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Neuroscience

Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/63073
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

Summary

Questo articolo descrive un protocollo per determinare le differenze nello stato redox basale e le risposte redox alle perturbazioni acute nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale utilizzando la microscopia confocale dal vivo. Il protocollo può essere applicato ad altri tipi di cellule e microscopi con modifiche minime.

Abstract

L'omeostasi redox mitocondriale è importante per la vitalità e la funzione neuronale. Sebbene i mitocondri contengano diversi sistemi redox, il glutatione tampone redox tiolo-disolfuro altamente abbondante è considerato un attore centrale nelle difese antiossidanti. Pertanto, la misurazione del potenziale redox del glutatione mitocondriale fornisce informazioni utili sullo stato redox mitocondriale e sullo stress ossidativo. La glutaredossina1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) è un indicatore raziometrico basato su proteine fluorescenti verdi (GFP) geneticamente codificate del potenziale redox del glutatione che ha due picchi di eccitazione sensibili allo stato redox a 400 nm e 490 nm con un singolo picco di emissione a 510 nm. Questo articolo descrive come eseguire la microscopia confocale dal vivo di Grx1-roGFP2 mirato ai mitocondri nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale. Descrive come valutare il potenziale redox del glutatione mitocondriale allo stato stazionario (ad esempio, per confrontare stati patologici o trattamenti a lungo termine) e come misurare i cambiamenti redox sui trattamenti acuti (usando il farmaco eccitotossico N-metil-D-aspartato (NMDA) come esempio). Inoltre, l'articolo presenta la co-imaging di Grx1-roGFP2 e l'indicatore del potenziale di membrana mitocondriale, tetrametilrodramina, estere etilico (TMRE), per dimostrare come Grx1-roGPF2 può essere multiplexato con indicatori aggiuntivi per analisi multiparametriche. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come (i) ottimizzare le impostazioni del microscopio a scansione laser confocale, (ii) applicare farmaci per la stimolazione seguiti dalla calibrazione del sensore con diammide e ditiotreitolo e (iii) analizzare i dati con ImageJ / FIJI.

Introduction

Diversi importanti enzimi mitocondriali e molecole di segnalazione sono soggetti alla regolazione redox del tiolo1. Inoltre, i mitocondri sono una delle principali fonti cellulari di specie reattive dell'ossigeno e sono selettivamente vulnerabili al danno ossidativo2. Di conseguenza, il potenziale redox mitocondriale influenza direttamente la bioenergetica, la segnalazione cellulare, la funzione mitocondriale e, infine, la vitalità cellulare3,4. La matrice mitocondriale contiene elevate quantità (1-15 mM) del glutatione tampone redox tiolo-disolfuro (GSH) per mantenere l'omeostasi redox e montare difese antiossidanti5,6. Il GSH può essere attaccato covalentemente alle proteine bersaglio (S-glutationilazione) per controllarne lo stato redox e l'attività ed è utilizzato da una serie di enzimi disintossicanti che riducono le proteine ossidate. Pertanto, il potenziale redox del glutatione mitocondriale è un parametro altamente informativo quando si studia la funzione mitocondriale e la fisiopatologia.

roGFP2 è una variante della GFP che è stata resa redox-sensibile dall'aggiunta di due ciste esposte in superficie che formano una coppia artificiale ditiolo-disolfuro7,8. Ha un singolo picco di emissione a ~ 510 nm e due picchi di eccitazione a ~ 400 nm e 490 nm. È importante sottolineare che le ampiezze relative dei due picchi di eccitazione dipendono dallo stato redox di roGFP2 (Figura 1), rendendo questa proteina un sensore raziometrico. Nel sensore Grx1-roGFP2, la glutaredossina-1 umana (Grx1) è stata fusa al N-terminus di roGFP29,10. L'attacco covalente dell'enzima Grx1 a roGFP2 offre due importanti miglioramenti del sensore: rende la risposta del sensore specifica per la coppia GSH/GSSG glutatione redox (Figura 1) e accelera l'equilibrio tra GSSG e roGFP2 di un fattore di almeno 100.0009. Pertanto, Grx1-roGFP2 consente l'imaging specifico e dinamico del potenziale redox del glutatione cellulare.

L'imaging Grx1-roGFP2 può essere eseguito su una vasta gamma di microscopi, tra cui microscopi a fluorescenza a campo largo, microscopi confocali a disco rotante e microscopi confocali a scansione laser. L'espressione del sensore nei neuroni primari può essere ottenuta con vari metodi che includono la lipofezione11, la coprecipitazione DNA/calcio-fosfato12, il trasferimento genico mediato da virus o l'uso di animali transgenici come fonte cellulare (Figura 2). Per gli esperimenti in questo articolo sono stati utilizzati virus adeno-associati ricombinanti pseudotipizzati (rAAV) contenenti un rapporto 1:1 delle proteine del capside AAV1 e AAV2 13,14. Con questo vettore, l'espressione massima del sensore viene in genere raggiunta 4-5 giorni dopo l'infezione e rimane stabile per almeno due settimane. Abbiamo utilizzato con successo Grx1-roGFP2 nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale di topi e ratti.

In questo articolo, l'espressione mediata da rAAV di Grx1-roGFP2 mirato ai mitocondri nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale del ratto viene utilizzata per valutare lo stato redox del glutatione mitocondriale basale e la sua perturbazione acuta. Viene fornito un protocollo per l'imaging confocale dal vivo con istruzioni dettagliate su come (i) ottimizzare le impostazioni del microscopio confocale a scansione laser, (ii) eseguire un esperimento di imaging dal vivo e (iii) analizzare i dati con FIJI.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali erano conformi alle linee guida nazionali e istituzionali, compresa la direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo del Consiglio, e avevano la piena approvazione etica del Ministero degli Interni (Ufficio per il benessere degli animali dell'Università di Heidelberg e Regierungspraesidium Karlsruhe, licenze T14/21 e T13/21). I neuroni primari dell'ippocampo e corticale sono stati preparati da cuccioli di topo o ratto appena nati secondo procedure standard e sono stati mantenuti per 12-14 giorni come descritto in precedenza13.

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Soluzioni stock per il buffer di imaging
    1. Preparare ogni soluzione madre secondo la Tabella 1 e mantenerla a 4 °C. Per la conservazione a lungo termine (>3 mesi), mantenere le aliquote a -20 °C.
Componente MW Concentrazione (M) Importo (g) Volume (mL)
NaCl 58.44 5 14.61 50
Kcl 74.55 3 1.12 5
MgCl2· 6H2O 203.3 1.9 2 5
CaCl2·2H2O 147.01 1 1.47 10
Glicina 75.07 0.1 0.375 50
Saccarosio 342.3 1.5 25.67 50
Piruvato di sodio 110.04 0.1 0.55 50
HEPES · 238.3 1 11.9 50
Glucosio 180.15 2.5 45 100

Tabella 1: Soluzioni stock per il buffer di imaging.

  1. Soluzioni stock di farmaci e coloranti
    1. Sciogliere la diammide (DA; utilizzata per la calibrazione del rapporto massimo 405:488) in acqua per ottenere una soluzione madre da 0,5 M (ad esempio, 1 g in 11,615 mL di acqua). Aliquota e conservare a -20 °C.
    2. Sciogliere il ditiotreitolo (DTT; utilizzato per la calibrazione del rapporto minimo 405:488) in acqua per ottenere una soluzione madre da 1 M (ad esempio, 5 g in 32.425 ml di acqua). Aliquota e conservare a -20 °C per un massimo di 3 mesi.
    3. Sciogliere N-metil-D-aspartato (NMDA; usato per indurre eccitotossicità e ossidazione mitocondriale) in acqua per ottenere una soluzione madre da 10 mM (ad esempio, 25 mg in 16.991 mL di acqua). Conservare le aliquote a -20 °C. Per la conservazione a lungo termine (>6 mesi), mantenere le aliquote a -80 °C.
    4. Tetrametilrodramina estere etilico perclorato (TMRE; un indicatore a piccola molecola del potenziale di membrana mitocondriale)
      1. Sciogliere la polvere TMRE in metanolo per ottenere una scorta di 20 mM (ad esempio, 25 mg in 2.427 ml di metanolo).
      2. Diluire lo stock di 20 mM 1:1.000 in metanolo per ottenere uno stock da 20 μM.
      3. Aliquotare le soluzioni stock da 20 mM e 20 μM, sigillare con parafilm e conservare al riparo dalla luce a -20 °C.
        NOTA: Entrambe le soluzioni stock sono stabili per diversi anni. Utilizzare la soluzione madre 1.000x (20 μM) per gli esperimenti.
  2. Buffer di imaging
    1. Preparare 100 mL di tampone di imaging aggiungendo tutti i componenti dalla Tabella 2 a 80 mL di acqua sterile in un cilindro di misurazione. Portare il volume fino a 100 ml con acqua sterile. Mescolare agitando accuratamente il cilindro di misurazione fino a quando la soluzione appare omogenea.
      NOTA: si consiglia di utilizzare un osmometro per verificare l'osmolarità del buffer. Dovrebbe essere il più vicino possibile al mezzo di crescita delle cellule. Qui, questo è 315 mOsmol / L. Aumentare o diminuire la concentrazione di saccarosio secondo necessità per abbinare l'osmolarità del tampone di imaging e del mezzo di crescita.
    2. Regolare il pH a 7,4. Fare aliquote e tenerle a 4 °C per un massimo di due settimane. Per la conservazione a lungo termine, mantenere le aliquote a -20 °C. Lasciare che il buffer di imaging raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso.
Componente Soluzione madre (M) Concentrazione finale (mM) Volume (mL)
NaCl 5 114 2.3
Kcl 3 5.29 0.176
MgCl2 1.9 1 0.053
CaCl2 · 1 2 0.2
Glicina 0.1 0.005 0.005
Saccarosio 1.5 52 3.5
Piruvato di sodio 0.1 0.5 0.5
HEPES · 1 10 1
Glucosio 2.5 5 0.2

Tabella 2: Composizione del buffer di imaging. I volumi indicati vengono utilizzati per la preparazione di 100 mL di tampone di imaging.

  1. Soluzioni per la stimolazione e la calibrazione
    NOTA: Preparare sempre nuove soluzioni di stimolazione aggiungendo soluzioni di riserva di farmaci indicati al tampone di imaging appena prima dell'esperimento. Le soluzioni per la stimolazione e la calibrazione saranno aggiunte alla camera di imaging in sequenza durante un esperimento (vedere paragrafi 3-5). A seconda del tipo di esperimento, sono necessarie soluzioni diverse per raggiungere la stessa concentrazione finale nel rispettivo volume finale nella camera di imaging.
    1. Preparare 3x soluzione NMDA (90 μM; concentrazione finale nella camera: 30 μM) aggiungendo 63 μL di uno stock NMDA da 10 mM a 6.937 mL di tampone di imaging. Aggiungere 500 μL della soluzione risultante alla camera (volume finale: 1,5 ml).
    2. Preparare 2x soluzione DA per le fasi 3 e 4 (1 mM; concentrazione finale nella camera: 0,5 mM) aggiungendo 14 μL di uno stock DA da 0,5 M a 6,986 mL di buffer di imaging. Aggiungere 1 mL alla camera (volume finale: 2 mL).
    3. Preparare 4x soluzione DA per la fase 5 (2 mM; concentrazione finale nella camera: 0,5 mM) aggiungendo 28 μL di uno stock DA da 0,5 M a 6,972 mL di buffer di imaging. Aggiungere 500 μL alla camera (volume finale: 2 mL).
    4. Preparare 1 soluzione DTT (5 mM; concentrazione finale nella camera: 5 mM) aggiungendo 45 μL di 1 M di stock DTT a 8955 μL di tampone di imaging. Aggiungere 1 mL di questa soluzione alla camera dopo aver aspirato il tampone di imaging (volume finale: 1 mL).

2. Caricamento delle celle con TMRE

NOTA: In questo protocollo, TMRE viene utilizzato in modalità non quench15 ad una concentrazione finale di 20 nM. In generale, deve essere utilizzata la concentrazione più bassa possibile di TMRE che fornisce ancora un'intensità del segnale sufficiente sul microscopio di scelta. A causa dell'evaporazione irregolare, il volume del mezzo in diversi pozzi può differire nelle colture primarie a lungo termine. Per garantire una concentrazione costante di TMRE in tutti i pozzetti, non aggiungere TMRE direttamente ai pozzetti. Invece, sostituire il mezzo in ogni pozzetto con la stessa quantità di mezzo contenente TMRE. Il protocollo seguente è progettato per i neuroni primari in piastre a 24 pozzetti contenenti ~ 1 mL di mezzo per pozzetto.

  1. Lavorando in una cappa a flusso laminare per colture tissutali, raccogliere 500 μL di terreno da ciascun pozzo in un singolo tubo conico.
  2. Per pozzetto, aggiungere 0,5 μL di 20 μM TMRE stock nel tubo conico (ad esempio, 12 μL per 24 pozzetti).
  3. Aspirare accuratamente il mezzo rimanente dal primo pozzo e sostituirlo con 500 μL di mezzo contenente TMRE. Continuate, bene per bene, con i restanti pozzi.
    NOTA: Fare attenzione a non lasciare asciugare le cellule e a non disturbare le cellule.
  4. Riportare le cellule all'incubatrice e attendere almeno 60 minuti per l'equilibrio del colorante.
    NOTA: il tempo di caricamento può essere esteso a diverse ore senza effetti negativi.
  5. Per garantire concentrazioni TMRE coerenti ed equilibrio durante l'esperimento di imaging, assicurarsi di includere una concentrazione finale di 20 nM TMRE nel tampone di imaging e in tutte le soluzioni di stimolazione.

3. Ottimizzazione delle impostazioni del microscopio confocale a scansione

NOTA: questo passaggio mira a trovare il miglior compromesso tra qualità dell'immagine e vitalità cellulare durante l'imaging dal vivo. In questa sezione viene descritta l'ottimizzazione delle impostazioni per l'imaging roGFP. Se viene eseguita l'imaging multiparametrico, è necessario eseguire un'ottimizzazione simile, incluso il controllo di una linea di base stabile senza segni di sbiancamento o fototossicità, per gli indicatori aggiuntivi.

  1. Avviare il microscopio confocale e caricare le impostazioni standard per l'imaging GFP (eccitazione a 488 nm, emissione 505 - 550 nm).
  2. Impostare il rilevatore su 12 bit o 16 bit.
    NOTA: di solito, 8 bit non sono sufficienti per l'imaging quantitativo.
  3. Attivare la modalità di scansione sequenziale e aggiungere la seconda sequenza/traccia (eccitazione 405 nm, emissione 505 - 550 nm).
  4. Per entrambi i canali, selezionare una tabella di ricerca pseudocolore che indichi i pixel sovraesposti e sottoesposti (ad esempio, GLOW OU).
  5. Selezionare un obiettivo adatto all'oggetto di interesse.
    NOTA: 10x-40x sono adatti per l'analisi a singola cellula, 63x-100x sono adatti per l'analisi a mitocondrio singolo.
  6. Montare un coverslip con le cellule nella camera di imaging, aggiungere 1 mL di buffer di imaging e posizionare la camera sul microscopio.
  7. Utilizzare l'oculare e la luce trasmessa per mettere a fuoco le cellule.
    NOTA: non utilizzare la luce di epifluorescenza per localizzare e mettere a fuoco le cellule. Anche a bassa potenza, questo influenzerà negativamente le cellule.
  8. Registra immagini con diversi formati di pixel. Sulla base di queste immagini, selezionare il numero di pixel più basso che fornisce una risoluzione accettabile della struttura di interesse.
    NOTA: in genere, 512 x 512 pixel funzionano bene per l'imaging a cella singola con obiettivi 20x e 40x e 1024 x 1024 o 2048 x2048 pixel in genere funzionano bene per l'imaging a mitocondrio singolo con un obiettivo 63x.
  9. Registra immagini con fori stenopeici diversi. Sulla base di queste immagini, selezionare la dimensione del foro stenopeico più grande che fornisce una risoluzione accettabile della struttura di interesse.
    NOTA: in genere, 3-7 unità ariose funzionano bene.
  10. Registra immagini con diverse intensità laser.
    1. Regolare di conseguenza il guadagno e la soglia del rilevatore. Sulla base di queste immagini, selezionare l'intensità laser più bassa che fornisce un'intensità del segnale accettabile e un rapporto segnale-sfondo.
      1. Per determinare il rapporto segnale-sfondo, misurare l'intensità del segnale in una regione di interesse (ROI) che contiene cellule o mitocondri (ROI1) e in un ROI senza cellule o mitocondri (ROI2). Quindi, dividi l'intensità del ROI1 per l'intensità del ROI2.
        NOTA: Mirare a un rapporto segnale-sfondo di >3 e intensità del segnale dei singoli ROI di 200-1.000 per eccitazione a 405 nm con potenza laser dell'1-3% e intensità dei singoli ROI di 300-1.500 per eccitazione a 488 nm con potenza laser dell'1%.
  11. Registra immagini con diverse velocità di scansione e numero di medie dei fotogrammi. Registra 4-5 immagini per ogni combinazione di impostazioni. In base a queste serie di immagini, selezionare la velocità più alta e le impostazioni medie più basse che forniscano un rumore dell'immagine accettabile e una variabilità da immagine a immagine.
    NOTA: una velocità di scansione di 600 Hz e 1-2 fotogrammi per la media funzionano bene nella maggior parte dei casi.
  12. Utilizzando un nuovo coverslip, registra una serie time-lapse con le impostazioni ottimizzate.
    NOTA: la durata e l'intervallo di immagine della serie devono essere simili a quelli degli esperimenti pianificati.
  13. Alla fine della serie time-lapse, aggiungere 1 mL di soluzione 2x DA alla camera di registrazione. Immagine per ulteriori 2 min.
  14. Aspirare il buffer di imaging utilizzando una pompa peristaltica o una pipetta portatile. Aggiungere 1 mL di 1 soluzione DTT. Immagine per ulteriori 5 min.
  15. Analizzare l'esperimento time-lapse (vedere la sezione 5).
    1. Verificare che nessuno dei due canali venga sovra o sottoesposto durante il trattamento DA e DTT con le impostazioni ottimizzate.
    2. Assicurarsi che nessuno dei due canali mostri un notevole sbiancamento durante la registrazione time-lapse; mirare a <2% di perdita di intensità tra la prima e l'ultima immagine.
    3. Verificare che il rapporto 405:488 non cambi considerevolmente durante l'imaging.
  16. Ripetere l'intera procedura in modo iterativo, utilizzando diversi coverslip, fino a quando non sono state definite impostazioni che forniscono costantemente risultati accettabili.

4. Valutazione dello stato redox basale

  1. Avviare il microscopio e caricare le impostazioni ottimizzate dalla sezione 3.
  2. Imposta la media dei fotogrammi su 3-5.
  3. Montare un coverslip con le cellule nella camera di imaging, aggiungere 1 mL di buffer di imaging e posizionare la camera sul microscopio.
  4. Utilizzare l'oculare e la luce trasmessa per mettere a fuoco le cellule.
    NOTA: non utilizzare la luce di epifluorescenza per localizzare e mettere a fuoco le cellule. Anche a bassa potenza, questo influenzerà negativamente le cellule.
  5. Passare alla modalità di scansione e utilizzare il canale a 488 nm in live view per mettere a fuoco e individuare le celle per l'imaging.
  6. Utilizzare la funzione multipunto per selezionare 3-5 campi visivi sulla copertina.
  7. Registrare un'immagine di base.
  8. Aggiungere 1 mL di 2x soluzione DA alla camera.
  9. Dopo 1, 2 e 3 minuti, utilizzare la vista dal vivo per confermare/regolare la messa a fuoco e quindi registrare un'immagine.
    NOTA: le cellule sono in genere completamente ossidate dopo 2 minuti.
  10. Sostituire il buffer nella camera di imaging con 1 mL di 1 soluzione DTT.
  11. Dopo 3 e 5 minuti, utilizzare la vista dal vivo per confermare / regolare la messa a fuoco e quindi registrare un'immagine.
    NOTA: le celle sono in genere completamente ridotte dopo 4-5 minuti.

5. Imaging dal vivo di trattamenti acuti

NOTA: Il protocollo seguente descrive l'imaging della risposta redox mitocondriale al trattamento con NMDA. Gli intervalli di immagine e la durata dell'esperimento potrebbero dover essere regolati per altri trattamenti.

  1. Avviare il microscopio e caricare le impostazioni ottimizzate dalla sezione 3.
  2. Impostare l'intervallo di time-lapse su 30 s e la durata su 25 min.
  3. Montare un coverslip con le cellule nella camera di imaging, aggiungere 1 mL di buffer di imaging e posizionare la camera sul microscopio.
    NOTA: per evitare la deriva della messa a fuoco termica, lasciare le cellule sullo stadio del microscopio per 10-15 minuti prima di iniziare l'imaging time-lapse.
  4. Utilizzare l'oculare e la luce trasmessa per mettere a fuoco le cellule.
    NOTA: non utilizzare la luce di epifluorescenza per localizzare e mettere a fuoco le cellule. Anche a bassa potenza, questo influenzerà negativamente le cellule.
  5. Passare alla modalità di scansione e utilizzare il canale a 488 nm in live view per mettere a fuoco e individuare le celle per l'imaging.
  6. Facoltativo: per aumentare il numero di celle registrate per esecuzione, utilizzare la funzione multipunto per visualizzare 2-3 campi di visualizzazione per copertina.
  7. Avvia l'acquisizione time-lapse e registra 5 immagini come registrazione di base di 2 minuti.
  8. Aggiungere 500 μL di 3x soluzione NMDA alla camera (concentrazione finale 30 μM) e registrare ulteriori 20 immagini come risposta NMDA di 10 minuti.
    NOTA: I neuroni sono molto sensibili ai cambiamenti nell'osmolarità. Pertanto, assicurarsi di ridurre al minimo l'evaporazione del buffer di imaging. Per trattamenti più lunghi, la camera di imaging deve essere coperta con un coperchio.
  9. Aggiungere 500 μL di soluzione 4x DA alla camera e registrare altre 6 immagini (calibrazione massima di 3 minuti).
  10. Aspirare il buffer dalla camera di imaging e sostituirlo con 1 mL di 1 soluzione DTT. Registra altre 10 immagini (calibrazione minima di 5 minuti).
  11. Terminare la registrazione e salvare la serie di immagini.

6. Analisi dei dati

  1. Importazione di dati e pre-elaborazione di immagini in FIJI
    1. Utilizzare Bio-Formats Importer per aprire un gruppo di immagini dal passaggio 4 o un file di immagine dal passaggio 5. Clicca su Plugin | Bio-Formati | Importatore di bioformati. Nella finestra di dialogo, utilizzare Visualizza stack con: Hyperstack, impostare Modalità colore: predefinita, selezionare Ridimensiona automaticamente e non dividere in finestre separate.
      NOTA: la scalabilità automatica ottimizza la visualizzazione dei dati sullo schermo del computer. Non modifica l'intensità dei pixel.
    2. Se sono state aperte singole immagini del passaggio 4, fare clic su Immagine | Stack | Strumenti | Concatena per unirli in una pila di immagini singole.
    3. Se c'è XY-drift durante la serie di immagini, fai clic su Plugin | StackReg per registrare le immagini. Nella finestra di dialogo, selezionate Corpo rigido (Rigid Body ) o Traslazione (Translation).
    4. Cambia il formato dell'immagine a 32 bit facendo clic su Immagine | Tipo | 32 bit.
    5. Dividi i canali di colore in finestre separate facendo clic su Immagine | | colore Canali divisi.
    6. Selezionare il canale 1 (405 nm) e regolare la soglia per selezionare i mitocondri da analizzare facendo clic su Immagine | Regolare | Soglia. Nella finestra di dialogo, selezionate Predefinito, Rosso, Sfondo scuro e Istogramma impila e attendete che i pixel selezionati appaiano rossi. Fare clic su Applica. Selezionare Imposta pixel di sfondo su NaN ed Elabora tutte le immagini.
      NOTA: per evitare potenziali distorsioni dell'osservatore, è necessario utilizzare la determinazione automatica della soglia. FIJI offre diversi metodi automatizzati (come Default, Huang, Intermodes, Otsu) che possono essere selezionati da un menu a discesa nella finestra di dialogo soglia. In genere, il metodo Default fornisce un buon risultato. Si consiglia di confrontare diversi metodi durante la prima analisi per trovare il miglior metodo di soglia per il set di immagini specificato. Una volta scelto un metodo, deve essere applicato a tutte le immagini.
    7. Ripetere il passaggio 6.1.6 per il canale 2 (488 nm).
    8. Creare un'immagine del rapporto per visualizzare il rapporto 405:488 nm facendo clic su Elabora | Calcolatore di immagini. Nella finestra di dialogo, selezionare Immagine 1: canale 1, Operazione: Dividi, Immagine 2: canale 2, Crea nuova finestra, Elabora tutte le immagini.
    9. Modificare la tabella di ricerca dell'immagine del rapporto con lo pseudocolore. Ad esempio, per passare a Fire, fai clic su Immagine | | delle tabelle di ricerca Fuoco.
  2. Analisi delle immagini
    1. Nell'immagine del rapporto, disegna ROI attorno a singole cellule o mitocondri. Dopo aver disegnato ogni ROI, aggiungilo al ROI Manager. Analizza | Strumenti | ROI Manager | Aggiungi. (scorciatoia da tastiera: 'T') Seleziona Mostra tutto.
      NOTA: poiché i pixel di sfondo sono stati impostati su 'not a number' (NaN) nei passaggi 6.1.6 e 6.1.7, non influiranno sul risultato della misurazione. Pertanto, è accettabile includere alcuni pixel di sfondo nel ROI.
    2. Misura i rapporti 405:488 delle singole celle facendo clic su ROI Manager | ctrl+A per selezionare tutti i ROI | Per saperne di più | Multi misura. Nella finestra di dialogo, selezionate Misura tutte le sezioni e Una riga per sezione.
    3. Esporta le misurazioni in un software per fogli di calcolo.
    4. Selezionare l'immagine a 405 nm. Misurare le intensità di tutti i ROI come nel passaggio 6.2.2. utilizzando i ROI memorizzati nel ROI manager.
    5. Esporta le misurazioni in un software per fogli di calcolo.
    6. Selezionare l'immagine a 488 nm. Misurare le intensità di tutti i ROI come nel passaggio 6.2.2. utilizzando i ROI memorizzati nel ROI manager.
    7. Esporta le misurazioni in un software per fogli di calcolo.
    8. Salva i ROI per riferimento futuro facendo clic su ROI Manager | ctrl + A per selezionare tutti i ROI | Per saperne di più | Salva.
    9. Consigliato: Genera grafici di intensità rispetto a quelli temporali delle tracce da 405 e 488 nm. Verificare che non vi sia uno sbiancamento marcato in nessuno dei canali (l'intensità del segnale alla fine della serie di immagini deve essere ≥98% della prima immagine) e che le due tracce si muovano in direzioni opposte durante le risposte del sensore (ad esempio, la traccia di 405 nm dovrebbe aumentare durante l'ossidazione mentre la traccia di 488 nm dovrebbe diminuire).
  3. Normalizzazione dei dati
    1. Per ogni ROI dall'immagine del rapporto, determinare il valore massimo durante il trattamento DA (Rmax) e il valore minimo durante il trattamento DTT (Rmin).
    2. Calcola il rapporto normalizzato come segue:
      Equation 1
      NOTA: questo imposterà il rapporto massimo a 1,0 e il rapporto minimo a 0.
  4. Analisi della morfologia mitocondriale
    1. Per ottenere misurazioni della morfologia mitocondriale in parallelo alle intensità roGFP nel passaggio 6.2.6, andare su Analizza | Impostate Misure e selezionate Descrittori forma e Adatta ellisse.
      NOTA: Oltre all'intensità media, le misurazioni nella finestra dei risultati includeranno la lunghezza dell'asse maggiore (Maggiore), la lunghezza dell'asse minore (Minore), le proporzioni (AR; asse maggiore diviso per asse minore; i mitocondri rotondi hanno un AR ~ 1, i mitocondri allungati hanno un AR maggiore), nonché le misure di circolarità (Circ.) e rotondità (Round).

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Representative Results

Quantificazione delle differenze nello stato redox mitocondriale allo stato stazionario dopo la sospensione del fattore di crescita
Per dimostrare la quantificazione delle differenze allo stato stazionario nello stato redox mitocondriale, i neuroni primari cresciuti in mezzo standard sono stati confrontati con i neuroni coltivati senza fattori di crescita per 48 ore prima dell'imaging. L'astinenza del fattore di crescita provoca la morte delle cellule neuronali apoptotiche dopo 72 h16. Le cellule sono state fotografate dopo 48 ore per verificare se questo è preceduto da cambiamenti nello stato redox mitocondriale. I neuroni corticali primari di ratto cresciuti su coverslip rivestiti di poli-L-ornitina sono stati infettati da rAAV-mito-Grx1-roGFP2 nei giorni in vitro 6 (DIV6) e sono stati ripresi su DIV12. L'imaging dal vivo è stato eseguito a temperatura ambiente secondo la sezione 4 di questo protocollo su un microscopio confocale a scansione laser invertita dotato di un obiettivo di immersione in acqua 40x / 1.10. Le impostazioni confocali erano unità ariose foro stenopeico 7, dimensione dei pixel 568,7 nm (512 x 512 pixel), velocità di scansione 600 Hz, potenza laser 405 nm 3%, potenza laser 488 nm 1%, larghezza di banda di emissione 505-550 nm e media fotogramma 4. Non c'era una grande differenza tra i rapporti grezzi di 405:488 nm delle due condizioni (Figura 3B). Dopo la normalizzazione dei dati, un sottoinsieme di cellule con un rapporto aumentato di 405:488 nm è stato rilevabile nel gruppo di astinenza del fattore di crescita (Figura 3C). Ciò indica che i cambiamenti redox mitocondriali potrebbero precedere la morte delle cellule neuronali e sottolinea la rilevanza della normalizzazione dei dati max / min per il confronto degli stati redox basali tra i gruppi.

Cambiamenti dinamici nello stato redox mitocondriale dopo il trattamento dei neuroni con NMDA
Il recettore del glutammato di tipo NMDA (NMDAR) svolge un ruolo centrale nella plasticità neuronale, ma può anche mediare il danno neuronale e la morte cellulare. L'attivazione patologica del NMDAR porta a diversi effetti avversi sui mitocondri che includono il sovraccarico di calcio della matrice, l'ossidazione e la frammentazione mitocondriale e la transizione della permeabilità mitocondriale. In uno studio precedente, il protocollo sopra descritto è stato utilizzato per studiare una relazione causale tra il sovraccarico di calcio mitocondriale indotto da NMDA e l'ossidazione mitocondriale13. I neuroni primari dell'ippocampo di ratto cresciuti su coverslip rivestiti di poli-D-lisina / laminina sono stati infettati da rAAV-mito-Grx1-roGFP2 su DIV4 e ripresi su DIV12. L'imaging dal vivo è stato eseguito a 37 °C su un microscopio confocale a disco rotante invertito dotato di un obiettivo multi-immersione 20x/0,75 (è stata utilizzata l'immersione in acqua) e di un sistema di incubazione sul palco. Mito-Grx1-roGFP2 è stato eccitato sequenzialmente ogni 20 s utilizzando le linee laser a 405 nm e 488 nm e l'emissione è stata raccolta con un filtro di emissione a 527/55 nm per entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione. Il trattamento dei neuroni con 30 μM NMDA ha causato l'ossidazione dei mitocondri in pochi minuti (Figura 4A,B). In particolare, l'acidosi mitocondriale indotta da NMDA ha causato un significativo spegnimento della fluorescenza roGFP2, in linea con la sua ben nota sensibilità al pH8. Per confermare che questa tempra pH-dipendente non ha influenzato il rapporto 405:4889, i mitocondri sono stati completamente ossidati da DA prima dell'aggiunta di NMDA in un esperimento di controllo. Il pretrattamento con DA preclude qualsiasi ulteriore ossidazione dei mitocondri da parte di NMDA e, di conseguenza, il rapporto 405:488 non è cambiato in questo esperimento nonostante un notevole tempra dell'intensità di fluorescenza roGFP2 (Figura 4C).

Analisi multiparametrica dei cambiamenti indotti da NMDA dei mitocondri dendritici
Per valutare la sequenza temporale dei cambiamenti indotti da NMDA nella morfologia mitocondriale, nel potenziale di membrana e nello stato redox, è stata eseguita l'imaging parallelo della fluorescenza TMRE- e mito-Grx1-roGFP2 ad alta risoluzione spaziale e temporale. I neuroni corticali primari di ratto cresciuti su coverslip rivestiti di poli-L-ornitina sono stati infettati da rAAV-mito-Grx1-roGFP2 su DIV6 e ripresi su DIV12. L'imaging dal vivo è stato eseguito a temperatura ambiente su un microscopio a scansione laser confocale invertito utilizzando un obiettivo di immersione in olio 63x / 1,40, una velocità di scansione di 600 Hz, una dimensione dei pixel di 90,2 nm (1024 x 1024 pixel con zoom di scansione 2x), una dimensione stenopeica di 3 unità ariose e una media del fotogramma di 2. Ogni 30 s, tre immagini sono state registrate in modalità sequenziale: eccitazione 405 nm/emissione 505-550 nm; Eccitazione 488 nm/emissione 505-550 nm; Eccitazione 552 nm/emissione 560-600 nm. Il trattamento dei neuroni con NMDA 60 μM ha comportato una perdita del segnale TMRE e un aumento del rapporto roGFP 405:488 nm, seguito da un arrotondamento ritardato dei mitocondri (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica della funzione Grx1-roGFP2 e degli spettri di eccitazione roGFP2. (A) Lo stress ossidativo e l'azione dei sistemi di difesa antiossidante ossidano il pool cellulare di glutatione. Grx1 nella proteina di fusione Grx1-roGPF2 favorisce il rapido equilibrio dello stato redox roGFP2 con lo stato redox del pool glutatione. Lo stato redox del pool roGFP2 può essere valutato monitorando il rapporto di emissione di GFP-fluorescenza a 510 nm dopo l'eccitazione a 405 nm e 488 nm. Le specie ridotte sono mostrate in blu; le specie ossidate sono mostrate in rosso. (B) Spettri di eccitazione di roGFP2 completamente ridotta (blu) e ossidata (rossa). Dopo l'ossidazione di roGFP2, l'emissione di fluorescenza a 400 nm di eccitazione aumenta, mentre l'emissione a 490 nm di eccitazione diminuisce. Questa cifra è stata modificata rispetto a una precedente pubblicazione13. Gli spettri di eccitazione in B sono stati disegnati sulla base della Figura 1B di 8. Le linee tratteggiate in B indicano le lunghezze d'onda delle linee laser comunemente usate a 405 nm e 488 nm. Abbreviazioni: GSH = glutatione; GSSG = glutatione ossidato; Grx = glutaredossina; roGFP = variante proteica fluorescente verde redox-sensibile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Flusso di lavoro del metodo. L'espressione della proteina fluorescente redoGFP2 sensibile al redox 88 nei neuroni può essere ottenuta attraverso diversi metodi che includono trasfezione, lipofezione, trasferimento genico virale e animali transgenici. Il sensore può essere utilizzato per studiare lo stato redox neuronale in neuroni primari in coltura, espianti di tessuto ex vivo e animali intatti. L'imaging roGFP2 può essere eseguito su una varietà di microscopi che includono microscopi fluorescenti a campo largo, microscopi confocali e microscopi a 2 fotoni. L'analisi dei dati di imaging roGFP2 può essere eseguita con il software disponibile gratuitamente ImageJ/FIJI. Abbreviazione: roGFP = variante proteica fluorescente verde sensibile al redox. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'astinenza dal fattore di crescita provoca l'ossidazione dei mitocondri neuronali. (A) Immagini rappresentative del rapporto 405:488 nm di neuroni coltivati in presenza (+ GF) o assenza (- GF) di fattori di crescita per 48 ore prima dell'imaging. Le scale codificate per colore rappresentano rapporti 405:488 nm non normalizzati (rapporti più bassi corrispondono a uno stato ridotto; rapporti più alti corrispondono a uno stato ossidato). Barre di scala = 50 μm. (B) Quantificazione del rapporto 405:488 nm nei singoli neuroni. (C) Rapporto max/min calibrato 405:488 nm dei singoli neuroni. I simboli rotondi rappresentano celle singole; bar rappresenta la media. N = 40-44 cellule da 3 coverslips da una preparazione. Abbreviazione: GF = fattore di crescita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Ossidazione indotta da NMDA dei mitocondri neuronali. (A) Immagini rappresentative del rapporto 405:488 nm prima e dopo il trattamento con NMDA da 30 μM e dopo la calibrazione max/min con DA e DTT. A questo ingrandimento, il segnale roGFP viene rilevato principalmente nel soma e nei dendriti prossimali. La scala codificata per colore rappresenta rapporti 405:488 nm non normalizzati (rapporti più bassi corrispondono a uno stato ridotto; rapporti più alti corrispondono a uno stato ossidato). Barre di scala = 50 μm. (B) Quantificazione della corsa di imaging mostrata in A. NMDA induce un'ossidazione mitocondriale rapida e sostenuta che può essere calibrata utilizzando DA e DTT. (C) L'acidosi mitocondriale indotta da NMDA provoca una caduta della fluorescenza GFP sia a 405 nm che a 488 nm (pannello superiore). Per isolare l'effetto guidato dal pH e confermare che il rapporto 405:488 nm è insensibile al pH, i neuroni sono stati prima ossidati al massimo usando DA e successivamente sfidati con NMDA in presenza di DA (pannello inferiore). In queste condizioni, NMDA provoca ancora acidosi mitocondriale ma nessuna ulteriore ossidazione mitocondriale. Di conseguenza, sebbene sia la traccia a 405 nm che quella a 488 nm mostrino un calo dell'intensità di fluorescenza guidato dal pH, il rapporto 405:488 nm rimane stabile. Questa cifra è modificata da 13. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; roGFP = variante proteica fluorescente verde redox-sensibile; NMDA = N-metil-D-aspartato; DA = diammide; DTT = ditiotreitolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Cambiamenti indotti da NMDA nel potenziale di membrana, nello stato redox e nella morfologia dei mitocondri dendritici. (A) Tre immagini ad alto ingrandimento da un esperimento time-lapse, acquisite a t = 1, 4 e 9 min, che mostrano mitocondri dendritici e assonali. La colorazione rappresenta l'intensità TMRE (vedere barra di calibrazione). (B) Immagini con rapporto roGFP 405:488 nm dallo stesso esperimento time-lapse di (A) a t = 1, 4 e 9 min. Si noti che a causa della limitata efficienza dell'infezione da AAV, solo un sottogruppo di neuroni esprime mito-Grx1-roGFP2 e, pertanto, non tutti i mitocondri TMRE-positivi sono roGFP-positivi. La barra di calibrazione codificata per colore rappresenta rapporti 405:488 nm non normalizzati (rapporti più bassi corrispondono a uno stato ridotto; rapporti più alti corrispondono a uno stato ossidato). (C) Quantificazione dell'intensità TMRE, del rapporto roGFP 405:488 nm e della rotondità di un singolo mitocondrio (indicato dalle frecce in A, B). Dopo 1 minuto di registrazione al basale, 60 μM NMDA è stato aggiunto alla soluzione da bagno. Barre di scala = 5 μm. L'asse y in C raffigura il rapporto roGFP 405:488 nm rispetto al T0 di base (linea tratteggiata verde), l'intensità di fluorescenza TMRE rispetto alla linea di base T0 (linea tratteggiata rossa) e il descrittore di forma FIJI/ImageJ "rotondità" (linea continua nera). Abbreviazioni: GFP = roGFP = variante proteica fluorescente verde redox-sensibile; mito-Grx1-roGFP2 = Glutaredossina-1 fusa a N-terminus di roGFP; AAV = virus adeno-associato; TMRE = tetrametilrodonamina, estere etilico; NMDA = N-metil-D-aspartato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le misurazioni quantitative e dinamiche dello stato redox mitocondriale forniscono importanti informazioni sulla fisiologia mitocondriale e cellulare. Sono disponibili diverse sonde chimiche fluorogeniche che rilevano specie reattive dell'ossigeno, "stress redox" o "stress ossidativo". Tuttavia, questi ultimi termini non sono ben definiti e spesso mancano di specificità9,17,18. Rispetto ai coloranti chimici, Grx1-roGFP2 offre diversi vantaggi9,19: (i) come sensore cinematico di eccitazione, fornisce una normalizzazione intrinseca per il livello di espressione del sensore, l'intensità assoluta della fluorescenza e la densità cellulare o organello; ii) come sonda geneticamente codificata, può essere mirata a organelli o compartimenti subcellulari specifici come terminali presinaptici o spine dendritiche postsinaptiche; (iii) l'espressione genetica del sensore evita la necessità di carico del colorante, che nel caso dei coloranti chimici può essere stressante per i neuroni primari; iv) a differenza dei coloranti chimici generalmente sensibili al redox, Grx1-roGFP2 è altamente specifico per il potenziale redox del glutatione; v) l'ossidazione e la riduzione del sensore sono reversibili, consentendo la misurazione di cambiamenti redox transitori; vi) a differenza dei coloranti chimici che consentono di rilevare solo cambiamenti relativi, i rapporti di fluorescenza Grx1-roGPF2 possono essere calibrati per determinare i potenziali redox assoluti in mV9.

Questo protocollo descrive le misurazioni dinamiche del potenziale redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari. L'analisi dei mitocondri all'interno di cellule intatte presenta diversi vantaggi15. Rispetto allo studio dei mitocondri isolati, i mitocondri all'interno delle cellule mantengono contatti fisiologicamente rilevanti con altri organelli (ad esempio, contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici, contatti mitocondri-lisosomi) e sono esposti a concentrazioni cellulari di molecole e metaboliti di segnalazione. Rispetto allo studio di animali intatti, i neuroni primari forniscono una migliore accessibilità per le manipolazioni genetiche e farmacologiche e la microscopia. Tuttavia, per alcune domande, l'analisi dei mitocondri isolati sarà più adatta in quanto ciò consente un controllo preciso su substrati e inibitori consegnati. In particolare, mito-Grx1-roGFP2 può essere utilizzato anche in mitocondri isolati20. Per studiare i mitocondri neuronali all'interno di tessuti o animali intatti, sono disponibili linee transgeniche di mosche e topi che esprimono mito-Grx1-roGFP2 nel sistema nervoso21,22,23. In particolare, lo spettro di eccitazione di roGFP2 è suscettibile di eccitazione a due fotoni, consentendo l'imaging ex vivo e in vivo a due fotoni in espianti di tessuti e animali intatti, rispettivamente23,24. Sono disponibili anche varianti spettrali di proteine fluorescenti sensibili al tiolo redox come il giallo rxYFP-Grx1p25 e il rosso Grx1-roCherry26. Questi forniscono ulteriore flessibilità per il multiplexing e, in linea di principio, consentono la misurazione simultanea delle risposte redox in diversi tipi di cellule o compartimenti cellulari.

Come descritto nel protocollo, il rapporto 405:488 nm può essere calibrato misurando i rapporti di fluorescenza massima e minima dopo l'applicazione di DA e DTT, rispettivamente. Questa normalizzazione non è essenziale perché il sensore fornisce un certo grado di normalizzazione intrinseca a causa della sua natura raziometrica. Tuttavia, si consiglia di eseguire la calibrazione max/min dopo ogni esecuzione di imaging, principalmente per due motivi. In primo luogo, assicura che le risposte del sensore non siano state saturate durante l'esperimento. In secondo luogo, il rapporto assoluto 405:488 nm è un numero arbitrario che dipende dalle impostazioni del microscopio di entrambi i canali. Anche quando si mantengono le stesse impostazioni, non si può essere sicuri che la potenza del laser e le prestazioni del rilevatore rimarranno le stesse tra gli esperimenti, specialmente quando questi sono a diverse settimane di distanza. Una soluzione potrebbe essere quella di impostare il rapporto basale medio delle celle di controllo a 1,0 all'interno di ciascun esperimento. Ciò consente la quantificazione relativa delle perturbazioni redox indotte dal trattamento in un dato esperimento, ma limita la comparabilità di diversi esperimenti. Soprattutto quando si confronta lo stato redox basale di cellule di diversi esperimenti o tipi di cellule, è importante ottenere una quantificazione assoluta calibrata max/min. Occasionalmente, il rapporto 405:488 nm non scende al di sotto del rapporto basale dopo il trattamento con DTT, specialmente se i mitocondri erano già in uno stato relativamente ridotto al basale. Questo in genere è un segno di sbiancamento del sensore durante esperimenti prolungati di time-lapse. In questo caso, ripetere l'esperimento con le impostazioni del microscopio che causano una minore esposizione alla luce.

È fondamentale utilizzare le impostazioni del microscopio che non causino lo sbiancamento del sensore o l'ossidazione dei mitocondri indotta dalla fototossicità. Assicurati di dedicare tempo sufficiente all'ottimizzazione del protocollo prima di iniziare gli esperimenti effettivi. Una volta definite le impostazioni accettabili, possono essere utilizzate in esperimenti successivi con regolazioni minime. L'imaging mito-Grx1-roGFP2 può essere eseguito a temperatura ambiente o 35-37 °C su uno stadio riscaldato. Il sensore funzionerà in entrambi i casi; tuttavia, la cinetica delle cascate di segnalazione e delle reazioni enzimatiche all'interno delle cellule differirà naturalmente in base alla temperatura. Pertanto, la cinetica e le ampiezze delle risposte del sensore possono variare a seconda della temperatura scelta. La scelta della temperatura spetta all'utente, a seconda delle esigenze specifiche dell'esperimento.

Infine, vorremmo sottolineare due limitazioni del sensore. In primo luogo, l'intensità della luce emessa è considerevolmente inferiore con l'eccitazione a 405 nm rispetto all'eccitazione a 488 nm, spesso con conseguenti immagini a 405 nm piuttosto rumorose. È necessaria una maggiore potenza laser per migliorare il segnale al rumore nel canale a 405 nm. Tuttavia, l'eccitazione a 405 nm è in genere più fototossica e genera più autofluorescenza rispetto all'eccitazione a 488 nm, limitando l'intensità laser ammissibile di 405 nm. Ad esempio, in questo studio, la debole fluorescenza roGFP combinata con una considerevole autofluorescenza tissutale eccitata a 405 nm ha impedito l'acquisizione di dati robusti da cellule gangliari che esprimono mito-Grx1-roGFP2 in supporti piatti di retina vivi (Depp e Bas-Orth, osservazione non pubblicata). In secondo luogo, sebbene il rapporto 405:488 nm sia insensibile alle variazioni di pH all'interno di un intervallo fisiologico compreso tra pH 5,5 e pH 8,5 (Figura 4)9, l'estinzione dipendente dal pH dell'emissione di roGFP2 può far scendere il segnale tipicamente debole di 405 nm al di sotto del limite di rilevamento del microscopio, impedendo l'acquisizione di immagini di rapporto quantificabili. Ad esempio, questo è stato il caso durante l'acidosi indotta da NMDA nel citosol neuronale13.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; PER 2289: BA 3679/4-2). A.K. è supportato da una borsa di studio ERASMUS+. Ringraziamo Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner e Andrea Schlicksupp per la preparazione dei neuroni primari. Ringraziamo il Dr. Tobias Dick per aver fornito pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Gli esperimenti mostrati nella Figura 4 sono stati eseguiti presso il Nikon Imaging Center, Università di Heidelberg. La figura 2 è stata preparata con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

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References

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Neuroscienze Numero 176 Grx1-roGFP2 microscopia confocale stress ossidativo neuroni ippocampali eccitotossicità potenziale di membrana mitocondriale
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Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

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