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Neuroscience

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/63073
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung von Unterschieden im basalen Redoxzustand und in den Redoxreaktionen auf akute Störungen in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen unter Verwendung der konfokalen Live-Mikroskopie. Das Protokoll kann mit minimalen Modifikationen auf andere Zelltypen und Mikroskope angewendet werden.

Abstract

Die mitochondriale Redoxhomöostase ist wichtig für die neuronale Lebensfähigkeit und Funktion. Obwohl Mitochondrien mehrere Redoxsysteme enthalten, gilt der sehr häufige Thiol-Disulfid-Redoxpuffer Glutathion als zentraler Akteur in der antioxidativen Abwehr. Daher liefert die Messung des mitochondrialen Glutathion-Redoxpotentials nützliche Informationen über den mitochondrialen Redoxstatus und oxidativen Stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) ist ein genetisch kodierter, auf grün fluoreszierendem Protein (GFP) basierender ratiometrischer Indikator des Glutathion-Redoxpotentials, der zwei Redox-Zustands-sensitive Anregungspeaks bei 400 nm und 490 nm mit einem einzigen Emissionspeak bei 510 nm aufweist. Dieser Artikel beschreibt, wie man konfokale Live-Mikroskopie von Mitochondrien-gerichtetem Grx1-roGFP2 in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen durchführt. Es beschreibt, wie das mitochondriale Glutathion-Redoxpotenzial im Steady-State-Stadium beurteilt werden kann (z. B. zum Vergleich von Krankheitszuständen oder Langzeitbehandlungen) und wie Redoxveränderungen bei akuten Behandlungen gemessen werden können (am Beispiel des exzitoxischen Arzneimittels N-Methyl-D-Aspartat (NMDA). Darüber hinaus stellt der Artikel die Co-Imaging von Grx1-roGFP2 und dem mitochondrialen Membranpotentialindikator Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) vor, um zu demonstrieren, wie Grx1-roGPF2 mit zusätzlichen Indikatoren für multiparametrische Analysen gemultiplext werden kann. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung, wie (i) konfokale Laser-Scanning-Mikroskopeinstellungen optimiert, (ii) Medikamente zur Stimulation mit anschließender Sensorkalibrierung mit Diamid und Dithiothreitol angewendet und (iii) Daten mit ImageJ/FIJI analysiert werden.

Introduction

Mehrere wichtige mitochondriale Enzyme und Signalmoleküle unterliegen der Thiol-Redox-Regulation1. Darüber hinaus sind Mitochondrien eine wichtige zelluläre Quelle reaktiver Sauerstoffspezies und selektiv anfällig für oxidative Schäden2. Dementsprechend wirkt sich das mitochondriale Redoxpotential direkt auf die Bioenergetik, die Zellsignalisierung, die mitochondriale Funktion und letztendlich auf die Lebensfähigkeit der Zellen aus3,4. Die mitochondriale Matrix enthält hohe Mengen (1-15 mM) des Thiol-Disulfid-Redoxpuffers Glutathion (GSH), um die Redoxhomöostase aufrechtzuerhalten und die antioxidative Abwehr aufzubauen5,6. GSH kann kovalent an Zielproteine gebunden werden (S-Glutathionylierung), um ihren Redoxstatus und ihre Aktivität zu kontrollieren, und wird von einer Reihe von entgiftenden Enzymen verwendet, die oxidierte Proteine reduzieren. Daher ist das mitochondriale Glutathion-Redoxpotential ein sehr informativer Parameter bei der Untersuchung der mitochondrialen Funktion und Pathophysiologie.

roGFP2 ist eine Variante von GFP, die durch Zugabe von zwei oberflächenexponierten Cysteinen, die ein künstliches Dithiol-Disulfid-Paar bilden, redoxempfindlich gemacht wurde7,8. Es hat einen einzelnen Emissionspeak bei ~510 nm und zwei Anregungsspitzen bei ~400 nm und 490 nm. Wichtig ist, dass die relativen Amplituden der beiden Anregungsspitzen vom Redoxzustand von roGFP2 abhängen (Abbildung 1), was dieses Protein zu einem ratiometrischen Sensor macht. Im Grx1-roGFP2-Sensor wurde humanes Glutaredoxin-1 (Grx1) mit dem N-Terminus von roGFP29,10 verschmolzen. Die kovalente Bindung des Grx1-Enzyms an roGFP2 ermöglicht zwei wesentliche Verbesserungen des Sensors: Es macht die Sensorantwort spezifisch für das GSH/GSSG-Glutathion-Redox-Paar (Abbildung 1) und beschleunigt das Gleichgewicht zwischen GSSG und roGFP2 um einen Faktor von mindestens 100.0009. Daher ermöglicht Grx1-roGFP2 eine spezifische und dynamische Abbildung des zellulären Glutathion-Redoxpotentials.

Grx1-roGFP2-Bildgebung kann auf einer Vielzahl von Mikroskopen durchgeführt werden, einschließlich Weitfeldfluoreszenzmikroskopen, rotierenden konfokalen Scheibenmikroskopen und konfokalen Laserscanning-Mikroskopen. Die Expression des Sensors in primären Neuronen kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, darunter Lipofektion11, DNA/Calcium-Phosphat-Kopräzipitation12, virusvermittelter Gentransfer oder die Verwendung transgener Tiere als Zellquelle (Abbildung 2). Pseudotypisierte rekombinante adeno-assoziierte Viren (rAAV), die ein 1:1-Verhältnis von AAV1- und AAV2-Kapsidproteinen 13,14 enthielten, wurden für die Experimente in diesem Artikel verwendet. Mit diesem Vektor wird die maximale Sensorexpression typischerweise 4-5 Tage nach der Infektion erreicht und bleibt mindestens zwei Wochen lang stabil. Wir haben Grx1-roGFP2 erfolgreich in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen von Mäusen und Ratten eingesetzt.

In diesem Artikel wird die rAAV-vermittelte Expression von Mitochondrien-gerichtetem Grx1-roGFP2 in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen der Ratte verwendet, um den basalen mitochondrialen Glutathion-Redoxzustand und seine akute Störung zu beurteilen. Für die konfokale Live-Bildgebung wird ein Protokoll mit detaillierten Anweisungen bereitgestellt, wie (i) die Einstellungen für konfokale Laserscanning-Mikroskope optimiert, (ii) ein Live-Imaging-Experiment durchgeführt und (iii) Daten mit FIJI analysiert werden können.

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Protocol

Alle Tierversuche entsprachen den nationalen und institutionellen Richtlinien, einschließlich der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments des Rates, und verfügten über eine vollständige ethische Genehmigung des Innenministeriums (Tierwohlamt der Universität Heidelberg und Regierungspraesidium Karlsruhe, Lizenzen T14/21 und T13/21). Primäre Hippocampus- und kortikale Neuronen wurden aus neugeborenen Maus- oder Rattenwelpen nach Standardverfahren hergestellt und wie zuvor beschrieben für 12-14 Tage aufrechterhalten13.

1. Herstellung von Lösungen

  1. Standardlösungen für Imaging-Puffer
    1. Bereiten Sie jede Stammlösung gemäß Tabelle 1 vor und bewahren Sie sie bei 4 °C auf. Für die Langzeitlagerung (>3 Monate) die Aliquots bei -20 °C aufbewahren.
Bestandteil MW Konzentration (M) Betrag (g) Volumen (ml)
NaCl 58.44 5 14.61 50
Kcl 74.55 3 1.12 5
MgCl2· 6H2O 203.3 1.9 2 5
CaCl2·2H2O 147.01 1 1.47 10
Glycin 75.07 0.1 0.375 50
Saccharose 342.3 1.5 25.67 50
Natriumpyruvat 110.04 0.1 0.55 50
HEPES 238.3 1 11.9 50
Traubenzucker 180.15 2.5 45 100

Tabelle 1: Lagerlösungen für den Imaging-Puffer.

  1. Stammlösungen von Arzneimitteln und Farbstoffen
    1. Diamid (DA; wird zur Kalibrierung im Verhältnis maximal 405:488 verwendet) in Wasser gelöst, um eine Stammlösung von 0,5 M (z. B. 1 g in 11,615 ml Wasser) zu erhalten. Aliquot und bei -20 °C lagern.
    2. Lösen Sie Dithiothreitol (DTT; zur Kalibrierung mit einem Mindestverhältnis von 405:488) in Wasser auf, um eine Stammlösung von 1 M (z. B. 5 g in 32,425 ml Wasser) zu erhalten. Aliquot und bei -20 °C für maximal 3 Monate lagern.
    3. Lösen Sie N-Methyl-D-Aspartat (NMDA; wird verwendet, um Exzitotoxizität und mitochondriale Oxidation zu induzieren) in Wasser, um eine 10 mM Stammlösung (z. B. 25 mg in 16,991 ml Wasser) zu erhalten. Lagern Sie die Aliquots bei -20 °C. Für die Langzeitlagerung (>6 Monate) halten Sie die Aliquots bei -80 °C.
    4. Tetramethylrhodaminethylesterperchlorat (TMRE; ein niedermolekularer Indikator für das mitochondriale Membranpotential)
      1. TMRE-Pulver in Methanol auflösen, um einen 20 mM-Bestand zu erhalten (z. B. 25 mg in 2,427 ml Methanol).
      2. Verdünnen Sie den 20 mM-Bestand 1:1.000 in Methanol, um einen 20 μM-Stamm zu erhalten.
      3. Aliquot die 20 mM und 20 μM Lagerlösungen, mit Parafolie versiegeln und lichtgeschützt bei -20 °C lagern.
        HINWEIS: Beide Lagerlösungen sind über mehrere Jahre stabil. Verwenden Sie die 1.000-fache Stammlösung (20 μM) für Experimente.
  2. Imaging-Puffer
    1. Bereiten Sie 100 ml Bildpuffer vor, indem Sie alle Komponenten aus Tabelle 2 bis 80 mL sterilem Wasser in einen Messzylinder geben. Bringen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf bis zu 100 ml. Mischen Sie durch vorsichtiges Schütteln des Messzylinders, bis die Lösung homogen erscheint.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Osmometer zu verwenden, um die Osmolarität des Puffers zu überprüfen. Es sollte so nah wie möglich am Wachstumsmedium der Zellen sein. Hier sind dies 315 mOsmol / L. Erhöhen oder verringern Sie die Saccharosekonzentration nach Bedarf, um die Osmolarität des Bildgebungspuffers und des Wachstumsmediums anzupassen.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Aliquots herstellen und bis zu zwei Wochen bei 4 °C aufbewahren. Für die Langzeitlagerung halten Sie die Aliquots bei -20 °C. Lassen Sie den Bildpuffer vor Gebrauch Raumtemperatur erreichen.
Bestandteil Stammlösung (M) Endkonzentration (mM) Volumen (ml)
NaCl 5 114 2.3
Kcl 3 5.29 0.176
MgCl2 1.9 1 0.053
CaCl2 1 2 0.2
Glycin 0.1 0.005 0.005
Saccharose 1.5 52 3.5
Natriumpyruvat 0.1 0.5 0.5
HEPES 1 10 1
Traubenzucker 2.5 5 0.2

Tabelle 2: Zusammensetzung des Abbildungspuffers. Die angegebenen Volumina werden für die Herstellung von 100 ml Bildgebungspuffer verwendet.

  1. Lösungen für Stimulation und Kalibrierung
    HINWEIS: Bereiten Sie immer frische Stimulationslösungen vor, indem Sie kurz vor dem Experiment Standardlösungen der angegebenen Medikamente in den Bildgebungspuffer geben. Lösungen für Stimulation und Kalibrierung werden der Bildgebungskammer nacheinander während eines Experiments hinzugefügt (siehe Abschnitte 3-5). Je nach Art des Experiments werden unterschiedliche Lösungen benötigt, um die gleiche Endkonzentration im jeweiligen Endvolumen in der Bildgebungskammer zu erreichen.
    1. 3x NMDA-Lösung (90 μM; Endkonzentration in der Kammer: 30 μM) durch Zugabe von 63 μL eines 10 mM NMDA-Materials zu 6,937 ml Bildpuffer herstellen. 500 μL der resultierenden Lösung in die Kammer geben (Endvolumen: 1,5 mL).
    2. Bereiten Sie 2x DA-Lösung für die Schritte 3 und 4 (1 mM; Endkonzentration in der Kammer: 0,5 mM) vor, indem Sie 14 μL eines 0,5 M DA-Stammes zu 6,986 mL Bildgebungspuffer hinzufügen. 1 mL in die Kammer geben (Endvolumen: 2 mL).
    3. Bereiten Sie 4x DA-Lösung für Schritt 5 (2 mM; Endkonzentration in der Kammer: 0,5 mM) vor, indem Sie 28 μL eines 0,5 M DA-Materials zu 6,972 ml Bildgebungspuffer hinzufügen. 500 μL in die Kammer geben (Endvolumen: 2 mL).
    4. 1x DTT-Lösung (5 mM; Endkonzentration in der Kammer: 5 mM) durch Zugabe von 45 μL 1 M DTT-Stamm zu 8955 μL Bildgebungspuffer herstellen. 1 mL dieser Lösung nach Dem Absaugen des Bildgebungspuffers in die Kammer geben (Endvolumen: 1 mL).

2. Beladung von Zellen mit TMRE

HINWEIS: In diesem Protokoll wird TMRE im Nicht-Quench-Modus15 bei einer Endkonzentration von 20 nM verwendet. Im Allgemeinen sollte die niedrigstmögliche Konzentration von TMRE verwendet werden, die auf dem Mikroskop der Wahl immer noch eine ausreichende Signalintensität liefert. Aufgrund der ungleichmäßigen Verdunstung kann das Volumen des Mediums in verschiedenen Vertiefungen in langfristigen Primärkulturen unterschiedlich sein. Um eine konsistente TMRE-Konzentration in allen Bohrlöchern zu gewährleisten, fügen Sie TMRE nicht direkt zu den Bohrlöchern hinzu. Ersetzen Sie stattdessen das Medium in jeder Vertiefung durch die gleiche Menge an TMRE-haltigem Medium. Das folgende Protokoll ist für primäre Neuronen in 24-Well-Platten konzipiert, die ~ 1 ml Medium pro Vertiefung enthalten.

  1. Wenn Sie in einer Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube arbeiten, sammeln Sie 500 μL Medium aus jeder Vertiefung in einem einzigen konischen Rohr.
  2. Pro Vertiefung 0,5 μL 20 μM TMRE-Material in das konische Rohr geben (z. B. 12 μL für 24 Vertiefungen).
  3. Das verbleibende Medium aus der ersten Vertiefung vorsichtig absaugen und durch 500 μL TMRE-haltiges Medium ersetzen. Fahren Sie mit den verbleibenden Bohrlöchern fort.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Zellen nicht austrocknen zu lassen und die Zellen nicht zu stören.
  4. Bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück und warten Sie mindestens 60 Minuten auf das Farbstoffgleichgewicht.
    HINWEIS: Die Ladezeit kann ohne nachteilige Auswirkungen auf mehrere Stunden verlängert werden.
  5. Um konsistente TMRE-Konzentrationen und Gleichgewichte während des gesamten Bildgebungsexperiments zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass eine Endkonzentration von 20 nM TMRE in den Bildgebungspuffer und alle Stimulationslösungen aufgenommen wird.

3. Optimierung der Einstellungen des konfokalen Rastermikroskops

HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, den besten Kompromiss zwischen Bildqualität und Zelllebensfähigkeit während der Live-Bildgebung zu finden. In diesem Abschnitt wird die Optimierung der Einstellungen für das roGFP-Imaging beschrieben. Wenn eine multiparametrische Bildgebung durchgeführt wird, muss für die zusätzlichen Indikatoren eine ähnliche Optimierung durchgeführt werden, einschließlich der Überprüfung auf eine stabile Baseline ohne Anzeichen von Bleichung oder Phototoxizität.

  1. Starten Sie das konfokale Mikroskop und laden Sie die Standardeinstellungen für die GFP-Bildgebung (488 nm Anregung, 505 - 550 nm Emission).
  2. Stellen Sie den Detektor auf 12 Bit oder 16 Bit ein.
    HINWEIS: Normalerweise reichen 8 Bit für die quantitative Bildgebung nicht aus.
  3. Aktivieren Sie den sequenziellen Scan-Modus und fügen Sie eine zweite Sequenz/Spur hinzu (405 nm Anregung, 505 - 550 nm Emission).
  4. Wählen Sie für beide Kanäle eine Pseudofarb-Nachschlagetabelle aus, die über- und unterbelichtete Pixel angibt (z. B. GLOW OU).
  5. Wählen Sie ein Ziel aus, das für das Objekt von Interesse geeignet ist.
    HINWEIS: 10x-40x sind für die Einzelzellanalyse geeignet, 63x-100x sind für die Einzel-Mitochondrien-Analyse geeignet.
  6. Montieren Sie einen Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer, fügen Sie 1 ml Bildgebungspuffer hinzu und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop.
  7. Verwenden Sie das Okular und das durchgelassene Licht, um die Zellen zu fokussieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie kein Epifluoreszenzlicht, um Zellen zu lokalisieren und zu fokussieren. Selbst bei geringer Leistung wirkt sich dies nachteilig auf die Zellen aus.
  8. Nehmen Sie Bilder mit verschiedenen Pixelformaten auf. Wählen Sie anhand dieser Bilder die niedrigste Pixelzahl aus, die eine akzeptable Auflösung der interessierenden Struktur ergibt.
    HINWEIS: Typischerweise eignen sich 512 x 512 Pixel gut für Einzelzellenaufnahmen mit 20-fachen und 40-fachen Objektiven, und 1024 x 1024 oder 2048 x 2048 Pixel eignen sich in der Regel gut für Einzel-Mitochondrien-Aufnahmen mit einem 63-fachen Objektiv.
  9. Nehmen Sie Bilder mit unterschiedlichen Lochgrößen auf. Wählen Sie anhand dieser Bilder die größte Lochgröße aus, die eine akzeptable Auflösung der interessierenden Struktur ergibt.
    HINWEIS: Typischerweise funktionieren 3-7 luftige Einheiten gut.
  10. Nehmen Sie Bilder mit unterschiedlichen Laserintensitäten auf.
    1. Passen Sie die Detektorverstärkung und den Schwellenwert entsprechend an. Wählen Sie anhand dieser Bilder die niedrigste Laserintensität aus, die eine akzeptable Signalintensität und ein Signal-Hintergrund-Verhältnis ergibt.
      1. Um das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu bestimmen, messen Sie die Signalintensität in einer Region of Interest (ROI), die Zellen oder Mitochondrien enthält (ROI1) und in einem ROI ohne Zellen oder Mitochondrien (ROI2). Teilen Sie dann die Intensität von ROI1 durch die Intensität von ROI2.
        HINWEIS: Streben Sie ein Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis von >3 und Signalintensitäten einzelner ROIs von 200-1.000 für 405 nm Anregung mit 1-3% Laserleistung und Intensitäten einzelner ROIs von 300-1.500 für 488 nm Anregung mit 1% Laserleistung an.
  11. Zeichnen Sie Bilder mit unterschiedlichen Scangeschwindigkeiten und Der Anzahl der Frame-Durchschnittswerte auf. Nehmen Sie 4-5 Bilder für jede Kombination von Einstellungen auf. Wählen Sie basierend auf diesen Bildserien die Einstellungen für die höchste Geschwindigkeit und den niedrigsten Durchschnitt aus, die ein akzeptables Bildrauschen und eine Bild-zu-Bild-Variabilität ergeben.
    HINWEIS: Eine Scangeschwindigkeit von 600 Hz und 1-2 Frames für die Mittelwertbildung funktionieren in den meisten Fällen gut.
  12. Nehmen Sie mit einem neuen Deckglas eine Zeitrafferserie mit den optimierten Einstellungen auf.
    HINWEIS: Die Dauer und das Bildintervall der Serie sollten denen der geplanten Experimente ähneln.
  13. Am Ende der Zeitraffer-Serie fügen Sie 1 ml 2x DA-Lösung in die Aufnahmekammer hinzu. Bild für weitere 2 min.
  14. Aspirieren Sie den Bildpuffer mit einer Peristaltikpumpe oder einer Handpipette. Fügen Sie 1 ml 1x DTT-Lösung hinzu. Bild für weitere 5 min.
  15. Analysieren Sie das Zeitrafferexperiment (siehe Abschnitt 5).
    1. Stellen Sie mit den optimierten Einstellungen sicher, dass keiner der beiden Kanäle während der DA- und DVB-T-Behandlung über- oder unterbelichtet wird.
    2. Stellen Sie sicher, dass keiner der beiden Kanäle während der Zeitrafferaufnahme eine erhebliche Bleiche aufweist. <2% Intensitätsverlust zwischen dem ersten und dem letzten Bild anstreben.
    3. Stellen Sie sicher, dass sich das Verhältnis 405:488 während der Bildgebung nicht wesentlich ändert.
  16. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang iterativ mit mehreren Deckgläsern, bis Einstellungen definiert sind, die konsistent akzeptable Ergebnisse liefern.

4. Beurteilung des basalen Redoxstatus

  1. Starten Sie das Mikroskop und laden Sie die optimierten Einstellungen aus Abschnitt 3.
  2. Legen Sie den Frame-Durchschnitt auf 3-5 fest.
  3. Montieren Sie einen Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer, fügen Sie 1 ml Bildgebungspuffer hinzu und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop.
  4. Verwenden Sie das Okular und das durchgelassene Licht, um die Zellen zu fokussieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie kein Epifluoreszenzlicht, um Zellen zu lokalisieren und zu fokussieren. Selbst bei geringer Leistung wirkt sich dies nachteilig auf die Zellen aus.
  5. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie den 488-nm-Kanal in der Live-Ansicht , um Zellen für die Bildgebung zu fokussieren und zu lokalisieren.
  6. Verwenden Sie die Multipoint-Funktion , um 3-5 Sichtfelder auf dem Deckglas auszuwählen.
  7. Zeichnen Sie ein Baselinebild auf.
  8. 1 ml 2x DA-Lösung in die Kammer geben.
  9. Verwenden Sie nach 1, 2 und 3 Minuten die Live-Ansicht , um den Fokus zu bestätigen / anzupassen, und nehmen Sie dann ein Bild auf.
    HINWEIS: Die Zellen werden typischerweise nach 2 min vollständig oxidiert.
  10. Ersetzen Sie den Puffer in der Bildgebungskammer durch 1 ml 1x DTT-Lösung.
  11. Verwenden Sie nach 3 und 5 Minuten die Live-Ansicht , um den Fokus zu bestätigen / anzupassen und dann ein Bild aufzunehmen.
    HINWEIS: Die Zellen sind in der Regel nach 4-5 Minuten vollständig reduziert.

5. Live-Bildgebung von Akutbehandlungen

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Bildgebung des mitochondrialen Redox-Ansprechens auf die NMDA-Behandlung. Bildintervalle und Dauer des Experiments müssen möglicherweise für andere Behandlungen angepasst werden.

  1. Starten Sie das Mikroskop und laden Sie die optimierten Einstellungen aus Abschnitt 3.
  2. Stellen Sie das Zeitrafferintervall auf 30 s und die Dauer auf 25 min ein.
  3. Montieren Sie einen Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer, fügen Sie 1 ml Bildgebungspuffer hinzu und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop.
    HINWEIS: Um eine thermische Fokusdrift zu vermeiden, lassen Sie die Zellen 10-15 Minuten auf dem Mikroskoptisch, bevor Sie mit der Zeitrafferaufnahme beginnen.
  4. Verwenden Sie das Okular und das durchgelassene Licht, um die Zellen zu fokussieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie kein Epifluoreszenzlicht, um Zellen zu lokalisieren und zu fokussieren. Selbst bei geringer Leistung wirkt sich dies nachteilig auf die Zellen aus.
  5. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie den 488-nm-Kanal in der Live-Ansicht , um Zellen für die Bildgebung zu fokussieren und zu lokalisieren.
  6. Optional: Um die Anzahl der aufgezeichneten Zellen pro Durchlauf zu erhöhen, verwenden Sie die Multipoint-Funktion , um 2-3 Sichtfelder pro Deckglas abzubilden.
  7. Starten Sie die Zeitrafferaufnahme und nehmen Sie 5 Bilder als 2-minütige Baseline-Aufnahme auf.
  8. Geben Sie 500 μL 3x NMDA-Lösung in die Kammer (Endkonzentration 30 μM) und zeichnen Sie weitere 20 Bilder als 10-minütige NMDA-Antwort auf.
    HINWEIS: Neuronen reagieren sehr empfindlich auf Veränderungen der Osmolarität. Stellen Sie daher sicher, dass die Verdunstung des Bildpuffers minimiert wird. Bei längeren Behandlungen sollte die Bildgebungskammer mit einem Deckel abgedeckt werden.
  9. Geben Sie 500 μL 4x DA-Lösung in die Kammer und nehmen Sie 6 weitere Bilder auf (maximale Kalibrierung 3 Minuten).
  10. Saugen Sie den Puffer aus der Bildgebungskammer ab und ersetzen Sie ihn durch 1 ml 1x DTT-Lösung. Nehmen Sie 10 weitere Bilder auf (mindestens 5 Minuten Kalibrierung).
  11. Beenden Sie die Aufnahme und speichern Sie die Bildserie.

6. Datenanalyse

  1. Datenimport und Bildvorverarbeitung in FIDSCHI
    1. Verwenden Sie den Bioformat-Importer , um eine Gruppe von Bildern aus Schritt 4 oder eine Bilddatei aus Schritt 5 zu öffnen. Klicken Sie auf Plugins | Bio-Formate | Bioformat-Importer. Verwenden Sie im Dialogfeld View stack with: Hyperstack, legen Sie Color mode: default fest, wählen Sie Autoscale aus, und teilen Sie sich nicht in separate Fenster auf.
      HINWEIS: Die automatische Skalierung optimiert die Anzeige der Daten auf dem Computerbildschirm. Die Pixelintensitäten werden nicht geändert.
    2. Wenn einzelne Bilder aus Schritt 4 geöffnet wurden, klicken Sie auf Bild | Stapel | Werkzeuge | Verketten Sie sie, um sie zu einem Einzelbildstapel zusammenzuführen.
    3. Wenn es während der Bildserie zu einer XY-Drift kommt, klicken Sie auf Plugins | StackReg , um die Bilder zu registrieren. Wählen Sie im Dialogfenster Starrkörper (Rigid Body ) oder Übersetzung (Translation).
    4. Ändern Sie das Bildformat auf 32 Bit, indem Sie auf Bild | Typ | 32-Bit.
    5. Teilen Sie die Farbkanäle in separate Fenster auf, indem Sie auf Bild | | Geteilte Kanäle.
    6. Wählen Sie Kanal 1 (405 nm) und passen Sie den Schwellenwert an, um die Mitochondrien für die Analyse auszuwählen, indem Sie auf Bild | | anpassen Schwellenwert. Wählen Sie im Dialogfeld Standard, Rot, Dunkler Hintergrund und Histogramm stapeln aus, und warten Sie, bis die ausgewählten Pixel rot angezeigt werden. Klicken Sie auf Übernehmen. Wählen Sie Hintergrundpixel auf NaN festlegen und Alle Bilder verarbeiten aus.
      HINWEIS: Um potenzielle Beobachterverzerrungen zu vermeiden, sollte eine automatisierte Schwellenwertbestimmung verwendet werden. FIJI bietet mehrere automatisierte Methoden (z. B. Default, Huang, Intermodes, Otsu), die aus einem Dropdown-Menü im Dialogfeld "Schwellenwert" ausgewählt werden können. In der Regel liefert die Default-Methode ein gutes Ergebnis. Es wird empfohlen, während der ersten Analyse mehrere Methoden zu vergleichen, um die beste Schwellenwertmethode für den angegebenen Bildsatz zu finden. Sobald eine Methode ausgewählt wurde, muss sie auf alle Bilder angewendet werden.
    7. Wiederholen Sie Schritt 6.1.6 für Kanal 2 (488 nm).
    8. Erstellen Sie ein Verhältnisbild, um das Verhältnis 405:488 nm zu visualisieren, indem Sie auf Process | Bildrechner. Wählen Sie im Dialogfeld Bild 1: Kanal 1, Operation: Teilen, Bild 2: Kanal 2, Neues Fenster erstellen, Alle Bilder verarbeiten.
    9. Ändern Sie die Nachschlagetabelle des Verhältnisbilds in pseudocolor. Um beispielsweise zu Fire zu wechseln, klicken Sie auf Image | Nachschlagetabellen | Feuer.
  2. Bildanalyse
    1. Zeichnen Sie auf dem Verhältnisbild ROIs um einzelne Zellen oder Mitochondrien. Nachdem Sie jeden ROI gezeichnet haben, fügen Sie ihn dem ROI-Manager hinzu. analysieren | Werkzeuge | ROI Manager | Hinzufügen. (Tastenkombination: 'T') Wählen Sie Alle anzeigen aus.
      HINWEIS: Da Hintergrundpixel in den Schritten 6.1.6 und 6.1.7 auf "keine Zahl" (NaN) festgelegt wurden, wirken sie sich nicht auf das Ergebnis der Messung aus. Daher ist es akzeptabel, einige Hintergrundpixel in den ROI einzubeziehen.
    2. Messen Sie die 405:488-Verhältnisse einzelner Zellen, indem Sie auf ROI Manager | Strg+A klicken, um alle ROIs | Weitere | Multi-Maßnahme. Wählen Sie im Dialogfeld Alle Segmente messen und Eine Zeile pro Segment aus.
    3. Exportieren Sie die Messungen in eine Tabellenkalkulationssoftware.
    4. Wählen Sie das 405-nm-Bild aus. Messen Sie die Intensitäten aller ROIs wie in Schritt 6.2.2. mit den ROIs, die im ROI-Manager gespeichert sind.
    5. Exportieren Sie die Messungen in eine Tabellenkalkulationssoftware.
    6. Wählen Sie das 488-nm-Bild aus. Messen Sie die Intensitäten aller ROIs wie in Schritt 6.2.2. mit den ROIs, die im ROI-Manager gespeichert sind.
    7. Exportieren Sie die Messungen in eine Tabellenkalkulationssoftware.
    8. Speichern Sie ROIs zur späteren Bezugnahme, indem Sie auf ROI Manager | Strg+A klicken, um alle ROIs | Weitere | Speichern.
    9. Empfohlen: Generieren Sie Intensitäts- und Zeitdiagramme der 405- und 488-nm-Spuren. Stellen Sie sicher, dass in keinem der Kanäle eine ausgeprägte Bleiche auftritt (die Signalintensität am Ende der Bildgebungsserie sollte ≥98 % des ersten Bildes betragen) und dass sich die beiden Spuren während der Sensorreaktionen in entgegengesetzte Richtungen bewegen (z. B. sollte die 405-nm-Spur während der Oxidation zunehmen, während die 488-nm-Spur abnehmen sollte).
  3. Datennormalisierung
    1. Bestimmen Sie für jeden ROI aus dem Verhältnisbild den Maximalwert während der DA-Behandlung (Rmax) und den Minimalwert während der DTT-Behandlung (Rmin).
    2. Berechnen Sie das normalisierte Verhältnis wie folgt:
      Equation 1
      HINWEIS: Dadurch wird das maximale Verhältnis auf 1,0 und das minimale Verhältnis auf 0 festgelegt.
  4. Analyse der mitochondrialen Morphologie
    1. Um Messungen der mitochondrialen Morphologie parallel zu den roGFP-Intensitäten in Schritt 6.2.6 zu erhalten, gehen Sie zu analysieren | Stellen Sie Maße ein und aktivieren Sie Formdeskriptoren und Ellipse anpassen.
      HINWEIS: Zusätzlich zur mittleren Intensität umfassen die Messungen im Ergebnisfenster die Länge der Hauptachse (Major), die Länge der Nebenachse (Minor), das Seitenverhältnis (AR; Hauptachse geteilt durch die Nebenachse; runde Mitochondrien haben einen AR ~ 1, längliche Mitochondrien haben eine größere AR) sowie Messungen der Zirkularität (Circ.) und Rundheit (Round).

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Representative Results

Quantifizierung von Unterschieden im stationären mitochondrialen Redoxzustand nach Wachstumsfaktorentzug
Um die Quantifizierung von Steady-State-Unterschieden im mitochondrialen Redoxzustand zu demonstrieren, wurden primäre Neuronen, die in einem Standardmedium gezüchtet wurden, mit Neuronen verglichen, die 48 Stunden vor der Bildgebung ohne Wachstumsfaktoren kultiviert wurden. Der Entzug des Wachstumsfaktors führt nach 72 h16 zum apoptotischen neuronalen Zelltod. Die Zellen wurden nach 48 h abgebildet, um zu testen, ob dem Veränderungen des mitochondrialen Redoxzustands vorausgehen. Primäre kortikale Neuronen von Ratten, die auf Poly-L-Ornithin-beschichteten Deckgläsern gezüchtet wurden, wurden an Tagen in vitro 6 (DIV6) mit rAAV-mito-Grx1-roGFP2 infiziert und auf DIV12 abgebildet. Die Live-Bildgebung wurde bei Raumtemperatur gemäß Abschnitt 4 dieses Protokolls auf einem invertierten Konfokalmikroskop mit Laserscanning durchgeführt, das mit einem 40x/1,10 Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet war. Konfokale Einstellungen waren Loch 7 luftige Einheiten, Pixelgröße 568,7 nm (512 x 512 Pixel), Scangeschwindigkeit 600 Hz, Laserleistung 405 nm 3%, Laserleistung 488 nm 1%, Emissionsbandbreite 505-550 nm und Frame-Durchschnitt 4. Es gab keinen großen Unterschied zwischen den rohen 405:488 nm Verhältnissen der beiden Bedingungen (Abbildung 3B). Nach der Datennormalisierung war eine Untergruppe von Zellen mit einem erhöhten Verhältnis von 405:488 nm in der Wachstumsfaktorentzugsgruppe nachweisbar (Abbildung 3C). Dies deutet darauf hin, dass mitochondriale Redoxveränderungen dem neuronalen Zelltod vorausgehen könnten, und unterstreicht die Relevanz der Max/min-Datennormalisierung für den Vergleich basaler Redoxzustände zwischen Gruppen.

Dynamische Veränderungen des mitochondrialen Redoxzustands bei der Behandlung von Neuronen mit NMDA
Der NMDA-Typ Glutamatrezeptor (NMDAR) spielt eine zentrale Rolle bei der neuronalen Plastizität, kann aber auch neuronale Schäden und Zelltod vermitteln. Die pathologische Aktivierung des NMDAR führt zu mehreren nachteiligen Auswirkungen auf die Mitochondrien, darunter Matrix-Calcium-Überlastung, mitochondriale Oxidation und Fragmentierung sowie mitochondrialer Permeabilitätsübergang. In einer früheren Studie wurde das oben beschriebene Protokoll verwendet, um einen kausalen Zusammenhang zwischen NMDA-induzierter mitochondrialer Kalziumüberlastung und mitochondrialer Oxidation zu untersuchen13. Primäre Hippocampus-Neuronen von Ratten, die auf Poly-D-Lysin/Laminin-beschichteten Deckgläsern gezüchtet wurden, wurden mit rAAV-mito-Grx1-roGFP2 auf DIV4 infiziert und auf DIV12 abgebildet. Die Live-Bildgebung wurde bei 37 °C an einem konfokalen Invertiertscheibenmikroskop durchgeführt, das mit einem 20x/0,75 Multi-Immersionsobjektiv (Wasserimmersion wurde verwendet) und einem Inkubationssystem auf der Bühne ausgestattet war. Mito-Grx1-roGFP2 wurde alle 20 sequentiell mit den 405 nm und 488 nm Laserlinien angeregt, und die Emission wurde mit einem 527/55 nm Emissionsfilter für beide Anregungswellenlängen gesammelt. Die Behandlung von Neuronen mit 30 μM NMDA verursachte innerhalb weniger Minuten eine Oxidation der Mitochondrien (Abbildung 4A,B). Insbesondere die NMDA-induzierte mitochondriale Azidose verursachte eine signifikante Abschreckung der roGFP2-Fluoreszenz, im Einklang mit ihrer bekannten pH-Sensitivität8. Um zu bestätigen, dass diese pH-abhängige Abschreckung das Verhältnis 405:4889 nicht beeinflusste, wurden die Mitochondrien vor der Zugabe von NMDA in einem Kontrollexperiment vollständig durch DA oxidiert. Die Vorbehandlung mit DA schließt eine weitere Oxidation der Mitochondrien durch NMDA aus, und dementsprechend änderte sich das Verhältnis von 405:488 in diesem Experiment trotz einer erheblichen Abschreckung der roGFP2-Fluoreszenzintensität nicht (Abbildung 4C).

Multiparametrische Analyse von NMDA-induzierten Veränderungen dendritischer Mitochondrien
Um die zeitliche Abfolge von NMDA-induzierten Veränderungen der mitochondrialen Morphologie, des Membranpotentials und des Redoxzustands zu beurteilen, wurde eine parallele Bildgebung der TMRE- und Mito-Grx1-roGFP2-Fluoreszenz mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung durchgeführt. Primäre kortikale Rattenneuronen, die auf Poly-L-Ornithin-beschichteten Deckgläsern gezüchtet wurden, wurden mit rAAV-mito-Grx1-roGFP2 auf DIV6 infiziert und auf DIV12 abgebildet. Die Live-Bildgebung wurde bei Raumtemperatur auf einem invertierten konfokalen Laserscanning-Mikroskop mit einem 63x/1,40 Ölimmersionsobjektiv, einer Scangeschwindigkeit von 600 Hz, einer Pixelgröße von 90,2 nm (1024 x 1024 Pixel bei 2x Scanzoom), einer Lochgröße von 3 luftigen Einheiten und einem Frame-Durchschnitt von 2 durchgeführt. Alle 30 s wurden drei Bilder im sequenziellen Modus aufgenommen: 405 nm Anregung/505-550 nm Emission; 488 nm Anregung/505-550 nm Emission; 552 nm Anregung/560-600 nm Emission. Die Behandlung von Neuronen mit 60 μM NMDA führte zu einem Verlust des TMRE-Signals und einer Erhöhung des RoGFP-Verhältnisses von 405:488 nm, gefolgt von einer verzögerten Auffrischung der Mitochondrien (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Grx1-roGFP2-Funktion und der roGFP2-Anregungsspektren. (A) Oxidativer Stress und die Wirkung antioxidativer Abwehrsysteme oxidieren den zellulären Glutathionpool. Grx1 im Fusionsprotein Grx1-roGPF2 fördert das schnelle Gleichgewicht des roGFP2-Redoxzustands mit dem Redoxzustand des Glutathion-Pools. Der Redoxstatus des roGFP2-Pools kann durch Überwachung des Verhältnisses der GFP-Fluoreszenzemission bei 510 nm nach Anregung bei 405 nm und 488 nm beurteilt werden. Reduzierte Arten sind blau dargestellt; oxidierte Spezies sind rot dargestellt. (B) Anregungsspektren von vollständig reduziertem (blau) und oxidiertem (rot) roGFP2. Bei der Oxidation von roGFP2 nimmt die Fluoreszenzemission bei 400 nm Anregung zu, während die Emission bei 490 nm Anregung abnimmt. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung geändert13. Anregungsspektren in B wurden auf der Grundlage von Abbildung 1B aus 8 gezeichnet. Gepunktete Linien in B zeigen die Wellenlängen der üblicherweise verwendeten 405 nm und 488 nm Laserlinien an. Abkürzungen: GSH = Glutathion; GSSG = oxidiertes Glutathion; Grx = Glutaredoxin; roGFP = redoxsensitive grün fluoreszierende Proteinvariante. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Workflow der Methode. Die Expression des erregungsquotierten redoxsensitiven fluoreszierenden Proteins roGFP2 in Neuronen kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, die Transfektion, Lipofektion, viraler Gentransfer und transgene Tiere umfassen. Der Sensor kann verwendet werden, um den neuronalen Redoxzustand in kultivierten primären Neuronen, ex vivo Gewebeexplantaten und intakten Tieren zu untersuchen. RoGFP2-Bildgebung kann auf einer Vielzahl von Mikroskopen durchgeführt werden, darunter Weitfeld-Fluoreszenzmikroskope, konfokale Mikroskope und 2-Photonen-Mikroskope. Die Analyse von roGFP2-Bildgebungsdaten kann mit der frei verfügbaren Software ImageJ/FIJI durchgeführt werden. Abkürzung: roGFP = redoxsensitive grün fluoreszierende Proteinvariante. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Wachstumsfaktorentzug verursacht Oxidation neuronaler Mitochondrien. (A) Repräsentative Bilder von Neuronen im Verhältnis 405:488 nm, die in Gegenwart (+ GF) oder Abwesenheit (- GF) von Wachstumsfaktoren für 48 h vor der Bildgebung kultiviert wurden. Farbcodierte Skalen stellen nicht normalisierte 405:488 nm-Verhältnisse dar (niedrigere Verhältnisse entsprechen einem reduzierten Zustand; höhere Verhältnisse entsprechen einem oxidierten Zustand). Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Quantifizierung des 405:488 nm-Verhältnisses in einzelnen Neuronen. (C) Max/min kalibriertes 405:488 nm Verhältnis einzelner Neuronen. Runde Symbole stellen einzelne Zellen dar; bar stellt den Mittelwert dar. N = 40-44 Zellen aus 3 Deckgläsern aus einem Präparat. Abkürzung: GF = Wachstumsfaktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: NMDA-induzierte Oxidation neuronaler Mitochondrien. (A) Repräsentative Bilder im Verhältnis 405:488 nm vor und nach der Behandlung mit 30 μM NMDA und nach max/min Kalibrierung mit DA und DTT. Bei dieser Vergrößerung wird das roGFP-Signal hauptsächlich in den Soma- und proximalen Dendriten nachgewiesen. Die farbcodierte Skala stellt nicht normalisierte 405:488 nm-Verhältnisse dar (niedrigere Verhältnisse entsprechen einem reduzierten Zustand; höhere Verhältnisse entsprechen einem oxidierten Zustand). Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Quantifizierung des Bildgebungslaufs in A. NMDA induziert eine schnelle und anhaltende mitochondriale Oxidation, die mit DA und DTT kalibriert werden kann. (C) NMDA-induzierte mitochondriale Azidose verursacht einen Abfall der GFP-Fluoreszenz sowohl bei 405 nm als auch bei 488 nm Erregung (oberes Bild). Um den pH-getriebenen Effekt zu isolieren und zu bestätigen, dass das Verhältnis 405:488 nm pH-unempfindlich ist, wurden Neuronen zunächst maximal mit DA oxidiert und anschließend mit NMDA in Gegenwart von DA herausgefordert (unteres Panel). Unter diesen Bedingungen verursacht NMDA immer noch eine mitochondriale Azidose, aber keine weitere mitochondriale Oxidation. Obwohl sowohl die 405 nm- als auch die 488-nm-Spur einen pH-getriebenen Abfall der Fluoreszenzintensität zeigen, bleibt das Verhältnis von 405: 488 nm stabil. Diese Zahl ist von 13 modifiziert. Abkürzungen: GFP = grün fluoreszierendes Protein; roGFP = redoxsensitive grün fluoreszierende Proteinvariante; NMDA = N-Methyl-D-Aspartat; DA = Diamid; DTT = Dithiothreitol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: NMDA-induzierte Veränderungen des Membranpotentials, des Redoxzustands und der Morphologie dendritischer Mitochondrien. (A) Drei Bilder mit hoher Vergrößerung aus einem Zeitrafferexperiment, aufgenommen bei t = 1, 4 und 9 min, die dendritische und axonale Mitochondrien zeigen. Die Kolorierung stellt die TMRE-Intensität dar (siehe Kalibrierungsbalken). (B) Bilder mit einem RoGFP-Verhältnis von 405:488 nm aus demselben Zeitrafferexperiment wie in (A) bei t = 1, 4 und 9 min. Beachten Sie, dass aufgrund der begrenzten AAV-Infektionseffizienz nur eine Untergruppe von Neuronen mito-Grx1-roGFP2 exprimiert und daher nicht alle TMRE-positiven Mitochondrien roGFP-positiv sind. Der farbcodierte Kalibrierbalken stellt nicht normalisierte 405:488 nm-Verhältnisse dar (niedrigere Verhältnisse entsprechen einem reduzierten Zustand; höhere Verhältnisse entsprechen einem oxidierten Zustand). (C) Quantifizierung der TMRE-Intensität, des roGFP-405:488-nm-Verhältnisses und der Rundheit eines einzelnen Mitochondriums (angezeigt durch Pfeile in A, B). Nach 1 Minute Baseline-Aufzeichnung wurden 60 μM NMDA in die Badlösung gegeben. Maßstabsbalken = 5 μm. Die y-Achse in C zeigt das RoGFP-Verhältnis von 405:488 nm relativ zur Baseline T0 (grüne gestrichelte Linie), die TMRE-Fluoreszenzintensität relativ zur Basislinie T0 (rote gepunktete Linie) und den FIJI/ImageJ-Formdeskriptor "Rundheit" (schwarze durchgezogene Linie). Abkürzungen: GFP = roGFP = redoxsensitive grün fluoreszierende Proteinvariante; mito-Grx1-roGFP2 = Glutaredoxin-1 fusioniert mit N-Terminus von roGFP; AAV = Adeno-assoziierter Virus; TMRE = Tetramethylrhodamin, Ethylester; NMDA = N-Methyl-D-Aspartat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Quantitative und dynamische Messungen des mitochondrialen Redoxzustandes liefern wichtige Informationen über die mitochondriale und zelluläre Physiologie. Es stehen mehrere fluorogene chemische Sonden zur Verfügung, die reaktive Sauerstoffspezies, "Redoxstress" oder "oxidativen Stress" erkennen. Die letztgenannten Begriffe sind jedoch nicht klar definiert und haben oft keine Spezifität9,17,18. Im Vergleich zu chemischen Farbstoffen bietet Grx1-roGFP2 mehrere Vorteile9,19: (i) Als anregungs-ratiometrischer Sensor bietet er eine inhärente Normalisierung für das Sensorexpressionsniveau, die absolute Fluoreszenzintensität und die Zell- oder Organellendichte; ii) als genetisch kodierte Sonde kann sie auf Organellen oder bestimmte subzelluläre Kompartimente wie präsynaptische Terminals oder postsynaptische dendritische Stacheln ausgerichtet werden; iii) die genetische Expression des Sensors macht eine Farbstoffbeladung überflüssig, die im Falle chemischer Farbstoffe für primäre Neuronen belastend sein kann; iv) Im Gegensatz zu allgemeinen redoxempfindlichen chemischen Farbstoffen ist Grx1-roGFP2 hochspezifisch für das Glutathion-Redoxpotential; v) Oxidation und Reduktion des Sensors reversibel sind, was die Messung transienter Redoxänderungen ermöglicht; (vi) Im Gegensatz zu chemischen Farbstoffen, die nur den Nachweis relativer Veränderungen ermöglichen, können Grx1-roGPF2-Fluoreszenzverhältnisse kalibriert werden, um absolute Redoxpotentiale in mV9 zu bestimmen.

Dieses Protokoll beschreibt dynamische Messungen des mitochondrialen Glutathion-Redoxpotentials in primären Neuronen. Die Analyse von Mitochondrien in intakten Zellen hat mehrere Vorteile15. Im Vergleich zur Untersuchung isolierter Mitochondrien behalten Mitochondrien innerhalb von Zellen physiologisch relevante Kontakte mit anderen Organellen (z. B. endoplasmatische Retikulum-Mitochondrien-Kontakte, Mitochondrien-Lysosom-Kontakte) bei und sind zellulären Konzentrationen von Signalmolekülen und Metaboliten ausgesetzt. Im Vergleich zur Untersuchung intakter Tiere bieten primäre Neuronen eine bessere Zugänglichkeit für genetische und pharmakologische Manipulationen und Mikroskopie. Für bestimmte Fragestellungen ist die Analyse isolierter Mitochondrien jedoch besser geeignet, da dies eine präzise Kontrolle über gelieferte Substrate und Inhibitoren ermöglicht. Insbesondere kann mito-Grx1-roGFP2 auch in isolierten Mitochondrien20 verwendet werden. Um neuronale Mitochondrien in intakten Geweben oder Tieren zu untersuchen, stehen transgene Fliegen- und Mauslinien zur Verfügung, die mito-Grx1-roGFP2 im Nervensystem exprimieren21,22,23. Insbesondere ist das Anregungsspektrum von roGFP2 für eine Zwei-Photonen-Anregung zugänglich, was eine Ex-vivo- und In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung in Gewebeexplantaten bzw. intakten Tieren ermöglicht23,24. Spektralvarianten von Thiol-Redox-sensitiven fluoreszierenden Proteinen sind ebenfalls verfügbar, wie z.B. gelbe rxYFP-Grx1p25 und rote Grx1-roCherry26. Diese bieten zusätzliche Flexibilität für das Multiplexing und ermöglichen prinzipiell die gleichzeitige Messung von Redox-Reaktionen in verschiedenen Zelltypen oder Zellkompartimenten.

Wie im Protokoll beschrieben, kann das 405:488 nm-Verhältnis kalibriert werden, indem maximale und minimale Fluoreszenzverhältnisse nach der Anwendung von DA bzw. DTT gemessen werden. Diese Normalisierung ist nicht unbedingt erforderlich, da der Sensor aufgrund seiner ratiometrischen Natur einen gewissen Grad an inhärenter Normalisierung bietet. Wir empfehlen jedoch, nach jedem Imaging-Lauf eine Max/Min-Kalibrierung durchzuführen, hauptsächlich aus zwei Gründen. Erstens stellt es sicher, dass die Sensorreaktionen während des Experiments nicht gesättigt waren. Zweitens ist das absolute Verhältnis von 405:488 nm eine beliebige Zahl, die von den Mikroskopeinstellungen beider Kanäle abhängt. Selbst bei gleichen Einstellungen kann man nicht sicher sein, dass Laserleistung und Detektorleistung zwischen den Experimenten gleich bleiben, insbesondere wenn diese mehrere Wochen auseinander liegen. Eine Problemumgehung besteht darin, das durchschnittliche Basislinienverhältnis der Kontrollzellen innerhalb jedes Experiments auf 1,0 festzulegen. Dies ermöglicht eine relative Quantifizierung von behandlungsinduzierten Redoxstörungen in einem bestimmten Experiment, schränkt jedoch die Vergleichbarkeit verschiedener Experimente ein. Insbesondere beim Vergleich des basalen Redoxzustands von Zellen aus verschiedenen Experimenten oder Zelltypen ist es wichtig, eine maximal /min kalibrierte absolute Quantifizierung zu erhalten. Gelegentlich fällt das Verhältnis von 405:488 nm nach der DTT-Behandlung nicht unter das Ausgangsverhältnis, insbesondere wenn sich die Mitochondrien zu Studienbeginn bereits in einem relativ reduzierten Zustand befanden. Dies ist typischerweise ein Zeichen für eine Sensorbleiche während längerer Zeitrafferexperimente. Wiederholen Sie in diesem Fall das Experiment mit Mikroskopeinstellungen, die weniger Lichtexposition verursachen.

Es ist von größter Bedeutung, Mikroskopeinstellungen zu verwenden, die kein Bleichen des Sensors oder eine phototoxizitätsbedingte Oxidation der Mitochondrien verursachen. Stellen Sie sicher, dass Sie sich ausreichend Zeit für die Protokolloptimierung nehmen, bevor Sie mit den eigentlichen Experimenten beginnen. Sobald akzeptable Einstellungen definiert wurden, können sie in nachfolgenden Experimenten mit minimalen Anpassungen verwendet werden. die mito-Grx1-roGFP2 Bildgebung kann bei Raumtemperatur oder 35-37 °C auf einer beheizten Bühne durchgeführt werden. Der Sensor funktioniert in beiden Fällen; Die Kinetik von Signalkaskaden und Enzymreaktionen in den Zellen unterscheidet sich jedoch natürlich je nach Temperatur. Daher können Kinetik und Amplituden der Sensorreaktionen je nach gewählter Temperatur variieren. Die Wahl der Temperatur liegt beim Benutzer, abhängig von den spezifischen Anforderungen des Experiments.

Abschließend möchten wir auf zwei Einschränkungen des Sensors hinweisen. Erstens ist die Intensität des emittierten Lichts bei Anregung bei 405 nm deutlich geringer als bei Anregung bei 488 nm, was oft zu eher verrauschten 405 nm Bildern führt. Eine höhere Laserleistung ist erforderlich, um das Signal zum Rauschen im 405-nm-Kanal zu verbessern. Die Anregung bei 405 nm ist jedoch typischerweise phototoxischer und erzeugt mehr Autofluoreszenz als die Anregung bei 488 nm, was die zulässige Laserintensität von 405 nm begrenzt. Zum Beispiel verhinderte in dieser Studie eine schwache roGFP-Fluoreszenz in Kombination mit einer beträchtlichen 405 nm-angeregten Gewebeautofluoreszenz die Erfassung robuster Daten von mito-Grx1-roGFP2-exprimierenden Ganglienzellen in lebenden Netzhaut-Flatmounts (Depp und Bas-Orth, unveröffentlichte Beobachtung). Zweitens, obwohl das Verhältnis von 405:488 nm unempfindlich gegenüber pH-Änderungen in einem physiologischen Bereich um pH 5,5 bis pH 8,5 ist (Abbildung 4)9, kann das pH-abhängige Abschrecken der roGFP2-Emission dazu führen, dass das typischerweise schwache 405 nm-Signal unter die Nachweisgrenze des Mikroskops fällt, wodurch die Aufnahme quantifizierbarer Verhältnisbilder verhindert wird. Dies war beispielsweise bei einer NMDA-induzierten Azidose im neuronalen Zytosol der Fall13.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FÜR 2289: BA 3679/4-2). A.K. wird durch ein ERASMUS+ Stipendium unterstützt. Wir danken Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner und Andrea Schlicksupp für die Präparation primärer Neuronen. Wir danken Dr. Tobias Dick für die Bereitstellung von pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Die in Abbildung 4 gezeigten Experimente wurden am Nikon Imaging Center der Universität Heidelberg durchgeführt. Abbildung 2 wurde mit BioRender.com erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

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References

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Neuroscience Grx1-roGFP2 konfokale Mikroskopie oxidativer Stress Hippocampus-Neuronen Exzitotoxizität mitochondriales Membranpotential
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Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

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