antes de injetar CL-316.243.
      NOTA: Enquanto aguarda a estabilização do consumo de oxigênio, prepare as seringas com CL-316.243 para cada rato (1 mg/kg).
    8. Abra a gaiola nº 1 e injete CL-316.243 subcutânea imediatamente após uma medição vo2 e VCO2 ocorrer na gaiola #1. Retorne o mouse para a gaiola #1 imediatamente após a injeção.
      NOTA: As medidas estão sendo indicadas em tempo real na seção inferior esquerda do software (Figura 3B, retângulo vermelho).
    9. Aguarde que a gaiola #2 seja medida (Figura 3B, retângulo vermelho) e, em seguida, proceda como na etapa 2.1.8 para a gaiola #2.
      NOTA: Injetar CL-316.243 imediatamente após uma medição permite manter o tempo constante entre as injeções. Por exemplo, se houver 12 ratos/gaiolas funcionando, com medidas coletadas em gaiolas individuais sequencialmente e a coleção durando 55 s por gaiola, então você deve injetar um rato a cada minuto. Com essas taxas de injeção, a primeira medição ocorrerá após 12 minutos após a injeção em todas as 12 gaiolas.
    10. Continue as medições de gastos energéticos até que o gasto energético valorize o patamar para 5-6 medições consecutivas, geralmente 90-180 min após a injeção.
      NOTA: Os ratos podem acordar da anestesia durante os experimentos. Esses camundongos precisam ser removidos da análise. Portanto, testar as doses pentobarbitais de antemão aumentará a eficiência dos estudos.
    11. Pare as medidas de gasto energético, mas mantenha os ratos em suas gaiolas a 30 °C, até que acordem.
    12. Depois que os ratos estiverem totalmente acordados, inspecione a saúde dos ratos e devolva-os às suas gaiolas iniciais.
    13. Exporte os dados de cada mouse como um arquivo CSV usando o software do equipamento, conforme descrito na seção 1.4.13.
  2. Análise de dados
    NOTA: A análise dos dados foi realizada pelo Excel ou Graphpad
    1. Plote os 3-5 valores consecutivos de VO2, VCO2 e EE que são estáveis e constantes ao longo do tempo, pois estes são os valores que representam a taxa metabólica quando os camundongos são totalmente anestesiados.
    2. Em seguida, plote as primeiras e seguintes medições consecutivas de VO2, VCO2 e EE obtidas após a injeção.
      NOTA: Os valores absolutos do EE e o aumento da dobra no EE induzido pela injeção indicam a função termogênica BA7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A Figura 4 mostra valores de atividade física VO2, VCO2, Produção de Calor/Energia (EE), Relação de Troca Respiratória (RER) e X, Y, Z valores de atividade física obtidos utilizando as gaiolas metabólicas do sistema CLAMS. O VO2 e VCO2 fornecidos pelo sistema CLAMS é o volume de gás (mL) por minuto e já pode ser dividido pelo peso corporal ou pelos valores de massa magra inserindo esses valores de peso no software CLAMS antes de iniciar as medições. No entanto, os valores do peso corporal não devem ser inseridos se forem observadas diferenças no peso corporal entre grupos de camundongos, uma vez que a análise ANCOVA é necessária e o software Oxymax não pode realizar esses cálculos. O gasto energético (calor) é calculado em kcal/h usando a equação de Lusk. Os camundongos são noturnos e gastam mais energia durante o período noturno/escuro, o que significa que os cálculos de gastos energéticos precisam ser separados de acordo com o ciclo de luz. Como esperado, os camundongos durante a fase escura têm maior consumo de O2, produção de CO2 e, portanto, EE maior, como mostrado na Figura 4C. Camundongos em uma dieta regular e no estado alimentado, com a ingestão alimentar ocorrendo no ciclo escuro, são caracterizados por valores RER próximos a 1 (Figura 4D), o que significa preferência para o uso de carboidratos. Durante o ciclo de luz, quando os camundongos dormem principalmente e, portanto, rápido, há uma mudança para a oxidação de gordura, com os valores RER sendo mais próximos de 0,7. Assim, a atividade física, medida como x,y,z contagem de raios laser, aumenta durante a fase escura e diminui durante a fase de luz (Figura 4E).

Comparamos camundongos fêmeas de 16 semanas alimentados com uma dieta rica em gordura (8 semanas) com camundongos alimentados com comida, permitindo a comparação do gasto energético entre grupos de camundongos com diferenças no peso corporal. Como esperado, a alimentação por alta gordura aumenta a massa gorda sem alterar a massa magra (Figura 5A-C). Camundongos alimentados com dieta rica em gordura comeram mais Kcal/dia, principalmente devido à maior densidade calórica por grama de alimento (Figura 5D). Além disso, a atividade física foi semelhante entre a comida, e os camundongos alimentados com dieta com alto teor de gordura, mesmo durante o período escuro (Figura 5E). Os valores mais baixos do RER mostram a preferência dos camundongos alimentados por dieta rica em gordura para usar gordura como substrato primário para oxidação, como esperado com maior ingestão de gordura e resistência à insulina muscular (Figura 5F). O consumo de oxigênio aumenta em camundongos alimentados com dieta com alto teor de gordura, mas não na produção de CO2 (Figura 5G-H). O aumento do consumo de oxigênio em camundongos alimentados com dieta rica em gordura é acompanhado por um aumento significativo na produção de calor/gasto energético por rato (Figura 5I). No entanto, a divisão do gasto energético pela massa magra de cada camundongo não levou a diferenças no gasto energético (Figura 5J), enquanto a divisão pelo peso corporal total mostrou uma diminuição no gasto energético em camundongos alimentados com dieta rica em gordura (Figura 5K). Cumulativamente, esses resultados indicam que a divisão dos dados de gasto energético por massa magra ou peso corporal total pode levar a conclusões opostas sobre os efeitos da alimentação alimentar de dieta rica em gordura no gasto energético. Como sugerido por múltiplos estudos, a análise da covariância (ANCOVA) permite determinar se existem diferenças no gasto energético independentemente das mudanças no peso corporal. Para ilustrar esse ponto, foi realizada uma análise ancova utilizando-se os mesmos dados mostrados na Figura 5A-K, sendo o gasto energético a variável dependente e o peso corporal ou massa magra como os covariáveis. Enquanto o desempenho da ANCOVA utilizando o peso corporal total como covariada mostra apenas uma tendência para que camundongos alimentados com dieta com alto teor de gordura tenham maior gasto energético (Figura 5L), os camundongos alimentados com dieta de alto teor de gordura mostram um aumento significativo no gasto energético quando a massa magra é usada (Figura 5M). Esses dados sugerem que o uso do peso corporal total para realizar análises ancova pode estar subestimando o gasto energético4. As razões podem ser: (1) o tecido adiposo só contribui para ~5% do gasto energético total e (2) o ganho de massa gorda induzida pela alimentação alimentar de alta gordura resulta principalmente de uma expansão do teor de triglicerídeos em adipócitos, em vez de um aumento no número de adipócitos termogênicos oxidativos.

Os adipócitos pardos e bege (BA) contribuem para a termogênese e, consequentemente, para o gasto energético em roedores. A contribuição da BA para o gasto energético in vivo não pode ser determinada apenas medindo o consumo de oxigênio do corpo inteiro e calculando a RMC, uma vez que múltiplos tecidos consomem oxigênio. A abordagem para determinar a capacidade termogênica da BA in vivo envolve primeiro a anestesia, necessária para limitar o consumo de oxigênio em todos os tecidos. Em seguida, a anestesia é combinada com uma abordagem farmacológica para ativar a termogênese, principalmente na BA termogênica. Como os receptores adrenérgicos beta-3 são expressos principalmente no tecido adiposo, o agonista beta-3 cl-316.243 pode ser usado para ativar a função termogênica BA. Além disso, os camundongos anestesiados podem ser colocados em um gabinete controlado pela temperatura a 30 °C, para evitar qualquer ativação deBA simpática descontrolada induzida por estresse térmico ambiente. A Figura 6 mostra que os camundongos alimentaram uma dieta rica em gordura anestesiada com pentobarbital e colocada nas gaiolas metabólicas a 30 °C, para registrar o gasto energético na taxa metabólica abaixo do padrão (Figura 6A-C,D). Esta medição foi seguida pela injeção CL-316.243, que elevou o consumo de oxigênio, a produção de CO2 e o gasto energético, como esperado da ativação da BA (Figura 6A-C). Um aumento de 2-3 vezes no gasto energético após o tratamento agonista beta-3 pode ser detectado7.

Figure 1
Figura 1: As gaiolas metabólicas com o recinto ambiental e montagem de gaiolas metabólicas individuais. (A) As gaiolas metabólicas no recinto ambiental. (B) O gabinete pode abrigar 12 gaiolas metabólicas e permite controlar a temperatura e a luz. (C) Componentes das gaiolas metabólicas antes da montagem. (D) Gaiolas metabólicas seladas com a tampa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuração experimental e calibração do sensor de oxigênio. (A) Uma captura de tela do software Oxymax que controla as gaiolas metabólicas, mostrando a seleção e abertura de uma janela de "configuração experimental" para definir as propriedades experimentais (B), ou seja, luz ambiente e temperatura. Em seguida, o Experimento é configurado usando a janela (C) "Configuração Experimental" para atribuir um ID do mouse, peso corporal ou massa magra a cada gaiola, bem como a taxa de fluxo de ar para as 12 gaiolas. (D) Na mesma janela "Configuração Experimental", um caminho de salvamento de arquivos pode ser selecionado. (E) Para calibrar o sensor de gás, o usuário precisa ligar o botão no detector de gás (F) para ajustar a identidade O2 (G-H) para 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Iniciar e parar as medidas. (A) O experimento é iniciado clicando em "Experimento", depois "Executar". (B) Os usuários podem ver, em tempo real, quais das 12 gaiolas estão sendo medidas atualmente (retângulo vermelho), bem como uma tabela com as medidas já coletadas. (C) O Experimento pode ser interrompido clicando em "Experimento", e depois "Pare". (D) Os dados podem ser exportados para o Excel clicando em "Arquivo", depois em "Exportar" e, em seguida, "Exporte todos os sujeitos CSV". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Parâmetros metabólicos obtidos. a Consumo de oxigênio. (B) produção de CO2 . (C) Gasto energético (EE) normalizado para massa magra. (D) Relação de troca respiratória (RER). (E) Os níveis de atividade física são calculados como a soma das contagens de quebra de raios laser X, Y, Z. Os dados mostram ± teste t do aluno, **P < 0,01, ***P < 0,001. n = 7-8 camundongos por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: A análise ANCOVA permite a interpretação adequada das mudanças no gasto energético em camundongos obesos. (A-M) Medições em camundongos fêmeas alimentadas com uma alimentação de comida ou de alta gordura (HFD) por 8 semanas. a Peso corporal. (B) Massa gorda. (C) Massa magra. (D) Ingestão alimentar. Teste t do aluno, ***P < 0,001. (E) A atividade física foi avaliada com as gaiolas metabólicas como contagem de quebras de raios laser em X, Y, Z. (F) A razão do coeficiente respiratório (RER). (G) Consumo de oxigênio (VO2). (H) produção de CO2 (VCO2). (I) O gasto energético (EE) foi medido por calorimetria indireta. O gasto energético foi normalizado para (J) Massa magra e (K) peso corporal. *P < 0,05 usando Two-ANOVA. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Análise covariada (ANCOVA) do gasto energético (EE) à noite versus peso corporal total ou (M) massa magra. As linhas tracejadas representam os valores médios de peso corporal modelados para determinar VO2 e EE em cada grupo. *P < 0,05 utilizando ANCOVA. n = 7-8 camundongos por grupo. Dados significam ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: O β3-agonista seletivo, CL-316.243 aumenta agudamente o gasto energético em camundongos anestesiados na termoneutralidade. Os camundongos fêmeas foram anestesiados com pentobarbital (60 mg/kg) e colocados nas gaiolas metabólicas fixadas em 30 °C. O gasto energético sob anestesia foi registrado até 3 medições consecutivas mostrarem os mesmos valores, refletindo anestesia completa. O rato da gaiola nº 1 foi injetado com CL-316.243 (1 mg/kg) imediatamente após uma medição de consumo de oxigênio. A mesma abordagem de injeção foi usada nas outras gaiolas para garantir que o mesmo tempo passou entre a injeção e a primeira medição em todos os camundongos. a Consumo de oxigênio. (B) produção de CO2 . (C) Despesa energética. n = 4 camundongos fêmeas. Dados significam ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: Fórmulas usadas pelo software Oxymax no sistema CLAMS para calcular o consumo de oxigênio, produção de CO2 e gasto energético. Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A calimemetria indireta é usada há anos para avaliar os gastos energéticos do corpo inteiro4. Este protocolo descrito aqui fornece um método simples de medir a taxa metabólica basal e determinar a capacidade termogênica ba in vivo usando gaiolas metabólicas.

O método de calimemetria indireta descrito aqui confirma que dividir os valores do gasto energético por valores de peso corporal pode ser enganoso. Por exemplo, pode concluir que o gasto energético é sistematicamente menor em todos os modelos de camundongos com obesidade. No entanto, o gasto energético total pode ser maior em alguns modelos de obesidade, como no caso de um aumento no consumo de alimentos levando à obesidade. Portanto, a divisão do gasto energético por massa gorda sempre causará uma má interpretação do processo responsável pela obesidade em camundongos obesos sem defeitos primários no gasto energético. Além disso, a divisão por massa magra também é inadequada quando ocorrem mudanças na massa magra, uma vez que a massa magra co-varia com o gasto energético, e o gasto energético pode mostrar uma diminuição mais significativa do que qualquer mudança na massa magra. Isso significa que a divisão do gasto energético por peso corporal ou massa magra só pode ser realizada se não forem observadas alterações no peso corporal ou na composição corporal (ou seja, massa magra e massa gorda) entre os grupos testados. Como consequência, a abordagem mais segura é realizar a ANCOVA. Este tema tem sido amplamente discutido em excelentes artigos, todos eles concluindo que uma análise da covariância (ANCOVA) é essencial para comparar o gasto energético entre grupos de camundongos com diferenças no peso corporal total ou massa magra4,5. Aqui, o SigmaPlot foi usado para realizar análises ANCOVA internamente, mas muitos outros softwares avançados de análise estatística podem ser usados. O site calr permite carregar dados em um de seus modelos, mas nem sempre pode ser possível dependendo do design experimental5. Ter software estatístico para realizar o ANCOVA "internamente" oferece mais flexibilidade na análise e apresentação de dados, mas é mais demorado6.

A termoneutralidade para camundongos é de cerca de 30 °C, o que suprime a atividade de adipócitos castanhos e bege termogênicos (BA)1. A temperatura ambiente (21 °C) está abaixo da termoneutralidade, o que significa que a termogênese ba contribuirá para o gasto energético em camundongos alojados a 21 °C. Então, a diferença no gasto energético entre ratos a temperatura ambiente versus. camundongos na termoneutralidade podem ser usados para determinar a contribuição da BA para o gasto energético de forma menos invasiva. No entanto, este procedimento requer o uso contínuo do gabinete a 30 °C durante 4 semanas, com a termoneutralidade também causando diferenças na atividade física. Além disso, a termoneutralidade induz alterações metabólicas em outros tecidos, não apenas na BA. Em um contexto em que o principal objetivo é estudar mudanças na capacidade termogênica da BA, a abordagem farmacológica descrita aqui tem uma lista de vantagens sobre a habitação de camundongos na termoneutralidade por um longo período.

Os resultados são obtidos em poucas horas, e a anestesia suprime a contribuição da atividade física e outras mudanças comportamentais no gasto energético. Ao avaliar os efeitos das manipulações genéticas em camundongos, o metabolismo pode ser alterado na BA e em outros tecidos. Assim, o tratamento CL-316.243 em camundongos anestesiados é a abordagem que pode discernir mudanças na atividade da BA com maior alcance dinâmico e especificidade, com menos confundimentos do gasto energético decorrente de outros tecidos. Alternativamente, cl-316.243 pode ser injetado em camundongos conscientes, pois o sistema pode medir a atividade física. Portanto, se ocorrer uma mudança na atividade física, ela pode ser estimada e controlada5. Em suma, enquanto a anestesia pode fornecer o maior alcance dinâmico, as medições podem ser feitas sem anestesia, se necessário, pois a atividade física pode ser monitorada.

Ao usar as gaiolas metabólicas, deve-se ter cuidado com o estresse dos camundongos, e a recuperação adequada é necessária. O isolamento social da moradia individual e o novo ambiente da gaiola metabólica estressam os camundongos, resultando na diminuição da ingestão alimentar e perda de peso. Assim, a ingestão de alimentos e o peso corporal precisam ser monitorados a cada 24 horas. Os camundongos recuperam a ingestão normal de alimentos 48-72 h depois de colocá-los na gaiola metabólica. Como resultado, as medidas de calibração e consumo de oxigênio começam quando a ingestão de alimentos é recuperada. Apesar do sistema de gaiolas metabólicas estar ligado, a calibração e as medidas não são realizadas durante este período de aclimatação, pois por definição, a RMC deve ser obtida em um rato livre de estresse. Evitar medições durante esse período aumenta a vida útil do detector e reduz o uso e o consumo de Drierite (que prende a água para evitar danos ao detector de oxigênio). Sistemas mais novos e mais caros usavam medidas caseiras à base de gaiolas, o que diminui o estresse.

Análises da ANCOVA
É necessário um ANCOVA (análise da covariância) na comparação do gasto energético entre dois grupos de camundongos com diferenças no peso corporal4. A razão é que um aumento da massa magra aumentará o gasto energético. A ANCOVA testa se o gasto energético é estatisticamente alterado entre os grupos, independente das diferenças no peso corporal e na massa magra. A ANCOVA consegue determinar se o gasto energético diferia se ambos os grupos tinham o mesmo peso corporal ou massa magra. No entanto, para calcular o gasto energético com o mesmo peso corporal/massa magra utilizando ANCOVA, a correlação entre o covariato (peso corporal/massa magra) e a variável (gasto energético) deve ser semelhante entre os grupos. A similaridade desta correlação é testada usando o teste de Levene para igualdade de variância5.

A ANCOVA requer o uso de softwares de análise estatística mais avançados, como o SigmaPlot. Alternativamente, diferentes sites gratuitos podem ser usados5. Se a ANCOVA mostrar que o efeito observado entre os grupos não depende do valor da covariada (peso corporal/massa magra), o software testará se a média da variável (gasto energético, VO2, VCO2) é diferente entre os grupos em uma covariada semelhante (peso corporal/massa magra). O software oferecerá várias comparações com um teste estatístico sugerido. Se a significância estatística for alcançada, confirmará que o gasto energético é significativamente diferente entre os dois grupos de camundongos a qualquer valor de peso corporal. A equação de regressão para o modelo de inclinações iguais pode ser obtida a partir da análise, que pode ser usada em GraphPad ou outro software gráfico para gerar um gráfico para publicação6.

Modificações e solução de problemas
O sistema CLAMS usado neste protocolo é constituído por pequenas gaiolas que são muito diferentes das gaiolas domésticas que os ratos estão acostumados, que incluem cama. Além disso, os camundongos são animais sociais, e a necessidade de aloja-los individualmente, juntamente com uma nova gaiola sem roupa de cama, causa estresse inicial aos camundongos. Assim, é necessária uma aclimatação de pelo menos 2 dias para permitir que os ratos se adaptem aos seus novos ambientes e atenuem o estresse. Normalmente, a ingestão de alimentos volta ao que foi registrado em suas gaiolas no terceiro dia. Este período de aclimatação é desnecessário para avaliar a capacidade da BA de gastar energia, pois é realizada em camundongos anestesiados.

Pentobarbital é um barbiturato de ação curta que pode ser usado como um agente sedativo ou anestésico, mas também é usado para eutanásia em doses mais altas. Por uma razão desconhecida, às vezes notava-se que a eficácia do pentobarbital a 30 °C é diferente da temperatura ambiente. Portanto, é aconselhável testar diferentes doses pentobarbitais no modelo do mouse na termoneutralidade. Os principais efeitos adversos da pentobarbital incluem depressão respiratória e efeitos cardiovasculares, como redução da pressão arterial, volume de derrame e hipotensão8.

Limitações
Os receptores beta3-adrenérgicos são expressos em tecido adiposo e detectáveis no miocárdio, retina, vesícula biliar, cérebro, bexiga urinária e vasos sanguíneos9. Como tal, o CL-316.243 pode potencialmente aumentar o gasto energético nesses outros tecidos onde o receptor é expresso. No entanto, foi demonstrado que a maior parte do gasto energético induzido pelo CL-316.243 em camundongos de controle é dependente de UCP-1, uma proteína específica da BA10,11. É preciso levar em consideração que algumas modificações genéticas podem exacerbar as ações do CL-316.243 em outros tecidos. Além disso, a fração da respiração independente UCP1 ainda pode ser impulsionada por ciclos fúteis que consomem ATP descritos em tecido adiposo ativado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram não haver conflito de interesses neste artigo protocolar. M.L. é co-fundador e consultor da Enspire Bio LLC.

Acknowledgments

ML é financiado pelo Departamento de Medicina da UCLA, subsídios piloto do P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) e P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CLAMS-Oxymax System Columbus Instruments CLAMS-center feeder-ENC Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software HP/Columbus N/A PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) Fisher Scientific 23-116681 Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition Echo-MRI Echo-MRI 100 Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243 Sigma C5976 Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet Research Diets D12266B Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal Pharmacy at DLAM N/A Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator) Praxair NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Heymsfield, S. B., et al. Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models. Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).
  3. Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling. Physiological Reports. 2 (9), 12159 (2014).
  4. Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nature. 9 (1), 57-63 (2011).
  5. Mina, A. I., et al. CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).
  6. Shum, M., et al. ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity. Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).
  7. Assali, E. A., et al. NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue. Nature Communication. 11 (1), 3347 (2020).
  8. Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).
  9. Schena, G., Caplan, M. J. Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask). Cells. 8 (4), 357 (2019).
  10. Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).
  11. Szentirmai, E., Kapas, L. The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses. Scientific Reports. 7 (1), 958 (2017).

Tags

Biologia Edição 177
Determinando o gasto energético basal e a capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia em camundongos obesos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M.… More

Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M. Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice. J. Vis. Exp. (177), e63066, doi:10.3791/63066 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter